Name: ヒト歯からオルガノイドを機構研究・再生医療への強力なツールとして確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶヒト歯由来オルガノイド培養法。歯上皮幹細胞の増殖とエナメル質形成メカニズムを解明し、再生医療や疾患治療標的発見への応用を可能にする革新的ツールです。

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UZ Leuvenの口腔および顎顔面外科(MKA)のすべてのスタッフと患者、新しく抽出された第3大臼歯の収集における貴重な支援に感謝しています。また、ラインヒルデ・ジェイコブス博士とエリザベス・ティスケンス博士のサンプル収集に協力してくれたことにも感謝します。この研究は、ルーヴェン大学(BOF)とFWO-フランダース(G061819N)からの助成金によって支援されました。L.H.はFWO博士研究員(1S84718N)です。

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</ol>

対応する著者は、すべての著者がすべての利益相反を開示したことを保証します。

このプロトコルは、ヒトの歯から始まるオルガノイドの効率的かつ再現性のある生成を記述する。我々の知る限り、これはヒトの歯科組織から始まる現在の概念(上皮)オルガノイドを確立するための最初の方法論である。オルガノイドは長期拡張可能であり、歯の上皮ステムネス表現型を示し、DF7のERMコンパートメントで以前に報告されたDESCを複製する。さらに、オルガノイドは、アメロブラスト分化プロセスの展開を含む機能的なDESC/ERM特性を複製する7,25,26。独立した患者オルガノイド系統19で同等の結果が見出されたので、所見は頑健である。
この歯のオルガノイドプロトコルを実行する際には、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。第1に、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632を初期播種時および各継代直後に...

