Name: ショウジョウバエの蛹の解剖学的、固定、視覚化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶショウジョウバエの蛹の解剖・固定・視覚化手法。組織構造を保持しながら免疫組織化学やDNA染色が可能で、発生生物学研究に有用です。

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著者らは、蛹の創傷に使用されるレーザーアブレーションシステムを確立したM. Shane Hutson博士と、プロトコルの開発に対する彼の貢献とフィードバックに感謝したいと思います。この作業は1R01GM130130によってAPMとM. Shane Hutsonに支援された。JW は 2T32HD007502-21 によってサポートされていました。

ショウジョウバエメラノガスター(ショウジョウバエ)を、標準的なコーンミール糖蜜培地上で25°Cに維持した。研究は、EGFPタグ付きヒストンH2A蛹(w[*];P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a).ハエは公共のストックセンターから入手しました(材料表を参照)。
1.蛹の固定化
<ol><li>2インチの両面テープを顕微鏡スライドに貼り付けます。</li>
	<li>25°Cで隆起したバイアル中の白色の蛹を同定し、マーカーを使用してバイアルの外側の位置を示す。バイアルを25°Cに戻します。 注:白い蛹は、その不動性、白い色、および絶え間なく渦巻くことによって特徴付けられます。これらは、蛹形成(APF)、またはステージP18の0〜1時間後に形成される。</li>
	<li>12〜15時間後、解剖スコープを使用して、指示された蛹の3〜4匹を慎重に(それらをポップすることなく)取り除き、テープの横にある顕微鏡スライドに集める。 注:蛹は現在ステージP5になり、蛹の前端8にエバーテッドヘッドサックが見えます。</li>
	<li>蛹を少なくとも1つの蛹幅離してテープの上に置き、腹側を下にしておきます。</li>
	<li>接着剤の滴をパラフィンフィルム( 材料表を参照)または遠沈管の蓋の上に置きます。0.1-10 μLのピペットチップ(ピペットなし)の端を接着剤の滴に浸します。角から1 cm x 1 cm離れた24 mm x 60 mm(厚さ1.5)のカバースリップでピペットチップを2回タップし、蛹の長さの1/2までの接着剤接着剤のラインを作成します。</li>
	<li>0.2-2 μL (P2) ピペットを 2 μL に、200 μL (P200) ピペットを 200 μL にプリセットし、先端を合わせて 1x PBS + 0.1 mM Ca2+ で充填する準備ができるようにし、接触時に接着剤を急速に固化させます。</li>
	<li>頭の側面近くに鉗子( 材料表を参照)を挿入し、ケースを前部から後部まで静かに取り外します9。ケースをできるだけ取り外します。一対の鈍い鉗子で蛹の発達中の脚をつかみ、慎重にそのケースから蛹を引き抜きます。 注:蛹の腹側部分の小さな破裂は、この手順に有害ではありません。</li>
	<li>カバースリップの隅に蛹を置きます。</li>
	<li>鈍い鉗子で後腹部または発達中の翼の蛹をつかみ、持ち上げて、蛹の腹側を接着剤の線の下に置きます。</li>
	<li>P2ピペットに2 μLの1x PBS + 0.1 mMのCa2+ を素早く充填し、空気中に保持して、先端に小さな泡(0.25-0.5 μL)を形成するのに十分な大きさで排出します。</li>
	<li>胸郭の基部にある蛹の片側に溶液の小さな泡に触れ、反対側で繰り返す。 注:これにより、蛹を所定の位置に保持するために少量の接着剤が固まります。通常、すべてのソリューションは使用されません。</li>
	<li>P200ピペットに200 μLの1x PBS + 0.1 mMのCa2+を充填し、ピペットの先端を胸郭の上に置き、内容物を排出して蛹を完全に沈めます。接着剤の接着剤の残りの部分はすぐに固化します。</li>
	<li>約100μLのPBS溶液を除去し、蛹をかろうじて沈めてからすぐに次のステップに進むようにする。 メモ: 巻き取られていないサンプルの場合は、手順 1.1 から開始します。傷ついた部分的に解剖されたサンプルの場合は、ステップ1.5から開始します。レーザーアブレーション による 創傷は、以前に記載された14、21。固定化、解剖、および取り付けステップは、解剖顕微鏡を使用して行う必要があります。</li>
</ol>2. ノータムの解剖
<ol><li>ハンドルの片側を利き手の人差し指と中指に当てて、一対の微小解剖ハサミをつかみ、利き手の親指が切削力を加えるようにします(図2A、B)。</li>
	<li>非利き手の中指に対してハサミの首を安定させ、非利き手の薬指でカバースリップを固定します。</li>
