Name: クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 学ぶCLARITY法を用いたマウス海馬におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の可視化手法。透明化した脳組織で300個以上の細胞を観察し、細胞間距離の測定と神経回路構造の解析が可能になります。

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このプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020研究イノベーションプログラム(助成金契約No 803589)、イスラエル科学財団(ISF助成金No.1815/18)、カナダ-イスラエル助成金(CIHR-ISF、助成金No.2591/18)の下で、欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けています。原稿全体にコメントしてくれたNechama Novickに感謝します。

実験プロトコルは、ヘブライ大学動物ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドのガイドラインを満たしていた。
1. ウイルスベクター形質導入
注: ウイルスベクター形質導入は、脳内で蛍光色素を発現するために使用されます。
<ol><li>アトラス(例:Allen Brain Atlas)を使用して、ターゲット領域の関連する調整を見つけます。 注:3Dアトラスはオンラインで見つけることができます(例:http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer)。</li>
	<li>定位手術を使用して、ウイルスベクターを関連する脳構造に注入する。詳細なプロトコルについては、9 を参照してください。</li>
	<li>蛍光色素分子の発現を3~6週間待ちます。 注: 細胞体のみをマークする必要がある場合は、短い時間で十分です。軸索突起が問題に関連する場合、蛍光色素分子が軸索内で発現するのに時間がかかるため、長い期間が必要になります(長さは数ミリメートルです)。</li>
	<li>蛍光色素分子発現(ウイルス発現とTG動物の両方)の特異性と浸透度を事前に検証します(図1A)。CLARITY手順に進む前に、薄いスライス用に少なくとも1つの脳を指定し、蛍光色素分子の発現が強く、標的細胞の特徴に特異的であることを確認してください。</li>
</ol>2. 明快さ
注:この方法は、2〜6週間以内に脳を透明にします。
<ol><li>冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に続いてPBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して動物に経頭蓋灌流を行います。脳を取り出し、50mLチューブまたは同様の容器中で4°Cで一晩PFA中に保管する。 注:経頭蓋灌流が行われる前に、動物は深く麻酔されなければなりません。このプロトコールに提示された実施例において、全ての動物を、ケタミンおよびキシラジン(それぞれ90%および10%)を用いて麻酔した。</li>
	<li>PFAをヒドロゲル溶液(HS; 表1参照)と交換し、4°Cで48時間処理する。 注:この段階で材料が冷凍温度(4-8°C)よりも暖かくならないようにしてください、さもなければヒドロゲルは重合します。このプロトコルで使用されるHSは、4%22または1%17を示唆する以前のプロトコルとは異なり、2%アクリルアミドを含む。2%の利点については、ディスカッションセクションで詳しく説明します。HSを準備するときは、氷のように冷たい表面で作業してください。-20°Cで保管してください。</li>
	<li>脱 ガス 注:この段階の目的は、O2が重合プロセスを妨害するため、組織からすべての遊離酸素を除去することです。任意の非O2ガス(例えば、N2、CO2)を使用することができる。N2が推奨されます。<ol>
<li>N2を、5mm(内部)の可撓性チューブを介してタンクから移送し、その端にある19G針に接続します(図1B)。</li>
		<li>チューブのキャップに2つの小さな穴(針幅)を作ります:1つはガスを導入するため、もう1つは空気がチューブから出ることができるようにします(図1C)。</li>
		<li>N2ガスからチューブに配管を取り付け、室温(RT)で約30分間ガスを交換します。</li>
		<li>パイプを取り外し、すぐにすべてのチューブのモデリング粘土で穴を密封します(図1D)。</li>
	</ol></li>
	<li>脱気した密閉管を37°Cの槽に3.5時間移し、HSを重合させ、ゲル状になる。チューブを振らないように注意してください(図1E)。</li>
	<li>チューブから脳を抽出し、実験室のワイプを使用して周囲から重合ゲルを静かに取り除きます。以下のステップで溶液と反応し、組織クリアリングプロセスを阻害する可能性があるため、残留ゲルが組織の表面に付着したままにならないことを確認してください(図1F)。 注:ゲルにはPFAが含まれていたため、抽出はヒュームフードの下で行う必要があります。</li>
	<li>目の前の質問が脳の一部だけを必要とする場合は、脳をスライスします。それを半分に分けるか、すべての関心領域を含む非常に厚いスライスに分割します(図1G)。</li>
	<li>スライスを新しい容器内の第1の透明化溶液(CS1、 表2参照)に入れ、70rpmで37°Cで24時間振とうする。</li>
	<li>以下に説明する手順に従って、脳をCS1から2番目のクリアリングソリューション(CS2、 表2参照)に移します。<ol>
<li>脳用の穴あきチューブを予め用意しておきます(図1H)。</li>
		<li>CS2をチューブを入れるのに十分な大きさのビーカーで40〜45°Cに予熱する。スターラー付きのホットプレートでこれを行います。発現タンパク質の漂白を防ぐために、温度が55°Cに達していないことを確認してください。</li>