歯は、食物咀嚼、スピーチ、心理的幸福(自己イメージ)に不可欠な役割を担っています。人間の歯は、さまざまな密度と硬度1の高度に石灰化された組織で構成されています。歯冠の主成分である歯科用エナメル質は、人体で最も高い石灰化組織です。エナメル質形成(アメロジェネシス)の間、歯が発達すると、歯科上皮幹細胞(DESC)はエナメル質形成細胞(アメロブラスト)に分化する。一度形成されると、エナメル質は、歯の噴火の開始時にアメロブラストのアポトーシス損失のためにめったに修復または更新されない1。損傷したエナメル質組織の修復は、外傷または細菌性疾患によって引き起こされるように、現在、合成材料を使用して達成されている。しかし、これらは、マイクロリーク、劣悪なオッセオインテグレーションとアンカー、有限寿命、および完全に機能する修復の欠如などの重要な欠点に悩まされています2。したがって、アメロブラストを生成する能力と石灰化組織を生成する可能性を備えたヒトDESCの堅牢で信頼性の高い培養は、歯科再生分野における大きな前進となるでしょう。
ヒトDESC表現型および生物学的機能に関する知識は乏しい3,4,5。興味深いことに、ヒト歯のDESCは、マラセスの上皮細胞レスト(ERM)に存在することが提案されているが、これは未発火の歯を囲む歯包(DF)内に存在し、歯が噴出すると歯根の周りの歯周靭帯に存在する1。歯髄と共培養したERM細胞は、アメロブラスト様細胞に分化し、エナメル質様組織を生成することが分かっている6。しかしながら、エナメル質(再)生成におけるERM細胞の特定の役割に関する深遠な研究は、信頼できる研究モデルの欠如のために制限されている7。現在のERMインビトロ培養システムは、8、9、10、11、12に標準的に使用されている2D条件における限られた寿命および表現型の迅速な喪失によって妨げられている。したがって、ヒトDESCを忠実に拡張、研究、および区別するための扱いやすいin vitroシステムが強く必要とされている。
過去10年間、上皮幹細胞をインビトロで増殖させる強力な技術は、いくつかのタイプの(ヒト)上皮組織に適用され、その生物学および疾患を研究することに成功している13、14、15、16。この技術により、組織上皮幹細胞は、細胞外マトリックス(ECM)を模倣した足場(典型的にはマトリゲル)に播種され、組織の幹細胞ニッチシグナル伝達および/または胚発生を複製する定義された培地で培養されると、3D細胞構造(すなわち、オルガノイド)に自己発達する。オルガノイド発生に必要な典型的な成長因子には、上皮成長因子(EGF)および翼なし型MMTV集積部位(WNT)活性化剤14、15、16が含まれる。得られたオルガノイドは、組織の元の上皮幹細胞を模倣する際の持続的な忠実度、ならびにそれらの表現型および機能的特性を保持しながら高い拡張性によって特徴付けられ、それによって診療所から取得されたしばしば制限された原発性ヒト組織の利用可能性を克服する。オルガノイドを樹立するために、培養前の異種組織(すなわち、間葉系細胞などの他の細胞型を含む)からの上皮幹細胞の単離は、間葉系細胞がECMに付着しない、またはECMで繁栄しないように必要ではなく、最終的に純粋に上皮オルガノイド13、16、17、18、19をもたらす.この有望で汎用性の高い技術は、様々なヒト上皮組織からの多様体オルガノイドモデルの開発につながった。しかし、歯の発達、再生、および疾患の深い研究に貴重なヒト歯由来オルガノイドは、まだ確立されていませんでした20,21。我々は最近、青年期患者19から抽出した第3大臼歯(親知らず)からのDF組織を起点としたこのような新しいオルガノイドモデルの開発に成功した。
ここで、我々は、成体ヒト歯から(すなわち、第3大臼歯のDFから)上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコールを記載する(図1A)。得られたオルガノイドは、ERM関連ステムネスマーカーを発現しながら、長期的に拡張可能である。興味深いことに、他のほとんどのオルガノイドモデルとは対照的に、典型的に必要とされるEGFは、堅牢なオルガノイドの発生および成長のために冗長である。興味深いことに、ステムネスオルガノイドはアメロブラスト分化特性を示し、それによって インビボで起こるERM/DESCの特徴およびプロセスを模倣する。ここで説明する新しくユニークなオルガノイドモデルは、DESCの生物学、可塑性、分化能力を探求することを可能にし、歯の再生アプローチへの第一歩を踏み出すための扉を開きます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30120.086</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>48 ウェル平底プレート</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SML0788</tr><tr><td>アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>ウシ アルブミン (細胞培養グレード)</td><td>Serva</td><td>47330.03</td><td></td></tr><tr><td>AMELX 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365284</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Gibco</td><td>15200018</td><td></td></tr><tr><td>B27 (ビタミンAなし)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>カセット</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ肝臓由来の7202191カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>CD44抗体</td><td>Abcam</td><td>ab34485</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー、40 & micro;m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>CK14 抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>VWR</td><td>6310146</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1:1 F12 Without Fe</td><td>Invitrogen</td><td>074-90715A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 粉末 高グルコース</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663 - 10ML</td><td></td></tr><tr><td>埋め込みワークステーション、220 〜 240 Vac</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対、&ge;99.8% (EtOH)</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (= basic FGF)</td><td>R&D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-25</td><td></td></tr><tr><td>GenElute 哺乳類全 RNA Miniprep キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RTN350-1KT</td><td>溶解バッファーに溶解した 1% &β;-メルカプトエタノールを含む</td></tr><tr><td>ガラス パスツール ピペット</td><td>ニコ メカニズム</td><td>170-40050</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>VWR</td><td>101194M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1 PeproTech</td><td></td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632 (ROCK阻害剤, RI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6</td>抗体 <td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA012696</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル(成長因子低減、フェノールレッドフリー)</td><td>Corning</td><td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&nbsp;&mu;m</td><td>ミリポア</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>最小必須ミディアムイーグル (&alpha;MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG (Alexa 555) 二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>P63 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>パップペン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>マーキングペン</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA), 16%</td><td>Merck</td><td>8.18715</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン G ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペット(P20、P200、P1000)</td><td>エッペンドルフ他</td><td>2231300006</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックトランスファーピペット(3.5&nbsp;mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (Alexa 488) 二次抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>RSPO1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (p38i)</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel (surgical blade)</td><td>Swann-Morton</td><td>207</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>R&D Systems</td><td>464-SH-200</td><td></td></tr><tr><td>シリコーン型 (加熱ブロック)</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム (NaHCO3)</td><td>メルク</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>SOX2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92494</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Real-Time PCR System</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22 & micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 滅菌遠心分離管トップフィルターユニット, 0.22 &mu;m</td><td>ミリポア</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 1000 &mu;フィルター付きLピペットチップ</td><td>Greiner</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 20 &mu;フィルター付きLピペットチップ</td><td>Greiner</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 200 &mu;フィルター付き/フィルターなしのLピペットチップ</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 H2O</td><td>フレゼニウス</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III first-strand synthesis supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11752-050</td><td>逆転写キット</td></tr><tr><td>ティッシュプロセッサー</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12505356</tr><tr><td>Transferrin</td><td>Serva</td><td>36760.01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤+DAPI</td><td>Labconsult NV</td><td>H-1200</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>5036-WN-500</td><td></td></tr><tr><td>キシレン、99%、生化学および組織学用</td><td>VWR</td><td>2,89,75,325</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト歯からオルガノイドを機構研究・再生医療への強力なツールとして確立