	<li>背腹部の中央を刈り取って、約0.2〜0.5mmの小さな穴を作ります。いくつかの血リンパは通常こぼれ落ち、違反の良い指標です。</li>
	<li>外皮を後部から前部まで0.5〜0.75mm小さく切り込み、背部組織を囲んで隔離する。できるだけ平らな組織を作成するには, あまりにも腹側で切断しないでください;胸郭の背部「ドーム」のみを頭部および腹部の小さな部分とともに除去すべきである。</li>
	<li>蛹の反対側で後部から前部への切り傷を繰り返します。</li>
	<li>必要に応じて、解剖ステージを回転させて、ヘッドをきれいに切り取ることができます。 注:この段階では、背側外皮、またはnotumは、蛹の残りの部分から分離されます。それが分離されているように見えるが、容易に動かない場合は、notumの下のいくつかのカットがそれを取り除くのを助けることができます。</li>
	<li>カバースリップの中央に約200 μLの1x PBSを加え、ピペットチップをカバーガラスを横切って新しい液滴から元の液滴に静かにドラッグして、元の解剖液滴に接続するチャネルを作ります。</li>
	<li>一対の鈍い鉗子を使用して、孤立したノータムをカバースリップの中心に静かに押したりドラッグしたりして回転させ、内部側が上を向くようにします。液滴から組織を取り除かないでください。 注:後のイメージング中に接着剤接着剤の残骸がサンプルを塞ぐのを避けるために、ノータムを元の解剖部位から遠ざけることが不可欠です。</li>
	<li>腹部または頭部の部分に押し込んで、鈍い鉗子でノータムを押し下げます。200 μL のピペットから 1 対の鋭い鉗子および/または 1x PBS の穏やかな排出を使用して、残りの脂肪体、筋肉バンド、または血リンパ液 (存在する場合) を除去して、単層上皮を完全に露出させ、最終的な染色をより均一にします。解剖されたノータムは 、図3Aのようになるはずです。</li>
	<li>組織がきれいになったら、200 μLのピペットを使用してできるだけ多くのPBS溶液(破片および蛹の腹側部分とともに)を除去し、解剖スコープでモニタリングして小目が吸引されないようにします。</li>
	<li>液体の大部分が取り除かれたら、吸収組織を使用して、残りの接着剤と蛹、およびカバースリップに残っている他の破片を慎重に拭き取ります。 メモ:カバースリップに接着剤が残っている場合でも、背部組織自体よりも薄い限り、問題は発生しません。</li>
	<li>150~200 μLの4%PFA(1x PBS中)を加え、室温で20分間固定する。解剖速度に応じて、最初の蛹の固定中に1つ以上の蛹を解剖することができる。</li>
	<li>PFAを取り出し、1x PBSと交換して、ノータムを30秒間1回洗浄します。</li>
	<li>抗体染色を進める場合は、1x PBSまたは1x PBST(補足ファイル1)で5分間洗浄(3回)を行い、抗原が細胞内であれば組織を透過処理します。</li>
	<li>サンプルを1x PBS+0.02% NaN3 で加湿チャンバー内で一晩保存するか、または組織を染色する予定がある場合は、ブロッキング溶液(補足ファイル1)中で一晩インキュベートする。</li>
</ol>3.ノータムを染色する
注:抗体または細胞染色を使用した染色については、以下の手順に従ってください。- これは組織がカールする可能性があるため、ノートムを溶液から除去してはなりません。したがって、染色プロトコルをカバースリップ上で完全に実施するように適合させ、5分を超えるステップの間、加湿チャンバーに保管してください。解剖顕微鏡下でサンプルを監視することは、洗浄中の組織の偶発的な吸引を防ぐのに役立ちます。
<ol><li>細胞境界を可視化するために、ブロッキングバッファー+0.02%NaN3で希釈した1:8濃度で抗FasIII初代マウスIgG2a抗体(材料表を参照)を4°Cで一晩インキュベートする。</li>
	<li>過剰な一次抗体を200 μLの1x PBS + 0.02% NaN3 で室温で1時間洗い流します。</li>
	<li>200 μL の 200 μL の 1:200 濃度抗マウス IgGa2 をブロッキングバッファー + 0.02% NaN3 で室温で 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>過剰な二次抗体(3回)を200 μLの1x PBS + 0.02% NaN3 で室温で1時間洗浄します。</li>
	<li>核を可視化するには、サンプルを1 μg/mLのDAPIで45分間インキュベートし、染色が筋肉バンドを貫通するのに十分な時間を確保します。DAPI含有マウント培地中での固定は、この組織では有効ではない。</li>
	<li>余分なDAPI(3回)を200 μLの1x PBS + 0.02% NaN 3で室温で5分間洗い流し、その後200 μLの1x PBS + 0.02% NaN3を4°Cで一晩放置するか、すぐにマウントします。</li>
</ol>4. ノータムの取り付けと視覚化