		<li>CS2を充填したビーカーと有孔管とを攪拌装置( 図1Iでは2Lビーカー)の上に置く。組織を歪めることなく液体を流動させる適度な攪拌速度を設定します。 注:2〜6週間以内に、組織は透明になります(このプロセスは末梢から始まり、中枢脳構造に向かって内側に移動します)。組織がいつ「十分に明確」になるかの決定は、個人的な判断に委ねられています。脳は、干渉なしに顕微鏡下で画像化するために十分に透明でなければならない(図1J は十分に明確ではない。 図1Kは 十分に明確である)。組織が十分に透明である点を超えると、組織の剛性が失われる可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>CS2からPBST(PBS中の0.5% Triton X-100、 表2参照)に新しい容器に移し、37°Cで24時間穏やかな振とう(70rpm)した。 注:PBSTでは、組織は白っぽくなります(図1L)。屈折率マッチングソリューション(RIMS、ステップ2.14参照)に埋め込まれると、明瞭さが戻り(そして改善)します。</li>
	<li>PBST を新しい PBST に置き換えます。同じ条件(穏やかな振とうで37°C)でさらに24時間保管してください。</li>
	<li>PBST を新しい PBST に再度交換し、RT で 24 時間待機します。</li>
	<li>RT で PBS に 24 時間転送します。</li>
	<li>PBS を交換し、RT でさらに 24 時間放置します。</li>
	<li>PBSから脳を取り出し、37°Cで一晩RIMSに移す。 注:最初は、RIMSの波紋が脳を囲むことがあります。このプロトコルは、2つの特定の商用RIMSを使用して設計および検証されました( 表3を参照)。ただし、他のRIMS(商用または自作)を使用する場合、プロトコルは変わらないはずです。</li>
	<li>さらに24時間、または溶液が完全な平衡に達するまで、すなわち組織が透明になり、溶液に目に見える波紋が含まれなくなるまで、組織をRTに保ちます(図1M)。</li>
	<li>組織が透明である場合は、チャンバーの準備に進みます。この時点で、組織が透明ではなく白色になった場合(残留SDS分子の凝集体による)、ステップ2.9および2.10を繰り返してサンプルを再度洗浄し、組織をCS2に数日間移し(ステップ2.8)、続いてステップ2.15までのすべてのステップを実施した。</li>
</ol>3. チャンバーの準備
メモ:各サンプルには、サンプルが置かれるイメージングチャンバーを備えたスライドが必要です。
<ol><li>スライドの中央にサンプルを配置します。</li>
	<li>ホットグルーガンを使用して、スライドの端に組織とほぼ同じ高さの壁を作ります。角の1つに小さな隙間(約5 mm)を残してください(図2A、B)。</li>
	<li>サンプルにRIMSを1〜2滴塗布して、上面を湿らせ、カバースリップと組織の間に気泡が形成されるのを防ぎます。</li>
	<li>RIMS滴を塗布した直後に、ホットグルーの最後の層を壁に追加し(脳/スライスの高さに達するように)、すぐに(ホットグルーがまだ液体である間)ステップ3.5に進みます。</li>
	<li>上部をカバースリップで密封し、まだ温かいホットグルー層の上にできるだけ均等に置きます(図2C)。</li>
	<li>ホットグルー壁に残された隙間からチャンバーをRIMSで満たします(図2D、E)。</li>
	<li>熱い接着剤で隙間を塞ぎます。内部に空気を入れないでください(図2F)。</li>
	<li>ホットグルーの壁がスライドの境界を越えて伸びている場合は、伸びているエッジをカットします(図2G)。</li>
	<li>イメージングに使用する対物レンズが浸漬されている場合は、カバースリップの上の壁にさらに2~3mmの接着剤を追加して、浸漬溶液が長期間持続するようにします(図2H)。</li>
</ol>4. イメージング(共焦点または二光子)
<ol><li>チャンバーの厚さが数ミリメートルに達する可能性があるため、ステージがチャンバーを保持できるかどうかを確認します。 注:例えば、このプロトコルで使用される共焦点顕微鏡( 材料表を参照)は、いくつかの段階(例えば、円形、長方形)を備えている。チャンバを保持するためにどのステージが選択されても、そのパラメータがチャンバのサイズに適合する限り、無関係です。</li>
	<li>十分な作動距離、すなわち最小作動距離≥3mmの対物レンズで作業し、関心領域の脳領域は数ミリメートルの深さであり、カバースリップは手動で配置されたように完全にまっすぐではない可能性がある。 注:デモンストレーションとして、 図1、ビデオ1、および ビデオ2に提示された結果は、3mmの作動距離と2.4倍の倍率で水浸漬16倍の対物レンズを使用して 2 光子顕微鏡下で得られ、652 x 483μmの視野と平面間の間隔が0.937μmのzスタックを得た。</li>
	<li>複数エリアイメージングを実行しますが、これには数時間から数日かかる場合があります。各イメージのサイズが最大数十ギガビットに達する可能性があるため、コンピュータに十分な空きストレージがあることを確認してください。 注:クラリティイメージングでは、画像セクションの深さが大幅に増加する可能性があります。したがって、画像の要約中に過剰発現を防ぐために、式をキャプチャするために使用される強度は比較的低くする必要があります。</li>
	<li>浸漬目標の場合は、イメージング中に液体を定期的にチェックし、必要に応じて追加の液体を補充します。 注: ビデオ3に示されているデータのイメージング中、蒸発と戦うために6〜8時間ごとにチャンバの表面に水が追加されました。</li>
	<li>イメージを取得したら、いくつかの異なるソフトウェアパッケージを使用してイメージを表示および分析します。 メモ: 推奨されるソフトウェアには、視覚化と分析の両方のための Imaris と SyGlass が含まれます。Imarisソフトウェアを使用してアストロサイトの再構成を最適化するための正確なパイプラインは、以前に説明されています9.要するに、この研究で使用されたイマリの特徴は、細胞構造を完全に再構築するためのフィラメントと、すべてのソマタの空間における位置を抽出するためのスポットでした。</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
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<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
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<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