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

歯は、食物の咀嚼やスピーチだけでなく、心理的幸福のためにも人生において非常に重要です。人間の歯の発達と生物学に関する知識は乏しい。特に、歯の上皮幹細胞とその機能についてはあまり知られていません。ヒトの歯組織(抜いた親知らずから単離された歯包)を起点とした新規オルガノイドモデルの開発に成功しました。オルガノイドは堅牢かつ長期的に拡張可能であり、マーカー発現および機能活性の点で提案されたヒト歯上皮幹細胞区画を再現する。特に、オルガノイドは、アメロジェネシス中に インビボで 起こるようなアメロブラスト分化過程を展開させることができる。このユニークなオルガノイドモデルは、ヒトの歯の発達だけでなく、歯の病態を研究するための強力なツールを提供し、歯の再生治療への道を開く可能性があります。この新しいオルガノイドモデルに基づいて失われた歯を生物学的歯に置き換えることは、合成材料の現在の標準的な移植に代わる魅力的な代替手段となる可能性があります。

歯のオルガノイド発生 我々は、親知らずの抜歯後に取得したヒトDF組織からオルガノイド培養を確立するための詳細なプロトコールを提供する(図1A)。単離されたDFは酵素的および機械的に解離する。得られた細胞は、最適なオルガノイドの発達および増殖について経験的に定義された培地(歯オルガノイド培地;トム)19。
オルガノイドは、典型的には、DF細胞播種後2週間以内に発達する(P0; 図2A)。オルガノイドは長期間拡張可能です(これまでに最大11通路)(図2B、P4で示す)。BMM液滴あたり約20,000個の細胞を(P0およびさらなる継代の両方で)播種すると、最適な密度のオルガノイドが得られますが(図2C)、細胞数を増やすと、増殖するスペースが不十分であるため、最適では...

我々は、ヒトの歯から出発して上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコルを提示する。オルガノイドは堅牢に拡張可能であり、アメロブラスト分化能を含む歯の上皮幹細胞を再現する。このユニークなオルガノイドモデルは、歯の再生アプローチの視点を持つヒト歯科(幹細胞)生物学を研究するための有望なツールを提供します。