<ol><li>染色に続いて、支持体付きの新しい24×60カバースリップ(トッパー)を用意する。 注:ノータムはドーム型であるため、完全に平らにすると、しわの寄った組織が歪んでしまいます。2つのカバースリップの間に隙間を作ると、ノータムは通常の形状を維持することができます。</li>
	<li>22 x 22カバースリップ(厚さ0番、厚さ約100 μm)で作られたスペーサーを使用して、トッパーの中央にマニキュアで約1 cm離して接着して、約200 μmのギャップを作成します。</li>
	<li>接着するには、スペーサーをトッパーに置き、スペーサーの遠位端をマニキュアの薄い層でペイントします。乾かします。 注:薄くて鼻水っぽいマニキュアのみを使用してください。厚いマニキュアは、カバースリップとトッパーの間に不要なスペースを追加します。</li>
	<li>試料からできるだけ多くの水溶液を除去する。</li>
	<li>直ちに2滴(約100μL)の退色防止マウント培地( 材料表を参照)をサンプルに塗布します。</li>
	<li>必要に応じて、清潔で鋭い鉗子を使用して、色あせ防止マウント媒体液滴の中央にノータムを配置します。</li>
	<li>目底付きのカバースリップを、薄いフォーム片(カバースリップボックス内の梱包材から切り取ったもの)などの約10 x 40 mmの支持体の上に置き、サンプルが作業面に付着しないように持ち上げます。</li>
	<li>解剖スコープの下で、トッパーをサンプルの上にゆっくりと下げます。退色防止マウント媒体がトッパーに当たったら、ゆっくりと離し、毛細管現象がトッパーを下に引っ張るようにします。 メモ: 最初の数秒以内に、ノータムを損傷することなく、カバースリップの位置を少し調整できます。</li>
	<li>別のフォームをトッパーの上に置き、標準の顕微鏡スライドをウェイトとして使用して、サンプルカバースリップ、トッパー、スペーサーの間に退色防止マウント媒体を静かに同軸にします。</li>
	<li>5〜10分後、吸収組織を使用して、カバースリップの端にそっと触れて、余分な退色防止マウント媒体を吸い取ります。</li>
	<li>カバースリップの各角にマニキュアをそっと塗り、それらを一緒に接着します。乾いたら、カバースリップのすべての端をペイントして密封します。カバースリップをずらして背部組織を損傷することが多いため、最初にすべてのエッジをコーティングすることは避けてください。</li>
	<li>蛍光顕微鏡( 材料表を参照)で、背側および/または腹側を通して小欠を視覚化します。</li>
</ol>

<ol><li>Valon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+epithelial+sealing+is+an+emerging+property+of+local+ERK+feedback+driven+by+cell+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination.</a> Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

重要なステップ 3つのステップを最適化すると、このプロトコルの成功が劇的に向上します。まず、ステップ1.5で、カバースリップに塗布された接着剤で惜しまない。あまりにも多くの接着剤が追加されると、蛹は固化した接着剤接着剤の厚い層に埋もれて解剖が不可能になり、ノータム自体を覆うと、接着剤接着剤はサンプルからの光を遮蔽する。第二に、ステップ2.3-2.6の間に、できるだけ多くの側方組織を除いて、小節の上部ドームだけを除去するようにしてください。含まれている場合、側方組織は取り付け中に圧縮され、結節の中央が内側に座屈し、しばしば高開口数対物レンズの作動距離の外側に配置される。第3に、洗浄ステップ2.9の間、単層上皮を損傷しないように細心の注意を払わなければならない。組織に大きな部分が欠落しているか、またはシグナルを検出できない場合、このステップは責任を負う可能性があります。
トラブルシューティング 問題1:取り付け後、解剖中に蛹が両面テープから離れる。これは、特に初心者にとって一般的な問題です。最善の治療法は、蛹のケースの外側が完全に乾燥している/食べ物の破片がないことを確認することです。鈍い鉗子のペアで食べ物を取り除き、ケースを10〜15分間空気乾燥させると、テープに付着するのに役立ちます。あるいは、非利き手と一対の鈍い鉗子を使用して、解剖中に蛹をテープに押し付けます。問題が解決しない場合は、5〜10μLの小さなマニキュアをケースの後端の基部に塗布し、硬化させることで、一般的に最も手に負えない蛹にも十分な接着力が得られます。
