Name: 化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶコヒーレントラマン散乱顕微鏡のCARSとSRSの直接比較法。空間分解能、コントラスト、スペクトル分解能を評価し、生物学的イメージングに最適な手法選択を支援する。無標識化学イメージングの基礎技術を習得できる。

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この研究は、パデュー大学化学科のスタートアップファンドの支援を受けました。

著者は利益相反がないと宣言しています。

ここで紹介するプロトコルは、マルチモーダルCRS顕微鏡の構築と、CARSとSRSイメージングの直接比較について説明しています。顕微鏡の構築にとって重要なステップは、空間的および時間的なビームのオーバーラップとビームサイズの最適化です。SNRを最適化し、ラマンシフトを較正するために、生物学的イメージングの前にDMSOなどの標準サンプルを使用することをお勧めします。CARS画像とSRS画像を直接比較すると、CARSの方が空間分解能が優れているのに対し、SRSはスペクトル分解能が向上し、複雑な化学コントラストが少ないことが明らかになります。CARS と SRS の両方に同様の検出限界があります。
CARSおよびSRSイメージングは、励起に高エネルギーパルスレーザを使用します。これにより、プラットフォームは、多光子励起蛍光、高調波発生、および追加の化学的コントラスト28,39のための過渡吸収などの他の非線形光学イメージングモダリティを統合することができる。
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ラマン散乱現象は、1928年にC. V. Raman1によって初めて観測された。入射光子がサンプルと相互作用しているとき、非弾性散乱事象が自発的に起こり得、光子のエネルギー変化は分析された化学種の振動遷移と一致する。このプロセスでは、化学タグを使用する必要がないため、サンプルの摂動を最小限に抑えながら、化学分析のための汎用性の高いラベルフリーツールになります。その利点にもかかわらず、自発的ラマン散乱は、低散乱断面(典型的には赤外線[IR]吸収断面よりも1011 低い)に悩まされ、分析2のために長い取得時間を必要とする。したがって、ラマン散乱プロセスの感度を高めるための探求は、ラマン技術をリアルタイムイメージングに推進する上で不可欠です。
ラマン散乱の感度を大幅に高める効果的な方法の1つは、コヒーレントラマン散乱(CRS)プロセスによるものであり、そのために2つのレーザーパルスが分子振動遷移を励起するために典型的に使用される3,4。2つのレーザー間の光子エネルギー差がサンプル分子の振動モードと一致すると、強いラマン信号が生成されます。イメージングに最も一般的に使用される2つのCRSプロセスは、コヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)と刺激ラマン散乱(SRS)5です。過去20年間、技術開発により、CARSおよびSRS顕微鏡技術が進歩し、生体サンプル中の標識のない定量化および化学変化の解明のための強力なツールになりました。
CARS顕微鏡による化学イメージングは、Duncanら6によって実証されたように、レーザースキャニングがCARS画像を取得するために最初に適用された1982年にさかのぼることができます。CARS顕微鏡の近代化は、レーザー走査型多光子蛍光顕微鏡7の幅広い応用の後、大幅に加速されました。高繰り返し速度レーザーを使用したXieグループの初期の研究は、CARSを生物学的サンプル中の分子の特性評価のための高速、ラベルフリーの化学イメージングプラットフォームに移行しました8,9,10。CASイメージングの主な問題の1つは、非共振背景の存在であり、これは画像のコントラストを低下させ、ラマンスペクトルを歪める。非共鳴バックグラウンド11、12、13、14、15を減少させるか、またはCARSスペクトル16、17から共鳴ラマン信号を抽出するために多くの努力がなされている。この分野を大幅に進歩させたもう1つの進歩は、ハイパースペクトルCARイメージングであり、これは改善された化学的選択性18、19、20、21で各画像ピクセルでのスペクトルマッピングを可能にする。
刺激ラマン散乱(SRS)は、CARSよりも若いイメージング技術ですが、22年初めに発見されました。2007年に、低繰り返し率レーザー光源23を用いたSRS顕微鏡法が報告された。まもなく、いくつかのグループは、高繰り返し速度レーザー24、25、26を用いた高速SRSイメージングを実証した。CARSに対するSRS顕微鏡法の主な利点の1つは、非共振バックグラウンド27がないことであるが、クロスフェーズ変調(XPM)、過渡吸収(TA)、2光子吸収(TPA)、および光熱(PT)効果などの他のバックグラウンドがSRS28で起こり得る。さらに、SRS信号およびサンプル濃度は、二次信号濃度依存性を有するCARSとは異なり、線形関係を有する29。これにより、化学定量とスペクトルアンミキシングが簡素化されます。マルチカラーおよびハイパースペクトルSRSは、異なる形態30、31、32、33、34、35、36で進化しており、スペクトル集束は化学イメージングのための最も一般的なアプローチの1つである37,38。
CARSとSRSの両方は、信号励起のための分子の振動遷移に一致させるために、ポンプとストークスレーザービームをサンプルに集束させる必要があります。CARS顕微鏡とSRS顕微鏡にも多くの共通点があります。しかし、これら2つのプロセスの根底にある物理学と、これらの顕微鏡技術に関わる信号検出には、3,39の格差があります。CARSは、正味の光子-分子エネルギー結合3を持たないパラメトリックプロセスである。しかし、SRSはノンパラメトリックプロセスであり、光子と分子系27との間のエネルギー移動に寄与する。CARSでは、アンチストークス周波数で新しい信号が生成されますが、SRSはポンプとストークスレーザービーム間のエネルギー移動として現れます。
CARS 信号は Eq (1)28 を満たします。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
一方、SRS信号はEq(2)28と書くことができる。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
ここで、Ip、Is、I CARSおよびΔISRSは、それぞれポンプビーム、ストークスビーム、CARS信号、およびSRS信号の強度である。χ(3) はサンプルの 3 次非線形光学感受性であり、実数部と虚数部で構成される複素数値です。
これらの方程式は、CARSとSRSのスペクトルプロファイルと信号濃度依存性を表します。物理学の違いにより、これら2つの顕微鏡技術の検出スキームが異なります。CARSにおける信号検出は、通常、新たに生成された光子のスペクトル分離と、光電子増倍管(PMT)または電荷結合素子(CCD)を用いた検出を伴う。SRSの場合、ポンプビームとストークスビーム間のエネルギー交換は、通常、光変調器を使用した高速強度変調と、ロックインアンプと対になったフォトダイオード(PD)を使用した復調によって測定されます。
近年、CARとSRSの両方の分野で多くの技術開発と応用が発表されていますが、特にハイパースペクトルCARSとSRS顕微鏡では、2つのCRS技術の体系的な比較は同じプラットフォーム上で行われていません。感度、空間分解能、スペクトル分解能、および化学分離能力を直接比較することで、生物学者は化学定量に最適なモダリティを選択できます。このプロトコルでは、フェムト秒レーザーシステムとスペクトル集束に基づくハイパースペクトルCARモダリティとSRSモダリティの両方を備えたマルチモーダルイメージングプラットフォームを構築するための詳細な手順が提供されます。2つの技術は、スペクトル分解能、検出感度、空間分解能、および細胞のイメージングコントラストについて順方向で比較されてきた。