組織クリアリング法は、脳研究における革命的なツールを提示し、以前は尋ねられなかった質問を招きます。CLARITYは、小さな細胞群、単一細胞、さらには単一のシナプスの特性を標的にすることから、関連する蛍光色素を使用することで、全細胞集団または長距離接続性特徴の標的化を可能にしました。
蛍光色素分子発現とCLARITY手順の組み合わせの結果はバイナリではありません。多くの要因が手順を妨げ、最適でない結果につながる可能性があります。まず、蛍光色素分子の発現を事前に検証する必要があります。CLARITY手順はいくらかの情報損失を引き起こすため、CLARITYプロセスの最後に画像の有効性を得るためには、十分な蛍光色素タンパク質の発現が不可欠です。第二に、経頭蓋灌流は慎重に処理されなければならず、血液の自家蛍光は厚いスライスの信頼性の低いデータにつながるため、すべての血液が脳から出ることを保証する。第3に、プロトコルで議論されるすべてのパラメータは、透明化プロセスの各ステップにおいて正確に取り扱われなければならず、例えば、重合前のHS中のO2 残基または各段階での温度不正...

近年、アストロサイト機能とそれらがニューロン回路とどのように相互作用するかについての知識は劇的に増加しています。アストロサイトは可塑性1,2に影響を与え、ニューロンの損傷後の回復を補助し3,4、さらにはde novoニューロン増強を誘導することができ、最近の研究では、以前は純粋にニューロン機能と考えられていた記憶獲得と報酬におけるアストロサイトの重要性が示されている5,6,7.アストロサイト研究において特に興味深い特徴は、海馬および他の脳構造におけるユニークな空間組織を維持する細胞の空間配置である8,9,10。細胞体腫の間で絡み合うニューロン樹状突起とは異なり、海馬アストロサイトは、そのプロセスの間にわずかに重複して視覚的に区別可能な領域に生息し、別個のドメイン8、11、12、13を作り出す。ニューロン回路へのアストロサイトの関与を支持する証拠は、そのような集団およびそれらのドメイン内のニューロンの詳細な解剖学的記述の欠如を支持しない14。
ウイルスベクター形質導入手順は、トランスジェニック動物(TG)とともに、脳の構造、機能、および細胞相互作用を調査するためのツールセットとして普及している15,16。異なるプロモーターの利用は、それらの遺伝的特性、活性化レベル17、18、または投影標的に応じた特定の細胞の標的化を可能にする。異なるウイルスは、異なる集団で異なる色の蛍光色素を発現することができる。ウイルスは、TGにおける蛍光色素の内因性発現と組み合わせることができ、またはTG動物をウイルスを必要とせずに使用することができる。これらの技術はニューロンマーキングに広く使用されており、一部の研究室では、アストロサイト5、9、19などの他の細胞型を標的とすることに特化した修飾でそれらを使用し始めています。
201320,21で最初に記述されたCLARITY技術は、微視的構造をそのまま残しながら脳全体を透明にすることによって、厚い脳スライスの研究を可能にする。ウイルスベクター形質導入と組織クリアリングの2つの方法を組み合わせることで、異なる細胞型集団間の空間的相互作用を調べるオプションが利用可能になりました。ほとんどのアストロサイト-ニューロン相互作用研究は、薄い脳スライスに対して実施され、その結果、ドメインが大きいために不完全なアストロサイトの画像が得られ、分析された細胞の数が根本的に制限された。CLARITY技術を使用することで、大規模ボリューム内の細胞集団の単一セル分解能特性評価を同時に行うことができます。明瞭な脳内の蛍光タグ付き細胞集団をイメージングしてもシナプス分解能は得られませんが、アストロサイトとさまざまなニューロン細胞タイプとの間の空間的相互作用の徹底的な特徴付けが可能になります。
そのため、これらの最先端の技術を利用して、背側CA1全体のアストロサイトの特性を調査し、すべての薄層(ラディアタム層、ピラミッド層、オリエンス層)をイメージングしました。我々は数万のアストロサイト(ウイルス浸透度>96%5)を測定し、CA1周辺のアストロサイト集団全体の情報を解析した。ニューロンマーカーの効率的な浸透により、CA1アストロサイトの集団全体と、パルブアルブミン(PV)、ソマトスタチン(SST)、VIP阻害性ニューロン、および興奮性錐体細胞の4種類のニューロン細胞との間の相互作用を記録することができました9。