問題 2: ステップ 2.3 で Notum が崩壊するか、外皮を介した最初の違反がスムーズではありません。外皮が破れにくい場合は、固定化ステップからの接着剤が多すぎる可能性があります。解剖した蛹を接着剤の少ない接着剤に入れると、この問題が改善されます。さらに、微小解剖ハサミが鋭利であることを確認してください。鈍いはさみは外皮に切り込むことができず、内側に崩壊する傾向があります。血リンパが蛹からこぼれたら、切断刃の1つが蛹を変形させることなく蛹に入ることができることを確認してください。結節が崩壊し、刃が蛹に入らない場合は、刃が蛹に入るまで切り続けます。
問題 3: 手順 2.4 で、はさみが外皮をつかむか、引きずります。はさみが外皮を捕まえたり引きずり始めたりし始めると、蛹の反対側に切り替えて外皮を「緩める」ことに進むことがしばしば役立ちます。さらに鈍い微小解剖ハサミは、外皮を通してきれいな切断を達成することを困難にし、研いだハサミを使用しなければならない。
問題4:染色中にサンプルが誤って吸引される(ステップ3.1〜3.6)。解剖されたノータムは透明であるため、見るのが難しいです。コントラストを保つために、カバースリップの下に濃い青または黒のシートを配置すると便利です(古いピペットチップホルダーラックがうまく機能します)。さらに、すべての溶液変化は、解剖顕微鏡下で行うことができる。
問題 5: シグナルが検出されない/斑点のあるシグナルが検出される。シミ特有の問題を除外した後、シグナルが検出されなかったり、斑点があったりする場合は、ステップ2.9(クリーニング)が原因である可能性があります。不在または斑点状の信号は、洗浄中の上皮組織の損傷および除去に由来する可能性がある。逆に、筋肉バンド/脂肪体細胞が除去されない場合、周囲の組織に対する結節への汚れや抗体の拡散を制限する可能性があるため、筋肉バンド/脂肪体細胞からの閉塞によって悪いシグナルが発生する可能性があります。組織が損傷している場合は、洗浄中に穏やかであることが最善の解決策です。代わりに、汚れが見えるが斑点がある場合は、洗浄ステップに専念する活力/時間を増やして、筋肉と脂肪体をできるだけ多く取り除くことをお勧めします。さらに、汚れの持続時間を長くすることは、より良い洗浄でこの問題を解決するのに役立ちます。
問題6:イメージング中に結節組織が反ったり、しわが寄ったりする。組織の反りとしわは2つの原因から来ています。まず、取り付け時にノータムを圧縮すると、座屈して反りが生じます。最善の解決策は、ドームができるだけ短く、カバースリップスペーサーの間に収まるように、できるだけ多くの側方組織を除去することです。第二に、解剖中に結節が曲がった場合、この曲げは取り付け中にまっすぐにならないので、解剖中に結節が反らないように特別な注意を払わなければならない。結節の偶発的な曲げは、外皮を蛹の残りの部分から切り離すときに最も一般的です。解剖はさみを蛹としてサンプル平面に保持するのではなく、蛹に対して角度をつけてはさみを持つのは魅力的です。しかし、角度のあるハサミは、切断時に外皮が平らなままではなく上向きに座屈する原因となります。
既存の方法、制限、および将来のアプリケーション Wangら20 は、蛹上皮の単離のための同等の解剖プロトコルを報告した。この技術は、蛹がそのケース内にとどまり、メスで急速に二分されることを必要とする。このプロトコルは、ライブイメージングでは蛹の症例の大部分を除去する必要があるため、以前にライブイメージングされたサンプルと互換性がありません。蛹は剛性に欠けるため、症例外の蛹二分が組織を骨折させ、このプロトコルの作成を鼓舞した。ここで詳述する技術は、結節の単離および固定を可能にし、凍結切除、 in situ ハイブリダイゼーション、または電子顕微鏡法などの幅広い他の方法の最初のステップとして使用することができる。
この手法にはいくつかの制限があります。第1に、結節の解剖、固定、および染色は、結節内の蛍光標識されたタンパク質をライブイメージングするよりも時間がかかり、これは、蛹の症例9、23を除去するために単純な解剖のみを必要とする。第二に、他のショウジョウバエ組織の解剖と比較して、この解剖は、薄くて壊れやすい組織および疎水性のキューティクルのためにより困難である。 ショウジョウバエ 上皮のタンパク質を単に可視化するには、固定胚、幼虫の翼の円盤、または卵巣上の免疫組織化学がより容易である。しかし、この技術により、ライブイメージングの力を固定や染色と組み合わせることができ、一度習得すると強力なツールになります。
解剖/固定技術には、ライブイメージングよりもいくつかの利点があります。基底(内部)構造は、基底図でよりよく解決することができる(図5L、J)。最も重要なのは、ライブイメージングは、遺伝的に供給されなければならない蛍光色素に限定されており、多くの場合、長い遺伝子交差スキームを必要とすることです。対照的に、本プロトコールは、染色、免疫組織化学、および解剖および固定を必要とする他の技術の適用を可能にする。これにより、組織内でプローブされるシグナルの数が劇的に増加し、実験結果を得るまでの時間が短縮される可能性があります。