<table><tbody><tr><td>2Dガルバノスキャナセット</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>音響光学変調器</td><td>Isomet</td><td>M1205-P80L-0.5</td><td></td></tr><tr><td>AOMドライバ</td><td>Isomet</td><td>532B-2</td><td></td></tr><tr><td>データ収集カード</td><td>National Instruments</td><td>PCle 6363</td><td>カスタムオーダーフィルタ (980 sp)</td></tr> <tr><td>遅延ステージ</td><td>Zaber</td><td>X-LSM050A</td><td></td></tr><tr><td>重水素酸化物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>151882-100G</td><td></td></tr><tr><td>ビームコンビネーション用ダイクロイックミラー</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP1000</td><td></td></tr><tr><td>シグナル分離用ダイクロイックミラー</td><td>Semrock</td><td>FF776-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MiliporeSigma</td><td>200-664-3</td><td></td></tr><tr><td>MIA PaCa 2セル</td><td>ATCC</td><td>CRL-1420</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ムト秒レーザーシステム</td><td>スペクトルPhysics</td><td>InSightX3+</td><td></td></tr><tr><td>Filter for CARS</td><td>Chroma</td><td>AT655/30m</td><td></td></tr><tr><td>Filter for SRS</td><td>Chroma</td><td>ET980sp</td><td></td></tr><tr><td>Function generator</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Glass rods</td><td>Lattice Electro Optics</td><td>SF-57</td><td></td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>Newport</td><td>10RP02-51; 10RP02-46</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 2020</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td></td><td>これは画像取得ソフトウェアです</td></tr><tr><td>ロックインアンプ</td><td>チューリッヒインストルメント</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ハウジング</td><td>オリンパス</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Origin Pro 2019b</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>これはスペクトルフィッティングソフトウェア</td></tr><tr><td>です オシロスコープ</td><td>テクトロニクス</td><td>TBS2204B</td><td></td></tr><tr><td>フォトダイオード</td><td>浜松</td><td>S3994-01</td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管検出器</td><td>浜松</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管電圧増幅器</td><td>(株)</td><td>PMT4V3</td><td></td></tr><tr><td>偏光ビームスプリッターキューブ</td><td>Thorlabs</td><td>PBS255</td><td></td></tr><tr><td>端子台</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr></tbody></table>

