クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明
2022年3月31日
CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と脳クリアリングを組み合わせることで、多数のニューロンとアストロサイトを同時に調べることができます。
2013年に初めて記載されたクラリティ技術は、大量の細胞、血管、タンパク質なども厚い脳スライスで単一細胞分解能のサンプリングを可能にする組織クリアリング技術である。この技術は、脳全体を透明にすることによって、無傷の微視的構造の研究を可能にする。このプロトコルは、組織クリアのためのシンプルなチップと簡単なパイプラインです。
この技術は、脳組織に加えて、他のシステムにおける組織をクリアするために使用することができる。まず、パラフィルムを使用してチューブとキャップを密封し、キャップに2つの穴を穿刺します。次に、内径5ミリメートルのフレキシブルパイプと、その端に接続された19ゲージの針を使用して、タンクから窒素ガスを移送する。
チューブにパイプを取り付け、室温で30分間ガス交換を行うことで脱気を開始します。パイプを取り外し、すぐにモデリング粘土で穴を密封します。次いで、脱気密封管を37°Cの浴に3時間半移し、ヒドロゲル溶液を重合させた。
チューブから脳を取り出します。実験室用ワイプを使用して、脳の周りの重合ヒドロゲルを除去し、残留ゲルが脳の表面に付着したままにならないようにする。脳を、関心のあるすべての領域を含む厚いスライスに分割します。
スライスを最初の透明化溶液に入れ、摂氏37度で70RPMで24時間回転させてインキュベートする。その間に、脳を配置するための穴あきチューブを準備します。第2の透明化溶液を充填したビーカーに多孔管を攪拌装置上に入れる。
その後、ビーカーに脳を置き、漂白を防ぐためにアルミホイルで密封します。組織が透明になった後、脳をPBSTに移し、摂氏37度で24時間回転させながら摂氏37度でインキュベートする。溶液を新鮮なPBSTと交換し、さらに24時間インキュベーションを続ける。
その後、脳を室温で24時間PBSに移す。24時間後、PBSから脳を取り出し、屈折率整合溶液に移す。一晩摂氏37度で脳をインキュベートする。
まず、スライドの中央にサンプルを配置します。ホットグルーを使用して、スライドの端に組織とほぼ同じ高さの壁を作ります。角の1つに小さな隙間を残してください。
ホットグルー層が脳スライスの高さに近づいたら、屈折率マッチング溶液をサンプルに1〜2滴塗布して上面を湿らせ、気泡形成を防ぎます。ホットグルーがまだ液体である間は、カバースリップで上部を密封し、できるだけ均等に配置してから、チャンバーを屈折率マッチング溶液で満たします。熱い接着剤で隙間を塞ぎます。
ホットグルーの壁がスライドの境界を越えて伸びている場合は、伸びているエッジをカットします。撮影に油浸対物レンズを使用する場合は、カバースリップの上の壁にさらに2~3mmの接着剤を加えて、浸漬溶液を保持します。このプロトコルの後、脳組織はクリアされます。
マウス海馬のCA1領域におけるアストロサイトおよびニューロンの集団を視覚化するために、このプロトコルを使用して透明な脳スライスを調製した。すべてのアストロサイトはtdTomatoを発現し、興奮性ニューロンは核内でH2B-GFPを発現した。清澄化された組織のために調製されたチャンバーは、2つの光子または共焦点顕微鏡下での画像化に最適であった。
2つの光子顕微鏡を用いて、マウス海馬のCA1領域のクリアされた部分において300以上のアストロサイトが観察された。赤色の海馬アストロサイトと錐体細胞、緑色のソマタは目に見えて厚く、透明な組織であり、これら2つの細胞型間の空間的近接性を表している。走査型レーザー共焦点顕微鏡を用いて、興奮性ニューロンからの軸索束を半球全体にわたってトレースした。
緑色の束は背側海馬からスーパー乳房体に向かってトレースされた。赤い束は、母体から通気口海馬の起源に向かってトレースされました。温度、濃度、インキュベーション時間などの要因が、透明化手順の結果に影響を与えました。
したがって、プロトコルのすべてのステップにおける正確さは、透明な組織を達成する成功のために不可欠です。この技術を用いて、我々はいくつかの脳構造におけるニューロンとアストロサイトの間の距離を測定する。このプロトコールにより、以前の研究よりも2〜3桁多くの細胞の分析が可能になりました。
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概要
この研究では、CLARITY法とウイルスベクター転染を組み合わせて、マウスの海馬におけるニューロンとアストロサイトの空間関係を探求します。組織を透明にすることで、この技術は研究者がより多くの細胞を調査することを可能にし、細胞の組織と相互作用に関する洞察を明らかにします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 組織クリアリング技術
- 細胞イメージング
背景
- CLARITY技術により、細胞レベルで脳組織の可視化が可能になります。
- 完全な組織内のニューロンとアストロサイトの大規模な集団の分析が可能になります。
- この方法は、従来のイメージング方法と比較して、厚い脳切片の明瞭さを向上させます。
- この研究は、ニューロンの構造を理解する上で組織の透明性の役割を強調しています。
研究の目的
- マウスの海馬におけるアストロサイトとニューロンの構造的関係を調査すること。
- 様々な脳構造にわたる異なる細胞タイプ間の距離を測定すること。
- 細胞イメージングにおけるCLARITY法の有効性を示すこと。
使用した方法
- 研究では、脳切片の組織クリアリングにCLARITY技術を使用しました。
- アストロサイトと興奮性ニューロンを可視化するためにマウスの海馬組織が使用されました。
- マルチオミクスのワークフローは言及されませんでした。
- 主要なステップには、脱気、ハイドロゲルの重合、クリアリング溶液中でのインキュベーションが含まれました。
- 組織は二光子顕微鏡と共焦点顕微鏡を使用してイメージングされました。
主要な結果
- クリアされた海馬切片で300以上のアストロサイトが可視化されました。
- アストロサイトと興奮性ニューロンの空間的文脈が確立され、それらの近接性が示されました。
- クリアされた組織内のニューロン集団間の軸索束の重要な観察がありました。
- 様々な要因が組織の明瞭さに影響を与え、精密な方法論の必要性を強調しました。
結論
- この研究は、CLARITY法が脳内の細胞関係の可視化を大幅に向上させることができることを示しています。
- この発見により、ニューロンとグリア細胞の空間的組織の理解が深まります。
- この方法から得られた洞察は、ニューロンのメカニズムと潜在的な疾患モデルの研究に影響を与える可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