ショウジョウバエメラノガスターの蛹の小豆は、動物が不動であり、この段階で透明なキューティクルを持っているため、過去10年間でライブイメージング研究にますます使用されています1,2,3,4,5,6,7。しかし、蛹の結節は解剖と固定が難しく、抗体や細胞染色で生きたイメージング研究を補完することは困難です。この研究の全体的な目標は、新規または以前にライブイメージングされたサンプル上で抗体および細胞染色のために蛹結節を解剖および固定するための再現可能なプロトコルを作成することです。
幼虫が変態を開始すると、表皮は幼虫のキューティクルから引き離され、硬い蛹の症例8を形成する。幼虫のボディプランを分解し、新しい大人のボディプランを開発します。この間、蛹は動けず、ライブイメージングに最適です。一般的に画像化される組織の1つは、背側胸郭に形成される成体の単層上皮である蛹の小欠石である。この結節は、蛹の症例9を除去するための簡単な解剖の後に視覚的にアクセス可能である。その後、動物全体をマウントすることができ、結節を数時間または数日間生きた画像化することができ、発生中、恒常性、および創傷後の上皮細胞挙動を研究するのに理想的な組織となる10,11,12,13,14。しかし、ノータムは壊れやすく、疎水性の薄い透明な大人のキューティクルで覆われているため、解剖して固定するのが困難です。この疎水性のキューティクルは、体の残りの部分から取り除かれたときに水溶液中でカールしやすくなります。したがって、ノータム解剖および固定はまれにしか報告されておらず、解剖はしばしば記載されていない15、16、17、18。文献に詳細なプロトコルがなければ、ショウジョウバエの研究者が生きたイメージングを蛹の染色で補完することは非常に困難です。
この技術は、レーザーで傷つけられたものを含め、以前にライブ画像化されたサンプルを再現性よく解剖および固定することを目的としています。ライブイメージングは蛹症例の除去を必要とするので、この解剖技術は、蛹症例内で蛹をピンダウンまたは二等分する以前のプロトコルとは異なり、前蛹症例を除去することから始まる4、19、20。結節は脆弱な組織であり、創傷はその脆弱性を悪化させる可能性がある。したがって、この繊細な組織をサポートするために、小欠頭の外皮(上皮および付着した透明な成体キューティクル)および頭部および腹部の一部は、常に水性環境に沈めながら、蛹の残りの部分から離れて解剖される。この方法は、組織がカールし、使用不能になる可能性を低減する。この技術は、創傷後30分(図1E-H)および創傷後3時間(図1I-L)に創傷した結節組織を染色することに成功した。このプロトコルは、ノタム発生または創傷修復の期間中有効であると予想される。現在の技術は、蛹の鯨のライブイメージング能力と豊富な利用可能な免疫組織化学試薬を結びつけたい研究者にとって有用であろう。

<table><tbody><tr><td>&frac12;&rdquo;スコッチパーマネント両面テープスコ</td><td>ッチ3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 & マイクロ;L uTIPピペットチップ</td><td>Biotix</td><td>M-0011-9FC</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm No. 0 厚さカバースリップ</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>1207Z28</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm カバースリップ</td><td>コーニング</td><td>2980-246</td><td></td></tr><tr><td>3M VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>プロトコルで「接着接着剤」と呼ばれる</td></tr><tr><td>抗FasIIIプライマリマウスIgG2a</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク</td><td>7G10</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>c79-500</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-206</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tip</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>No. 