Name: 光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶ光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の測定法。in vitroでアクチンミオシン相互作用を精密に解析し、細胞骨格ダイナミクスの理解を深めるモジュール式アッセイです。

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この研究の一部は、ミシシッピ大学大学院学生評議会研究フェローシップ(OA)、ミシシッピ大学サリーマクドネルバークスデールオナーズカレッジ(JCW、JER)、助成金番号NNX15AH78H(JCW、DNR)のミシシッピスペースグラントコンソーシアム、および助成金番号848586(DNR)のアメリカ心臓協会によってサポートされています。

著者は宣言する利益相反はありません。

アクチンフィラメントと相互作用するミオシンアンサンブルのダイナミクスを調べるために、蛍光イメージングと組み合わせた光ピンセットを使用した in vitro 研究が行われました。アクチン-ミオシン-アクチンバンドルは、筋ミオシンII、バンドルの下部とカバーガラス表面にローダミンアクチン、およびバンドルの上部に488標識されたビオチン化アクチンフィラメントを使用して組み立てられました。ウサギの筋肉由来のアクチンタンパク質を、一般的なアクチンバッファー(GAB)およびアクチン重合バッファー(APB)を使用して重合および安定化しました。GABおよびAPBは、ATP、FCバッファー、およびTCバッファーを使用して、ラボで毎日新たに調製する必要があります。筋肉ミオシンIIは、アクチン-ミオシン-アクチンサンドイッチを形成するために使用されました。ファロイジンは、アクチンフィラメントの蛍光染色、および in vitroでの安定化に使用されました。
ミオシン活性は、以前に公開されている46、<...

モータータンパク質は生命に不可欠であり、化学エネルギーを機械的仕事に変換します1,2,3。ミオシンモーターは、フィラメントに沿ってトラックのようなステップを踏むことによってアクチンフィラメントと相互作用し、アクチン-ミオシンネットワークのダイナミクスは、筋肉の収縮、細胞の運動性、細胞質分裂中の収縮リング、および細胞内の貨物の移動など、重要なタスクを実行します3,4,5,6,7,8 .ミオシンは非常に多くの重要な役割を担っているため、ミオシン-アクチンネットワークの機能が機能しなくなると、肥大型心筋症(HCM)で心臓の過収縮を引き起こすミオシン重鎖の変異などの疾患発症につながる可能性があります9,10,11,12,13,14。.筋収縮において、個々のミオシンモーターは、AF4、15、16、17、18の相対的なスライドを実行する必要な機械的エネルギーを提供するためにアンサンブルとして働くことによって互いに協力する。ミオシンモーターは、AF間にクロスブリッジを形成し、そのメカノケミカルサイクルによる立体配座変化を利用して、整列したフィラメント17、18、19、20、21の有刺鉄線の端に向かって集合的に移動する。
光学トラップなどの技術を用いたSMレベルでの定量的in vitro運動アッセイの開発により、SM力の発生とステップサイズの測定など、個々のミオシンモーターがどのように機能するかについての前例のない詳細を収集することが容易になりました22,23,24,25,26,27,28,29,30.Fineerらは、単一のミオシンIIモーターの力発生メカニズムを調べるために、「スリービーズ」または「ダンベル」光学トラップアッセイを開発しました23,31。筋ミオシンIIはチームでAFを収縮させるが、SMレベルでは非処理的であるため、光学トラップアッセイの向きは、古典的なモーター結合ビーズアプローチ32から再配置する必要がありました。ダンベルアッセイを形成するために、2つの光学トラップを使用して、カバーガラスに取り付けられたビーズに結合したミオシンモーター上にAFを保持し、トラップ23内のAFの動きによって単一のモーターによる力出力を測定した。
しかし、ミオシンIIを含む多くのモータータンパク質は単独で機能せず、しばしばそれらの部分の合計として機能しないため、SM力および単一モーター/単一フィラメントアッセイの向きを使用しても、システムレベルの力の生成に関する完全なイメージが得られません15,16,17,32,33,34,35,36 .ミオシンとアクチンフィラメントのネットワークの相乗効果をよりよく理解するには、複数のフィラメントと相互作用する複数のモーターを含むより複雑な構造が必要です15,32。ダンベルアッセイの配向は、ビーズに複数のミオシンを付着させるか、または表面に付着したミオシン太いフィラメントを使用して、モーターが懸濁AFと相互作用できるようにすることにより、小さなアンサンブル力の発生を調べるために利用されています4,23,34,37,38,39,40。
他の小さなアンサンブルアッセイには、ミオシンモーターがカバーガラス表面にコーティングされ、AFに結合したビーズを使用してモーターのチームによって生成された力をプローブするin vitroフィラメントグライディングアッセイが含まれます4,35,36,38,39,40,41,42,43.どちらの場合も、ミオシンは硬い表面(ビーズまたはカバーガラス)に結合し、1つのAFを利用します。これらの場合、モーターは自由に動くことも互いに通信することもできず、ミオシンをしっかりと束縛することは、モーターがサルコメア32で一緒に働くであろう準拠した階層的環境を反映していない。以前の研究では、ミオシンIIがその環境を感知し、力の発生やデューティ比などの特性を変更することにより、粘弾性またはモーター濃度条件の変化に応じて適応できることが示唆されています41,44,45。したがって、ミオシンIIアンサンブル力発生の機構的基盤のより現実的な絵を描くために、運動通信とシステムのコンプライアンスを促進およびキャプチャする光トラップアッセイを開発する必要があります。
ここでは、2本のアクチンフィラメント間で相互作用する複数のミオシンモーターからなるアクトミオシンバンドルまたはサンドイッチを形成することにより、in vitroで階層構造を光トラップと結合させる方法を開発しました。このモジュラーアッセイ形状は、分子的および環境的要因がアンサンブルミオシン力の生成にどのように影響するかを直接調査する機能を備えています。さらに、これらのアクチン-ミオシンアンサンブルを介した力発生メカニズムの調査は、筋肉収縮などの大規模な細胞タスクが分子レベルからどのように伝播するかをモデル化および理解するのに役立つ可能性があります9,10,13。