TG動物からの蛍光と異なる色のウイルスベクター(すべての阻害細胞)の組み合わせを用いていくつかの実験を実施し、一方、他の実験(興奮性)は、異なるプロモーター下で異なる蛍光団を発現する2つのウイルスベクターを利用した9。この論文では、脳内の所望の細胞のタグ付け、修正されたCLARITY手順を使用して脳を透明にすること、および様々な手順およびソフトウェアを使用して完全な脳構造を画像化および分析することを含む詳細なプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>星状細胞の検出に使用されるウイルスベクター</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>ニューロンの検出に使用されるウイルスベクター</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>ニューロン核の検出に使用されるウイルスベクター</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility(EVCF)</td><td></td><td>ニューロンの検出に使用されるウイルスベクター</td></tr><tr><td>アクリルアミド (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>ビサアクリルアミド (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma</td> <td>#B7901</td><td>分子量 - 61.83 g/mol</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡、走査型、FV1000</td><td>オリンパス</td><td></td><td>4倍対物レンズ (UPlanSApo, 0.16 NA)</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane, UK</td><td></td><td>画像の3D解析が可能なソフトウェア</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td> <td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td> <td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td> <td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td> <td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>SyGlassソフトウェア</td><td></td><td></td><td>バーチャルリアリティを使用して画像の3D解析を可能にするソフトウェア</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>分子量 - 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td> <td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>2光子顕微鏡</td><td>ニューロラボウェア</td><td></td><td>チタンサファイアレーザー(Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP光電子増倍管(浜松ホトニクス, H10770-40), バンドパスフィルター(セムロック), 水浸16倍対物レンズ(ニコン, 0.8 NA)&nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 イニシエータ</td><td>ワコー</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と組織クリアリングを組み合わせることで、数種類の脳細胞とその相互作用を同時に調べることができます。ウイルスベクター形質導入は、同じ組織内で異なる蛍光色の多様な細胞タイプのマーキングを可能にします。細胞は、活性または投影によって遺伝的に同定することができる。修正されたCLARITYプロトコルを使用して、アストロサイトおよびニューロンの潜在的なサンプルサイズは2〜3桁成長した。CLARITYを使用すると、スライスに全体収まるには大きすぎる完全なアストロサイトのイメージングと、すべてのプロセスによるソマタの検査が可能になります。さらに、アストロサイトと異なるニューロン細胞型との間の空間的相互作用、すなわち、各アストロサイトドメイン内の錐体ニューロンの数、またはアストロサイトと特定の阻害性ニューロン集団との間の近接性を調査する機会を提供する。このホワイト ペーパーでは、これらのメソッドをどのように適用するかを詳しく説明します。