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>No.11254-20</td><td>頻繁に使用され、鋭利でない鉗子、または砥石で鈍くなっている</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ダブルフロスト顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>蛍光光源</td><td>ルーメンコール</td><td>セレスタ 90-10512</td><td></td></tr><tr><td>フライストック: EGFP タグ付きヒストン H2A</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター</td><td>24163</td><td></td></tr><tr><td>フライ バイアル フォーム プラグ "フラッグス"</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>加湿チャンバー:水で飽和した濾紙で裏打ちされたホイル包装された小さな容器</td><td>コール・パー</td><td>マー759075D</td><td>50mlの水で満たされたコール・パーマー・キュベット759075Dが入った発泡スチロールの箱から、素晴らしい加湿チャンバーを作ることができます。</td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>プロトコルで「吸収組織」と呼ばれる</td></tr><tr><td>Nikon Ti2 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney プラスチック包装</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA) 16%</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックバイアル</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-114</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>19038-1000</td><td></td></tr><tr><td>ステレオマイクロダイセクションスコープ</td><td>カール・ツァイス</td><td>STEMI 2000</td><td></td></tr><tr><td>バンナス スプリングシザー</td><td>ス ファイン・サイエンス・ツール</td><td>15000-00</td><td>新品または研ぎたてのハサミ</td></tr><tr><td>ベクタ・シールド</td><td>・ベクター・ラボラトリーズ</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>プロトコルVecta Shield with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr>で「褪色防止封入剤」と呼ばれています。<tr><td>X-Light V2 スピニングディスク</td><td>クレスト光学系</td><td>V2 L-FOV</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエの蛹の解剖学的、固定、視覚化

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

ショウジョウバエのメラノガスターの蛹は、変態中に数日間動かず、その間に薄い透明な成体外皮を有する新しい体を発達させる。その不動性と透明性により、in vivoライブイメージング実験に最適です。多くの研究は、そのアクセシビリティと比較的大きなサイズのために、蛹の結節の背側上皮単層に焦点を当てている。上皮力学および発達の研究に加えて、ノタムは創傷治癒を研究するのに理想的な組織であった。損傷後、上皮修復プロセス全体を6〜12時間にわたるライブイメージングによってキャプチャすることができる。ライブイメージングのためのnotumの人気にもかかわらず、固定notumサンプルを使用した発表された研究はほとんどありません。固定および染色は、他のショウジョウバエ組織のほとんどすべてに共通のアプローチであり、単純な細胞染色および抗体の大きなレパートリーを利用する。しかし、蛹の乙骨は壊れやすく、身体から取り除いた後にカールや歪みを起こしやすく、ライブイメージングを補完することは困難です。このプロトコルは、無傷でレーザー巻き付け後の両方で、蛹の小欠損を固定および染色するための簡単な方法を提供する。この技術では、蛹の腹側をカバースリップに接着して蛹を固定し、結節を慎重に除去し、固定し、染色する。結節上皮は、スライド上または2つのカバースリップの間に取り付けられ、組織の背側または腹側からの画像化を容易にする。

