マウス脳切片におけるアミロイドβ負荷の完全領域対小領域定量化
2022年5月19日
本プロトコールは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドβ負荷を定量するために、矢状マウス脳切片の全領域またはサブ領域の関心分析を実行する手順を記載および比較する。
このプロトコルは、APP/PS1トランスジェニックマウスからの脳切片における関心の全切片および関心部分のサブ領域におけるアミロイドβプラーク負荷を比較する。この特定のプロトコルで提示された方法および結果は、読者または研究者が、マウス脳セクションにおけるベータ負荷を決定するために、関心領域全体またはサブ関心領域分析のいずれかを選択することを可能にする。まず、画像解析ソフトウェアをダウンロードします。
インストール時に、ソフトウェアを起動してファイルをクリックし、分析するイメージを開いて選択します。ソフトウェアツールバーから直線ツールを選択し、スケールバーの長さに沿って直線を描きます。分析をクリックし、設定されたスケールタブをクリックします。
ここでも、分析をクリックしてからタブを測定し、スケールバーの長さまたは距離をピクセル単位でメモします。ポップアップウィンドウで、距離をピクセル単位で入力し、スケールバーの既知の距離を入力し、長さの単位をマイクロメートルとして入力します。次に、グローバル ボックスをオンにして、複数の画像が処理されている場合、新しい縮尺設定を後続のすべての画像に適用します。
「OK」をクリックして設定を適用します。目的の測定値を断面の面積に設定するには、分析に進み、測定値を設定し、面積を選択してラベルボックスを表示します。分析する画像が [リダイレクト先] タブで選択されていることを確認します。
海馬や皮質の視覚化を容易にするために、画像に移動し、明るさまたはコントラストを調整します。最大スライドバーを徐々に左にドラッグして、関心のある脳領域またはROIが識別可能になるまで、組織の明瞭さを高めます。ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使用して、海馬領域の輪郭を描きます。
領域が輪郭を描いたら、明るさまたはコントラスト設定のリセットオプションをクリックして、元の明るさに戻ります。選択した領域の総組織面積を測定するには、編集をクリックして外側をクリアします。選択した領域が画面上の唯一の画像になったら、分析をクリックしてからタブを測定し、ポップアップウィンドウで分析された組織領域の合計を取得します。
次に、データを Excel ファイルに保存します。6-E10 の染色された陽性領域を測定するには、画像、調整、および色のしきい値タブを順番に表示します。しきい値設定方法の下で事前に作られたフィルタは、最も強い信号を赤で強調表示する望ましい結果を提供します。
適切なしきい値を選択した後、暗い背景をチェックして、黒い背景のアミロイドベータスポットを強調表示します。選択をクリックしてから、オリジナルをクリックし、もう一度選択して、白い背景にアミロイドベータ堆積物の暗い信号を与えます。ポップアップウィンドウが生成されたら、[パーティクルの解析と解析]タブをクリックし、[OK]をクリックします。ソフトウェアによって生成された要約出力を、編集ボタンとコピーボタンをクリックしてコピーします。
次に、以前に開始したExcelファイルにそれぞれのラベルを付けて貼り付けます。式を使用してパーセント6E−10陽性面積を計算する 画像解析ソフトウェアをダウンロードした後、先に実証したように、脳ROIが識別可能になるまでステップを実行する。次に、長方形のツールを使用して、皮質または海馬のROIを選択します。
ツールバーで、[編集]をクリックし、高さと幅を定義済みの値に変更するタブを選択して指定します。箱が組織によって完全に覆われるように箱を調整します。明るさまたはコントラストを元の明るさにリセットします。
選択したROIを複製するには、ボックスを右クリックし、複製をクリックします。選択した地域を含む新しいウィンドウが開きます。複製されたイメージの名前を変更して、そのイメージが配置されている領域を表示します。
ツールバーを使用して画像をクリックして複製画像タイプを調整し、8ビットキーを入力して複製されたRGB画像を8ビットに変換し、プラークを最適に分析します。編集をクリックして画像を反転し、反転します。6E-10ポジ領域を測定するには、画像に移動し、調整してしきい値を設定します。
しきい値指定法の下で事前定義されたフィルタは、所望の結果を提供し、最も強い信号を赤色で強調表示する。適切なしきい値を選択したら、適用を押します。6E-10 の正の領域を解析するには、ツールバーを使用して [パーティクルの解析と解析] タブをクリックし、[集計結果] がオンになっていることを確認します。
編集タブとコピータブをクリックして、パーセント領域を含む要約出力をコピーします。次に、サマリー出力を、以前に開始した Excel ファイルにそれぞれのラベルを付けて貼り付けます。組織内の異なる領域についてこの手順を繰り返し、ROIを輪郭を描くための各ボックスの配置が各画像間で一貫していることを確認する。
この代表的な評価では、皮質および海馬脳組織における6E−10陽性領域を定量化するために、完全およびサブROI分析方法が比較される。完全なROI分析には、ROI全体の概要が含まれます。対照的に、サブROI分析は、ROI内の事前定義された領域を選択することを含む。
完全およびサブROI 6E−10正面積定量のための段階的な手順を、サブROI定量のためのROI回転と共に、ここに示します。ここでは、完全ROI分析とサブROI分析の相関関係を示します。皮質および海馬のサブROI分析を行う2人の読者によって報告された6E−10陽性領域の間に有意な正の相関が観察された。
また、平均化されたサブROI 6E−10陽性領域は、完全ROIを用いて得られた領域と強く有意な正の相関を共有した。サブROI解析における完全による平均6E-10陽性領域については、皮質と海馬に有意差は認められなかった。Elizaによる全脳ホモジネートと可溶型アミロイドβ1-42測定との間に有意な相関が観察され、研究からの完全なROI分析閾値選択が正確なデータ定量を得る上で重要である。
選択したフィルターで陽性の汚れが正確に選択されるようにするには、ユーザーの介入が必要です。アミロイドβ定量とは別に、この方法は他の蛍光免疫染色に使用することができる。例えば、Iba-1は、ミクログリア陽性面積定量から。
概要
このプロトコルは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドベータ負荷を定量化するために、マウス脳の矢状切片の全領域および部分領域分析の詳細な比較を提供します。これにより、研究者はベータ負荷を評価するための方法を選択できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- アルツハイマー病研究
- 画像解析技術
背景
- アミロイドベータプラークの蓄積はアルツハイマー病の特徴です。
- APP/PS1マウスモデルは、この状態を研究するために一般的に使用されています。
- プラーク定量化の方法論を理解することは研究にとって重要です。
- このプロトコルはアルツハイマー研究のアプローチを標準化することに貢献します。
研究目的
- アミロイドベータ定量化における全領域分析と部分領域分析の有効性を比較すること。
- 研究者が再現できる段階的な手順を提供すること。
- 2つの分析アプローチ間の相関関係と違いを解明すること。