<table><tbody><tr><td>アクチンタンパク質(ビオチン):骨格筋</td><td>細胞骨格</td><td>AB07-A</td><td>ビオチン化アクチン</td></tr><tr><td>タンパク質 アクチンタンパク質、ウサギ骨格筋</td><td>細胞骨格</td><td>AKL99-A</td><td>アクチンタンパク質</td></tr><tr><td>アレクサフルーア488 ファロイジン</td><td>インビトゲン</td><td>A12379</td>アク<td>チン安定剤およびアレクサフルーア488</td></tr>染色 <tr><td>ATP</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP413-25</td><td>アクチンに必要アセンブリとミオシンの運動性</td></tr><tr><td>ベータ-D-グルコース</td><td>フィッシャー科学</td><td>MP218069110</td><td>蛍光イメージング中の光退色を減らすために使用される酸素捕捉システムの一部</td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロッカー(カゼイン)</td><td>バイオラド</td><td>1706404</td><td>非特異的結合</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td>科学<td>C79500</td><td>から表面をブロックするために使用されます塩化カルシウムは、アクチンミオシンネットワークのダイナミクスに必要な制御を提供します</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>フィッシャー科学</td><td>ICN10040280</td><td>蛍光イメージング中の光退色を低減するために使用される酸素捕捉システムの一部</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー科学</td><td>12544C</td><td>フローセルを作るために使用されます</td></tr><tr><td>DTT</td><td>フィッシャー科学</td><td>AC327190010</td><td>緩衝液調製に使用されます</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>A4094</td><td>カバースリップの洗浄に使用されるリージェント</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>フィッシャー科学</td><td>34-538-610KU</td><td>蛍光イメージング中の光退色を低減するために使用される酸素捕捉システムの一部</td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャー科学</td><td>P217-500</td><td>緩衝液調製に使用</td></tr><tr><td>KOH</td><td>フィッシャー科学</td><td>P250-1</td><td>カバースリップをエッチングし、調整するために使用されます緩衝液 pH</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>緩衝液調製に使用</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>フロー細胞を作るために使用</td></tr><tr><td>ミオシンIIタンパク質:ウサギ骨格筋</td><td>細胞骨格</td><td>MY02</td><td>ウサギ骨格筋から単離された全長ミオシンモータータンパク質</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>光トラッピング装置</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>カバースリップのガラス表面へのアクチンフィラメントの接着</td></tr><tr><td>ローダミン ファロイジン</td><td>サイトスケルトン</td><td>PHDR1</td><td>アクチン安定剤とローダミン蛍光染色</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンビーズ, 1 &mu;m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>光学トラッピングハンドル</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>バッファー調製に使用</td></tr></tbody></table>