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

この新しいヒト歯由来オルガノイドモデルは、歯の再生アプリケーションに向けた視点でヒト歯科幹細胞生物学を解読する最初の強力なツールを提供します。現在、この歯オルガノイドモデルは、ヒト歯上皮幹細胞を確実かつ強固に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールである。このオルガノイドプロトコルは、健康な歯だけでなく、歯科腫瘍や細菌の影響などの罹患した歯からの研究モデルを確立するためにも適用することができます。このような疾患モデルの探索により、新たな治療標的が明らかになる可能性がある。このオルガノイドモデルは、ヒト歯のエナメル質形成過程を解読するのに非常に役立ち、生成目的でエナメル質などの歯の部分を構築することを可能にする可能性がある。手順を実証するのは、私の研究グループの博士課程の学生であるLara Hemeryckです。まず、氷の上に置かれた収集媒体中の関連する歯の卵胞を有する第3の大臼歯を採取し、チューブの内容物をペトリ皿に移す。ピンセットで歯を持ち、手術用ブレードを使用して歯包を慎重に隔離します。歯包組織を70%エタノールの最初のウェルに20秒間短時間置き、次に次の死のエタノールプレートに20秒間移し、さらに第3のエタノールウェルに移すことによって、残りの血液を歯卵胞から洗い流す。リン酸緩衝生理食塩水ウェルで3回リンスし続け、続いて残りの3つの歯包収集培地ウェルで歯包を合計で最大20分間すすぎます。すすぎた歯の卵胞を新しいペトリ皿に移す。パラホルムアルデヒド固定のために歯包の1つの小片を切断し、500マイクロリットルの収集培地を含む微小遠心チューブに最大6時間保存する。残りの歯卵胞を小片に細かく刻み、4ミリリットルの予温解離培地を含む15ミリリットルのチューブに移し、チューブを摂氏37度で水浴中で2時間インキュベートする。15分毎に、歯卵胞解離培地をピペットし、ガラスピペットを用いて上下に混合し、組織崩壊をスピードアップした。歯の卵胞の破片が観察されなくなったら、狭く磨かれた火で磨かれたパスツールピペットを使用して解離を進めます。その間に、100マイクロリットルのDNaseを含む10ミリリットルの培地Aを準備し、解離した歯包を有する各チューブにこの培地を5ミリリットル加える。室温で1分間インキュベートする。このステップで1人の患者から解離した歯卵胞のいくつかのチューブを結合し、ろ過した細胞懸濁液を摂氏4度で10分間、200倍gで遠心分離する。上清を取り除きます。ペレットを1ミリリットルの無血清規定培地に再懸濁し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。自動細胞カウンターを使用して細胞濃度を計算し、播種できるウェルの数を計算します。最終混合物は、細胞懸濁液および基底膜マトリックスから30〜70の比率で構成される。適量の上清を除去し、それをゆっくりと再懸濁して、めっき用の細胞懸濁液に対する氷冷基底膜マトリックスの70対30の比率を得た。基底膜マトリックスに再懸濁したら、地下膜マトリックスの固化を避けるために微量遠心管を氷上に保持します。20マイクロリットルの基底膜マトリックス液滴を予熱した48穴培養プレートの中央にピペットで留める。プレートを裏返し、摂氏37度の1.9%二酸化炭素インキュベーターに20分間固めます。rho関連キナーゼ阻害剤およびアムホテリシンBを歯オルガノイド培地に加え、37°Cの水浴中で培地を予温する。インキュベーターから48ウェルプレートを取ります。それを直立させ、調製した予備加温培地の250マイクロリットルを細胞を含む基底膜マトリックス液滴と共に各ウェルに加え、プレートを二酸化炭素インキュベーターに戻す。ミディアムをリフレッシュするには、プレートを 45 度の角度で傾けます。基底膜マトリックス液滴に触れないようにしながら、前の培地を静かに取り除き、2〜3日ごとに250マイクロリットルの新しい予温歯オルガノイド培地を加える。オルガノイドの通過を行うには、オルガノイドを含むウェルから培地を除去し、最大4つのコンフルエントウェルをプールする。オルガノイドを採取するには、ウェルあたり400マイクロリットルの氷冷無血清規定培地を膜マトリックス液滴に直接加え、液滴全体が外れるまで培地を上下に繰り返しピペットします。ウェルがプールされている場合は、最初のウェルから次のウェルに400マイクロリットルを移して、液滴を含むオルガノイドを取り外します。外れたオルガノイドアセンブリを1.5マイクロリットルの微量遠心チューブに移し、すべてのオルガノイド構造がウェルから収集されるまで無血清の定義培地の添加を繰り返す。200回gで4°Cで5分間遠心分離します。遠沈管から上清を取り出し、ペレットをTrypLE Expressの予め温めたアリコートに再懸濁する。400マイクロリットルの氷冷無血清定義培地を加えて酵素を失活させ、摂氏4度で5分間、200倍gで遠心分離する。上清を取り除きます。氷冷無血清の定義培地で先端をプレコートし、オルガノイドペレットを滅菌状態で再懸濁する。低継代法用に定義された200マイクロリットルの氷冷無血清培地にペレットを再懸濁する。完全に空になったピペットチップをマイクロ遠心チューブの底に押し当てて直径を小さくします。ピペットを5分間上下させて、オルガノイドを機械的に破壊します。より高い継代法では、P1000チップを備えた700マイクロリットルの氷冷無血清定義培地にペレットを再懸濁する。このP1000チップにP200チップを追加し、氷冷無血清の定義培地でプレコートします。ピペットの音量設定を調整することで、気泡の発生を防ぎます。オルガノイドとピペットで中容量の少なくとも90%を5分間上下させ、オルガノイドを機械的に破壊します。オルガノイドは、典型的には、歯の卵胞細胞播種後2週間で発症する。オルガノイドは、11通路まで長期間拡張可能である。基底膜マトリックス液滴あたり約20,000個の細胞を播種すると、最適な密度のオルガノイドが得られるが、より高い細胞数を播種すると、成長するためのスペースが不十分であるため、高密度で同様のオルガノイドが最適ではないオルガノイドが増殖する。開発されたオルガノイドは、緻密な外観を示し、高い核細胞質比を示す細胞を含む。さらに、オルガノイドは、それらの上皮起源を確認するERMマーカーサイトケラチン14およびP63、CD44、およびインテグリンα−6などの他の提案されたERMマーカーを発現する。オルガノイドは、マウスにおいてよく知られているDESCマーカーであるSOX2を発現する。興味深いことに、エナメル質マトリックスの主成分であるアメロゲニンもオルガノイドで発現している。オルガノイドは、マーカーの安定した発現によって示されるように、継代中にERMMステム表現型を保持する。最適な長期オルガノイド増殖のためには、推奨継代法の意味または低継代法もしくは高継代法を使用することが不可欠である。一旦形成されると、オルガノイドは、アメロジェネシスプロセスをさらに精査するために使用することができ、そしてエナメル質マトリックス沈着は、現在歯科研究において達成されていない。この技術は、歯科上皮幹細胞生物学、エナメル質形成の過程、および正しい歯形成に不可欠な相互作用である歯間葉との相互作用の探求を可能にする。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