使用方法
- 画像解析ソフトウェアを使用してアミロイドベータ負荷を定量化します。
- APP/PS1トランスジェニックマウスの脳切片で分析を行います。
- 手順には、面積分析の測定設定と正確な閾値設定用のフィルターの適用が含まれます。
- 複数の画像をグローバルスケーリング設定を適用して処理できます。
主要な結果
- 比較分析により、全領域分析と部分領域分析の間に強い正の相関が明らかになりました。
- 2つの方法間でアミロイドベータ面積の定量化に有意な違いは観察されませんでした。
- 閾値の選択が正確な定量化結果に重要であることが証明されました。
- 結果はアミロイドベータ以外の他の蛍光免疫染色の定量化にも適用可能であることを示しています。
結論
- この研究により、研究者はアミロイドベータ定量化に適した方法を選択できます。
- 正確な閾値設定と測定技術の重要性を強調しています。
- 得られた洞察はアルツハイマー病の病理学と関連する神経メカニズムの理解を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of amyloid-beta plaque load in transgenic mouse brain sections is critical for target validation and mechanistic de-risking in Alzheimer's disease research. This protocol enables standardized comparison of full-region versus sub-region quantification, supporting predictive confidence in preclinical model selection and assay development. Reliable measurement of amyloid-beta burden informs early discovery decisions and portfolio triage for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of amyloid-beta pathology in disease-relevant mouse models.
- Supports functional target validation by quantifying plaque burden across brain regions.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating full and sub-regional quantification outputs.
- Improves predictive confidence for advancing Alzheimer's disease targets.
Screening & Assay Development
- Standardizes image analysis workflows for reproducible quantification of immunostained brain sections.
- Provides quantitative outputs suitable for assay benchmarking and cross-study comparisons.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Supports scalability and platform reuse for other fluorescent immuno-stains.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantification methods with translational biomarker strategies in Alzheimer's models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by correlating ELISA and image-based readouts.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by providing reliable plaque load metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This quantification protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neurodegenerative disease research, supporting both early hypothesis testing and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise amyloid-beta measurement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs and correlation analyses to compare full and sub-regional measurements.
- Translational Research: Connects image-based quantification with biochemical assays for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other immuno-stains and neurodegenerative targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in Alzheimer's disease models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of plaque quantification workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing reliable target engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and immunostaining interpretation.
- Depends on access to validated image analysis software and quantitative data infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of region-of-interest selection and thresholding parameters.
- Adaptable to various brain regions and fluorescent markers with consistent methodology.
- Accuracy is contingent on user intervention for threshold selection and region delineation.