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

ミオシンは、ATPを加水分解してアクチンフィラメント(AF)トラックに沿ってステップするモータータンパク質であり、運動性や筋肉収縮などの細胞プロセスに不可欠です。ミオシンIIは、その力発生機構を理解するために、1分子(SM)レベルと、光トラップなどの生物物理学的手法を用いた in vitro でのモーターチームとして研究されています。
これらの研究は、ミオシンの力発生挙動が、3ビーズ配置の単一分子レベルから、滑走配置の剛ビーズまたはカバーガラス表面上で一緒に動作するモーターのグループに移動すると大きく異なる可能性があることを示しました。ただし、これらのアッセイ構造では、細胞内のように粘弾性構造階層内のミオシンのグループダイナミクスを評価することはできません。我々は、光ピンセットを用いて、複数のアクチンフィラメントと相互作用するミオシンアンサンブルによる力発生のメカニズムを調べる方法を開発しました。
これらのアクトミオシンバンドルは、運動通信とアンサンブル力出力をキャプチャする階層的で準拠した環境での研究を容易にします。アッセイのカスタマイズ可能な性質により、実験条件を変更して、ミオシンアンサンブル、アクチンフィラメントバンドル、または周囲の環境への変更がどのようにして異なる力出力をもたらすかを理解することができます。

アクトミオシンバンドルシステムを含むフローセルは、顕微鏡スライドと両面粘着テープで作られたチャネルで区切られたエッチングされたカバーガラスで構成される標準設計です(図1)。次に、アッセイは、プロトコルに記載されている段階的な導入を使用してカバースリップから構築されます。最終的なアッセイは、テンプレートローダミン標識アクチンフィラメントで構成されています。所望のミオシン濃度( 図2 および 図3の代表的な結果には1μMを使用した)。ビオチン化、Alexa Fluor 488標識アクチンフィラメント;1μmのストレプトアビジンビーズ;酸素消去システム;ATP;および APB バッファを使用します。フローセルごとに複数のバンドルが形成され、上記のアクチン濃度はバンドル間に適切な間隔を与え、不要な相互作用がないことを保証します。これにより、フローセルごとに複数の力測定値を取得しやすくなり、データ収集効率が向上します。力プロファイルは、フローセル内およびフローセル間で再...