継続的に成長しているマウスの門歯は、歯科上皮幹細胞（DESCs）から歯の組織の更新を研究するためのモデルを提供します。一貫して確実切歯からこれらの細胞を取得し、in vitroでそれらを拡張するための堅牢なシステムをここで報告されている。...

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

このプロトコルでは、人間の歯小嚢から抽出された歯の幹細胞の一時的な遺伝子工学について説明します。適用の非ウイルス性変更戦略は治療幹細胞製品の改善のための基礎になることがあります。...

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。...

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

トロウェル型臓器培養法は、歯の発達を支配する複雑なシグナル伝達ネットワークを解明するために使用され、最近では、継続的に成長するマウス切歯の幹細胞に関与する調節を研究するために使用されています。蛍光レポーター動物モデルとライブイメージング法は、歯科幹細胞とその特定のニッチ微小環境の詳細な分析を容易にします。...

歯科幹細胞の制御を研究するためのトロウェル型臓器培養の使用

このプロトコルは、微小重力下でのアメロブラスト様細胞の培養と3D増殖を行い、細長い偏光形状とエナメル質特異的タンパク質発現を維持する方法を提示します。微小重力下での歯周工学コンストラクトや肺器官の培養のための培養条件についても記載する。...

微小重力下での歯科および呼吸器細胞および臓器の増殖

歯包は上皮集団および間葉細胞を含んでいる。上皮集団は、異なる培養培地を提供することにより異種の歯包細胞集団から選択した。上皮細胞は生き残り、無血清培地でコロニーを形成した。...

ヒト歯包からの上皮細胞の分離

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。...

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。...

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

学ぶヒト歯由来オルガノイド培養法。歯上皮幹細胞の増殖とエナメル質形成メカニズムを解明し、再生医療や疾患治療標的発見への応用を可能にする革新的ツールです。

ヒト歯からオルガノイドを機構研究・再生医療への強力なツールとして確立

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