厚い脳組織スライスのクリアリングに成功すると、単一細胞または隣接する細胞群の特性とは対照的に、大きな細胞集団の特性に関して尋ねることができる新しい範囲の質問が生じる。成功する結果を達成するためには、サンプル間の分散を減らすために考慮する必要がある幅広いパラメータ(例えば、透明度の割合、蛍光情報、腫れ度パラメータ)があるため、CLARITYプロトコルに厳密に従う必要があります。
図1は 、蛍光タンパク質発現検証から透明化方法のすべての段階までの透明化プロセス全体を説明しています。 図2 は、清澄化された組織のためのチャンバーを調製する方法を記載し、二光子または共焦点顕微鏡下での画像化に最適な。このプロトコルで必要とされる材料は、チャンバ調製の他のプロトコルと比較して非常に安価である。
図3 は、 ビデオ1で説明した立方...

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と脳クリアリングを組み合わせることで、多数のニューロンとアストロサイトを同時に調べることができます。

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

2013年に初めて記載されたクラリティ技術は、大量の細胞、血管、タンパク質なども厚い脳スライスで単一細胞分解能のサンプリングを可能にする組織クリアリング技術である。この技術は、脳全体を透明にすることによって、無傷の微視的構造の研究を可能にする。このプロトコルは、組織クリアのためのシンプルなチップと簡単なパイプラインです。この技術は、脳組織に加えて、他のシステムにおける組織をクリアするために使用することができる。まず、パラフィルムを使用してチューブとキャップを密封し、キャップに2つの穴を穿刺します。次に、内径5ミリメートルのフレキシブルパイプと、その端に接続された19ゲージの針を使用して、タンクから窒素ガスを移送する。チューブにパイプを取り付け、室温で30分間ガス交換を行うことで脱気を開始します。パイプを取り外し、すぐにモデリング粘土で穴を密封します。次いで、脱気密封管を37°Cの浴に3時間半移し、ヒドロゲル溶液を重合させた。チューブから脳を取り出します。実験室用ワイプを使用して、脳の周りの重合ヒドロゲルを除去し、残留ゲルが脳の表面に付着したままにならないようにする。脳を、関心のあるすべての領域を含む厚いスライスに分割します。スライスを最初の透明化溶液に入れ、摂氏37度で70RPMで24時間回転させてインキュベートする。その間に、脳を配置するための穴あきチューブを準備します。第2の透明化溶液を充填したビーカーに多孔管を攪拌装置上に入れる。その後、ビーカーに脳を置き、漂白を防ぐためにアルミホイルで密封します。組織が透明になった後、脳をPBSTに移し、摂氏37度で24時間回転させながら摂氏37度でインキュベートする。溶液を新鮮なPBSTと交換し、さらに24時間インキュベーションを続ける。その後、脳を室温で24時間PBSに移す。24時間後、PBSから脳を取り出し、屈折率整合溶液に移す。一晩摂氏37度で脳をインキュベートする。まず、スライドの中央にサンプルを配置します。ホットグルーを使用して、スライドの端に組織とほぼ同じ高さの壁を作ります。角の1つに小さな隙間を残してください。ホットグルー層が脳スライスの高さに近づいたら、屈折率マッチング溶液をサンプルに1〜2滴塗布して上面を湿らせ、気泡形成を防ぎます。ホットグルーがまだ液体である間は、カバースリップで上部を密封し、できるだけ均等に配置してから、チャンバーを屈折率マッチング溶液で満たします。熱い接着剤で隙間を塞ぎます。ホットグルーの壁がスライドの境界を越えて伸びている場合は、伸びているエッジをカットします。撮影に油浸対物レンズを使用する場合は、カバースリップの上の壁にさらに2~3mmの接着剤を加えて、浸漬溶液を保持します。このプロトコルの後、脳組織はクリアされます。マウス海馬のCA1領域におけるアストロサイトおよびニューロンの集団を視覚化するために、このプロトコルを使用して透明な脳スライスを調製した。すべてのアストロサイトはtdTomatoを発現し、興奮性ニューロンは核内でH2B-GFPを発現した。清澄化された組織のために調製されたチャンバーは、2つの光子または共焦点顕微鏡下での画像化に最適であった。2つの光子顕微鏡を用いて、マウス海馬のCA1領域のクリアされた部分において300以上のアストロサイトが観察された。赤色の海馬アストロサイトと錐体細胞、緑色のソマタは目に見えて厚く、透明な組織であり、これら2つの細胞型間の空間的近接性を表している。