提示された技術は、創傷されていない結節(図1A−D)において良好に作用し、組織の発達および恒常性、例えば、倍数体メカノ感覚剛毛細胞18の形成、または上皮細胞10の前部から後方の流れの調査を可能にする。このプロトコルは、Histone2-EGFPなどの内因性蛍光色素を用いて損傷に対する細胞応答をライブで分析できるレーザーアブレーションノタム(図1E-L)にも適用可能です(図1B、F、J)。免疫組織化学による後染色(ステップ3)は、細胞境界を標識するファシクリンIIIなどの多くの特徴を明らかにすることができる(図1C、G、K)。さらに、DAPI(図1A、E、I)などの定量染色剤を使用して、創傷誘発性倍数体22を含むDNA含量変化を評価することができる。
現在のプロトコルは、長期間のライブイメージング実験の後に使用できるため、特に有益です。蛹は動かないので、何時間も画像化することができます(図4A、B)。重要なことに、このプロトコルは、解剖後の創傷上皮の全体的なアーキテクチャまたは形態にかなりの変化を引き起こさない(図4B、C)。したがって、組織内の特徴を長期間画像化し、免疫組織化学または細胞染色でさらに調査することができた。
組織の奥深くのイメージングは、その不透明度のために複雑であり、ショウジョウバエはワックス状のキューティクル8でコーティングされているため、ディープイメージングがさらに困難になります。しかし、この技術では、解剖したノータムを2つのカバースリップの間に配置することができ、上皮単層の両側(キューティクルを通る頂端側(図5A-D)および/または体腔に面した上皮の基底側(図5E-H))を画像化することができる。これらの異なるビューは、組織内の異なる構造を視覚化するのに理想的です。例えば、頂端図は、キューティクルのすぐ下にある上皮細胞の境界と核を視覚化するのに理想的です(図5A-D)。基底図では、これらの頂端信号はあまり見えません(図5E-H)。しかしながら、創傷縁部に基底構造が観察される(図5J、L黄色、白矢印)。これらの基底構造は、頂端図よりも基底図の閉塞が少ないため、はるかに明るくなります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig01.jpg"> 図1:ショウジョウバエの蛹の小節を解剖、固定、染色した。(E-H)、レーザーアブレーション後30分で結び目を傷つけた。(I-L)レーザーアブレーションの3時間後に創傷したnotum。(A、E、I)DAPI染色は核を示す。(B、F、J)ライブイメージングに使用されるトランスジェニックHistone2-EGFPは、固定および染色後に可視である。(C,G,K)抗FasIII抗体は、抗体染色が固定された小欠頭に良好に作用することを示す。(D、H、L)マージされた画像。画像は回転ディスク顕微鏡を使用して40倍の対物レンズで撮影され、Zスタックの最大強度投影は0.3μmのZスライスで示されます。A ~ D は 263 個の Z スライスを表します。E-H は 195 スライスを表します。I-Lは53個のZスライスを表す。オレンジ色の破線は創傷縁を示す。Lのスケールバーは25μmで、A-Lに適用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig02.jpg"> 図2:小欠核解剖のための手の配置。(A-B)微小解剖ハサミを保持するための手の配置の左右図。手の震えを防ぐために、はさみの首は非利き手の中指に置かれます。はさみは、小目組織の反りを避けるために顕微鏡スライドに平行にする必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig03.jpg"> 図3:正しく解剖された小欠頭とカールした小欠頭(A)蛹の小欠頭は、解剖後、カールしておらず、固定の準備ができている。(B)蛹のノータムは、1x PBSから取り除かれた後、それ自体にカールし、使用不能になった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig04.jpg"> 図4:固定前画像と固定後画像はほぼ類似しています。 核内にHistone2-EGFPを発現する蛹の結節を、(A)アブレーション前の生、(B)レーザーアブレーションの3時間後に画像化した。(C)プロトコルに記載されているように、notumを回収し、解剖し、固定し、固定後に再画像化した。創傷部位には赤い星が付いています。画像は、回転ディスク顕微鏡を用いて40倍の対物レンズで撮影され、Zスライスは0.3μmごとに撮影された。捲回前の34個のZスライス(A)、創傷3時間後の48個のZスライス(B)、および解剖、固定、および染色後の103個のZスライス(C)の最大強度突起を示す。Cのスケールバーは25μmで、A-Cに適用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63682/63682fig05.jpg"> 図5:負傷した小欠頭の頂端側と基底側を画像化。同じ傷ついた蛹の小欠石がすべてのパネルに示されています。傷口には赤い星がついています。オレンジ色の点線は創傷縁を示す。