in vitroでのアクトミオシンバンドルの形成と光ピンセットを用いたミオシンアンサンブル力発生の測定について紹介し、議論します。

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

このプロトコルを使用してアクチンの挙動を調査することは、ユーザーが光学トラップの精度を使用してモータータンパク質アンサンブルダイナミクスを調査できるため、重要です。この技術の主な利点は、多くの光トラップ実験で使用される従来の単一モーター単一フィラメント配向とは対照的に、アクチン構造階層内のミオシン力学を測定できることです。このプロトコルのもう一つの利点は、ユーザーが選択した階層的な細胞骨格システムに合わせてアッセイをカスタマイズできるモジュラー性です。まず、顕微鏡スライドの中央に2枚の両面粘着テープを3〜4ミリメートル離して貼り付けます。次に、スライドの端からぶら下がっている余分なテープを引き裂くか切り取ります。次に、顕微鏡スライドの長軸に垂直なテープの上にPLLコーティングされたカバースリップを追加して、チャネルを形成します。小さなチューブを使用してカバースリップをテープと顕微鏡に圧縮し、テープが透明になるまで完全にスライドさせ、流路からの漏れの原因となる可能性があるため、テープに気泡がないことを確認します。15マイクロリットルの希釈ローダミンアクチンをPLLフローセルに加え、余分な溶液をフローセルに通しますが、流路が乾かないようにしてください。その後、湿度チャンバー内で10分間インキュベートします。次に、アクチン重合緩衝液中の1ミリリットル当たり1ミリグラムのカゼイン溶液を調製し、その後の成分の非特異的結合を防ぐために15マイクロリットルの溶液を加える。その後、湿度チャンバー内で5分間インキュベートします。その後、調製したビオチン化アクチンとビーズ懸濁液に希望濃度のミオシンを加え、ピペットチップで穏やかに攪拌します。次に、直ちに15マイクロリットルの懸濁液を所望のミオシン濃度と共にフローセルに加え、20分間インキュベートする。次に、フローセルの開放端をマニキュアで密封して、イメージングおよび光学トラップ実験中の蒸発を防ぎます。システムの準備ができたら、画面の左下隅にあるレーザーパワーボタンを使用してレーザーを50ミリワットまでオンにし、30分間安定させます。ソフトウェア内の照明、カメラ、対物レンズ、ステージ移動ボタンを順番にクリックすると、実験中に表示および操作できるウィンドウが表示されます。オン/オフボタンをクリックして顕微鏡照明をオンにし、バーをクリックして右端までドラッグして最大出力に設定します。サンプル領域を開き、顕微鏡ステージからサンプルホルダーを取り外します。次に、フローセルを追加し、金属サンプルホルダーで固定し、カバースリップが底にあることを確認します。その後、下部対物レンズの中央に30マイクロリットルのRO水を加え、サンプルステージを再挿入します。次に、水のビーズがカバースリップに触れるまで、リモコンのL2を使用して下部の対物レンズを上げます。次に、リモコンのR2を使用して、フローセルまでの距離の約半分に達するまで上部の目標を下げます。次に、上部対物レンズの真下のフローセルの上部に170マイクロリットルのRO水を追加し、水の表面張力が壊れてメニスカスを形成するまで上部対物レンズを下げます。続いて、リモコンの矢印パッドを使用して顕微鏡ステージを流路に隣接するテープの端に達するまで移動し、サンプルドアを閉じます。画面の対物レンズウィンドウを使用して、上の矢印をクリックして「レーザー対物レンズ」という名前の下部の対物レンズを上に、画面上のコントロールを使用して下の矢印をクリックして上部の対物レンズを上に表示して、テープの端とフォーカスを合わせます。フローティングビーズを見つけてトラップシャッターボタンをクリックしてトラップすると、シャッターが開き、トラップレーザーがサンプルに当たることができます。次に、画面上のトラップカーソルをクリックしてドラッグし、トラップレーザーの位置を移動します。トラップしたら、キャリブレーションボタンをクリックしてビードをキャリブレーションします。次に、[設定]をクリックして、ソフトウェアウィンドウの左下にあるビードの直径とステージの温度を入力します。次に、トラップ1をクリックし、次にX信号をクリックし、実行をクリックしてコーナー周波数フィットを実行します。次に、ウィンドウ内をクリックしてドラッグし、機能のフィットを最適化します。その後、[感度と剛性の値に使用する]をクリックしてから、値を受け入れます。続いて、ウィンドウを閉じます。カバースリップの表面でAFに結合したビーズを検索し、共局在した両方の蛍光AFを探すことにより、アクトミオシンバンドルを見つけます。白色光源をオンにし、適切なフィルターキューブを使用して、タレットを回して各アクチンフィラメントをイメージングします。確認したら、トラップシャッターボタンをクリックして、バンドルの上部フィラメントに取り付けられたビードをトラップします。次に、オンスクリーンコントロールを使用してオシロスコープボタンをクリックしてデータを記録します。データを記録せずに測定値を視覚化するには、[開始]をクリックし、[自動保存]をクリックしてすべてのデータを保存します。測定値を記録するには、[記録の開始]をクリックし、ドロップダウンメニューの[X信号]または[Y信号]を選択して、リアルタイムで視覚化するデータを選択します。構築されたin vitroアクチン構造階層内で力を生成する骨格ミオシンモーターの力の痕跡は、2〜5分にわたってプラトーに達するまで、力の安定したランプを示します。ただし、正味の力と力の痕跡を発生しない一部のアクトミオシンバンドルは、ベースラインノイズとして現れるか、モーターの濃度が低いか、フィラメントの平行方向が悪いために、90秒にわたって力の実質的な正味の増加を示さないことも観察されます。このプロトコル開発は、細胞分裂や筋肉収縮などの大規模な細胞タスクのボトムアップモデリングにさらに役立つ、より複雑なin vitro細胞骨格アッセイの構築への道を開きます。

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光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

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