走査型レーザー共焦点顕微鏡を用いて、興奮性ニューロンからの軸索束を半球全体にわたってトレースした。緑色の束は背側海馬からスーパー乳房体に向かってトレースされた。赤い束は、母体から通気口海馬の起源に向かってトレースされました。温度、濃度、インキュベーション時間などの要因が、透明化手順の結果に影響を与えました。したがって、プロトコルのすべてのステップにおける正確さは、透明な組織を達成する成功のために不可欠です。この技術を用いて、我々はいくつかの脳構造におけるニューロンとアストロサイトの間の距離を測定する。このプロトコールにより、以前の研究よりも2〜3桁多くの細胞の分析が可能になりました。

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この研究では、神経細胞の軸索と小説（ASTRO）グリア共培養プラットフォームをセットアップする手順について説明します。この共培養系では、単一の軸索（と単一神経膠細胞）との間の直接的な相互作用の操作は、グリアシグナリング相互ニューロンのメカニズム解析を可能にすることが可能となる。...

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

このビデオは、コンパートメント化されたアプローチを使用して間接的なニューロン-アストロサイト共培養を確立する方法を示しています。この設定では、ニューロンとアストロサイトは空間的に分離されていますが、条件付けされた媒体を共有しています。アストロサイトが放出する神経栄養因子は、ニューロンの分化とシナプス結合の形成を促進し、ニューロンとグリアの相互作用を示唆しています。...

ニューロン-グリア相互作用を研究するための間接ニューロン-アストロサイト共培養技術

出典: Refaeli, R., et al., Investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains. J. Vis. Exp. (2022)...

透明化マウス海馬組織におけるアストロサイトと興奮性ニューロンの2光子顕微鏡法

中枢神経系の星状細胞は、有害な刺激に反応して機能的および構造的特性を変化させます。このレポートは、疾患状態または治療介入後の三次元アストロサイトの形態を評価するためのプロトコルを示しています。...

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。...

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

縦一直線に並べられたアストロ...

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

記載されているパイプラインは、ギガバイトより大きい電子顕微鏡データセットのセグメンテーション用に設計され、細胞全体の形態を抽出します。セルを3Dで再構築すると、個々のニーズに合わせて設計されたカスタマイズされたソフトウェアを使用して、3Dで直接定性的および定量的な分析を実行し、また、仮想現実を使用してビューの閉塞を克服することができます。...

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。...

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

このプロトコールは、マウス脳の自由浮遊組織切片の切片化、染色、および画像化のための方法を記載し、続いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイト領域オーバーラップまたはタイリングの分析の詳細な説明を記載する。...

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

学ぶCLARITY法を用いたマウス海馬におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の可視化手法。透明化した脳組織で300個以上の細胞を観察し、細胞間距離の測定と神経回路構造の解析が可能になります。

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

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