化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較

Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

刺激ラマン散乱(SRS)およびコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)顕微鏡は、最も広く使用されているコヒーレントラマン散乱イメージング技術です。ハイパースペクトルSRSおよびCARSイメージングは、すべてのピクセルでラマンスペクトル情報を提供し、異なる化学組成のより良い分離を可能にします。どちらの技術も2つの励起レーザーを必要としますが、それらの信号検出スキームとスペクトル特性はまったく異なります。このプロトコルの目標は、ハイパースペクトルSRSとCARSイメージングの両方を単一のプラットフォームで実行し、異なる生物学的サンプルをイメージングするための2つの顕微鏡技術を比較することです。スペクトル集束法は、フェムト秒レーザーを用いてスペクトル情報を取得するために採用されています。標準的な化学サンプルを使用することにより、同じ励起条件におけるSRSとCARの感度、空間分解能、スペクトル分解能(すなわち、サンプルでのパワー、ピクセル滞留時間、対物レンズ、パルスエネルギー)が比較されます。生体サンプルのCARSとSRSのイメージングコントラストを並置して比較します。CARSとSRSの性能を直接比較することで、化学イメージングのモダリティを最適に選択することができます。

スペクトル分解能の比較 図2は、DMSOサンプルを用いたハイパースペクトルSRS(図2A)およびCARS(図2B)顕微鏡のスペクトル分解能を比較したものである。SRSスペクトルについては、スペクトルに適合するように2つのローレンツ関数(プロトコルステップ2.3を参照)を適用し、2,913cm-1ピークを用いて14.6cm-1の分解能を得た。CARSでは、ガウスバックグラウンドを持つ2ピークフィッティング関数(プロトコルステップ2.3を参照)をフィッティングに利用し、スペクトル分解能は17.1cm-1でした。これらの結果は、同じ測定条件で、SRSがCARSよりも優れたスペクトル分解能を有することを示している。CARSのスペクトル分解能の低下は、主に非共振バックグラウンドの関与によって寄与されます。さらに、SRSとCARSでは、対称(2,913 cm-1)と非...

この論文では、同じ顕微鏡プラットフォームに統合された誘導ラマン散乱(SRS)とコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)の解像度、感度、イメージングコントラストを直接比較します。結果は、CARSの空間分解能が優れており、SRSはコントラストとスペクトル分解能が優れており、どちらの方法も感度が類似していることを示しています。

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

このプロトコルは、コヒーレント抗ストークスラマン散乱と刺激ラマン散乱プロセスを含む、最も広く使用されている2つのハイパースペクトルコヒーレントラマン散乱技術を比較し、生物学者が生物学的用途に最適なイメージングモダリティを選択することを可能にします。固有の振動シグネチャを使用して、コヒーレントラマン分光法は、外因性標識を必要とせずに化学情報と生物学的サンプルをマッピングすることができます。コヒーレントラマン顕微鏡は、細胞代謝、マッピング、薬物分布、疾患診断、および化学変化の定量化に関する私たちの理解を広げました。これは、光学と分光法の両方で十分な訓練を必要とする技術です。このテクニックを使用する前に、いくつかのレビュー記事を読んで、専門家の訓練を受けることをお勧めします。まず、カバースリップに両面テープを貼ってイメージングスライドを準備し、テープの中央から小さな長方形のテープを切り取り、サンプルを配置するためのオープンエリアを作成します。ピペット1〜2マイクロリットルの純粋なDMSOを、空孔の中心に液滴を分配する。トップカバースリップを慎重に置き、カバースリップの端をそっと置き、DMSOサンプルがテープの端に接触しないようにしながらチャンバを密封します。感度実験のために、DMSOの段階希釈物を酸化重水素中に調製し、50〜0%の濃度範囲を与えるために各溶液の1〜2マイクロリットルを取り、前述のようにプレスサンプルを調製する。サンプルを顕微鏡ステージに置き、必要に応じて対物レンズまたはコンデンサーに水または浸漬油を加えます。DMSO液滴の端を視野内で適切に動かし、対物レンズを調整して最適な焦点を合わせ、ケーラー照明法を使用してコンデンサーを中央に配置し、コンデンサーの絞りを完全に開きます。次に、ポンプビーム波長を800ナノメートルに調整して2913波数CH3ピークをターゲットとし、1/2波長板を調整してポンプとストークスビームの両方のパワーを顕微鏡の前に約30ミリワットに設定します。SRS の場合は、時定数が 7 マイクロ秒でロックイン アンプのゲインを約 10 に設定し、時定数がピクセルの滞留時間よりも小さくなるようにします。約100×100平方メートルのスキャンサイズで200×200のピクセル数を使用して画像取得パラメータと取得ソフトウェアを設定し、画像にDMSO液滴と空き領域の両方が含まれていることを確認し、サンプルをスキャンしてコンピュータ画面で画像を確認します。次に、リアルタイム画像を監視しながらストークスポンプビーム内の電動遅延画像をスキャンし、信号が最大になるまで遅延をスキャンする。DMSO液滴を視野全体をカバーするように動かし、信号がポンプビームに依存するため、DC信号の最大値が画像の中央にあるかどうかを確認します。ミラーを介してポンプビームの位置またはイメージングソフトウェアで電圧オフセットを調整します。DC最適化後、飽和度が画像の中心にあることを確認しながら、約50%の彩度を表示するようにしきい値を調整して、AC信号が最大になるまでストークスビームミラーを調整します。そうでない場合は、ストークスビームでのみミラーを微調整し、アライメントの品質に関するリアルタイムフィードバックとしてアライメント中の信号を監視します。SNR 分析の場合は、ImageJ ソフトウェアを開き、[ファイル]、[インポート]、[ドロップダウン メニューの [テキスト イメージ] および [開く] オプションをクリックして、保存した DMSO サンプル テキスト ファイルをインポートします。画像が読み込まれたら、Control Shift Cを押して明るさとコントラスト機能を表示し、DMSOサンプルの領域が飽和状態になるまで自動ボタンを押して最大サンプル信号を見つけます。次に、ImageJ インターフェイスの楕円形選択ツールをクリックし、飽和 DMSO 領域の小さな領域を強調表示します。強調表示後、M キーを押して、選択した領域の平均と標準偏差を測定します。背景を測定するには、空の領域の信号が観測できるまで明るさとコントラスト機能のバーを調整し、楕円形の選択をクリックして背景の領域を強調表示し、選択した領域にDMSOが含まれていないことを確認します。その後、M キーを押して、選択した領域の統計を測定します。次に、標準偏差とともにノイズ平均値と信号平均値を測定して、先に示したようにSNRを計算します。ハイパースペクトルCRSイメージを処理するには、[ファイル]、[インポート]、[テキストイメージ]、および[開く]オプションをドロップダウンメニューからクリックしてテキストファイルをインポートします。インポートしたら、[画像]、[スタック]の順にクリックし、[ツール]と[モンタージュをスタックする]オプションをクリックしてファイルを画像スタックに変換し、最初のDMSOピークが表示されるまでモンタージュをスクロールします。DMSOで領域を選択し、[画像]をクリックし、続いて[スタック]および[Z軸プロファイルのプロット]オプションをクリックして、強度対フレーム番号スペクトルをプロットします。次に、[リスト]をクリックし、プロファイルデータをコピーして生のスペクトルデータを抽出します。回復したスペクトルを周波数単位に変換するには、DMSOからの対称および非対称CHストレッチとそれに対応するフレーム番号を使用して線形回帰を実行します。DMSOのスペクトル分解能は、ハイパースペクトルSRSおよびCARS顕微鏡を用いて測定され、それぞれ14.6および17.1波数の分解能を示し、SRSがより良いスペクトル分解能を有することを示している。DMSO SRSスペクトルは、0.1%および0.01%濃度で得られ、前者では2913波数のピークが分解できるが、後者では分解できず、検出限界が0.1〜0.01%DMSOであることを示している。位相検索されたCARSスペクトルは、DMSO 2913波数ピークが0.1%DMSOに対して明確に分解できることを示していますが、これら2つの濃度間の検出限界を示す0.01%では解決できません。MIA PaCA-2セルのSRSおよびCARS強度プロファイルは、SRS信号が398.6ナノメートルの分解能を与え、CARS信号が330.3ナノメートルの1.2倍の分解能を示したことを実証した。異なる光学遅延位置にあるMIA PaCa-2細胞からのSRSおよびCARS画像は、SRSの明るいドットとして脂肪滴を有する最も強いシグナルを示すが、CARSはコントラストをはるかに低下させる。しかし、スペクトル集束における37波数の赤方偏移は、SRSとCASの両方の脂質コントラストを改善した。SRSスペクトルは、脂肪滴の2850波数で他の細胞小器官よりもはるかに強いシグナルを示すが、CARSスペクトルは小さな赤方偏移を示す。コヒーレントラマン散乱信号を最適化するには、まずサンプルフォーカスを見つけ、次に光遅延を調整し、最後に最大に達するまでミラーを微調整します。過渡吸収などの他のポンププローブ技術は、本質的にCRSプラットフォームに統合されています。この技術は、強い光吸収性非蛍光分子の吸収動態を測定するのに非常に強力です。この技術により、研究者は、高い化学細胞活性を有する標識のない方法で小分子を見ることができる。また、研究者は脂質代謝、細胞内動態、薬物分布の変化を見ることができます。

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