(A-D)ノータムは、キューティクルを通して頂端側から画像化される。(E-H)ノータムは基底内部側からイメージ化される。(I-L)トップパネルは、上皮シートが白い三角形で示されている上皮シートで、頂端側を上にして、結節のX-Z画像を示しています。オレンジ色の線は、X-Yスライスの頂端 - 基底平面を示し、下のパネルに示されている。下のパネル内では、オレンジ色の線が上記のX-Z画像の平面を示しています。(I)頂端に画像化されたノタム - 頂端スライス。上部のX-Z図は、頂端上皮シート(白い三角形)の正確な画像化を示しています。このビューは、ライブイメージングビューに相当します。(j)頂端に画像化されたノタム−基底スライスは、頂端組織によって部分的に閉塞される。黄色の矢印(可能な筋肉バンド)および白い矢印(可能な血球)によって示される他の組織は、基底側に見える。(k)基礎的に画像化された結節−頂端切片、基底組織および創傷かさぶた(暗い中央領域)によって部分的に閉塞される。(L)基礎的に画像化されたノタム - 基底スライス。このビューは、黄色と白の矢印で示された基底組織を最もよく示しています。A,E:DAPI 染色、B、F: Histone-EGFP、C、G: FasIII 染色。画像は、回転ディスク顕微鏡で20倍の対物レンズで撮影されました。Zスライスは0.9μmごとに採取した。A-Dは、19スライスの最大強度投影を示す。E-H は、17 スライスの最大強度投影を表します。D、H、L の 25 μm スケール バーは、それぞれ A-D、E-H、I-L に適用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/63682fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:溶液および緩衝液の調製。 次の溶液のレシピが詳述されています:1xPBS、1x PBST、ブロッキング溶液、およびパラホルムアルデヒド固定剤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63682/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコールは、 ショウジョウバエ の蛹の結節の固定組織の調製および視覚化を詳述する。それは無傷または創傷組織のいずれかに使用することができ、組織の元のアーキテクチャが保存される。解剖、固定、および染色の手順はすべてこの記事で説明されています。

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

このプロトコルは、ショウジョウバエの蛹の結節に対して、以前に傷付けられ、ライブイメージングされた後でも、組織のアーキテクチャを混乱させることなく免疫組織化学を行うことを可能にするため、重要です。この技術により、すでに利用可能な幅広い抗体染色を利用して、結節上皮の細胞、構造、およびタンパク質を染色することができます。この手法を免疫化学やDNA染色に利用しています。しかしながら、この解剖は、in situハイブリダイゼーションなどの他の技術の出発点として使用することができる。蛹は小さくて繊細であるため、このプロトコルは難しい場合があり、解剖を行うには安定した手が必要です。そして、それは経験で簡単になるので、重要なものの前に重要でない蛹で練習してください。まず、ステージP5で解剖スコープを使用して3〜4匹の蛹を慎重に取り除き、テープの横にある顕微鏡スライドに集めます。次に、蛹を少なくとも1つの蛹幅を離してテープの上に置き、腹側を下にします。次に、接着剤の滴をパラフィンフィルムの上、または遠沈管の蓋に入れます。次に、0.1〜10マイクロリットルのピペットチップの端を接着剤の滴に浸し、カバースリップでピペットチップをコーナーから1センチメートルずつ2回タップし、蛹の長さの約半分の接着剤のラインを作成します。次に、P2ピペットを2マイクロリットル、P200ピペットを200マイクロリットルの容量でプリセットし、チップでフィットさせます。次に、頭の側面の近くに鉗子を挿入し、前部から後部にかけて、できるだけ多くの瞳孔ケースを静かに取り外します。次に、一対の鈍い鉗子で蛹の発達中の脚をつかみ、慎重にそのケースから蛹を引き抜きます。カバースリップの隅に蛹を置きます。鈍い鉗子で後腹部、または発達中の翼の蛹をつかみます。蛹の腹側を持ち上げて、接着剤のラインに入れます。P2ピペットを、0.1ミリモルのカルシウムを含む2マイクロリットルの単一強度PBSで素早く満たし、それを空気中に保持し、先端に小さな気泡を形成するのに十分な程度に排出する。胸郭の基部にある蛹の片側に溶液の小さな泡に触れ、次に反対側で手順を繰り返します。次に、P200ピペットに200マイクロリットルの単強度PBSと0.1ミリモルのカルシウムを充填し、ピペットの先端を胸郭の上に置き、内容物を排出して蛹を完全に沈めると、残りの接着接着剤はすぐに固まります。次に、約100マイクロリットルのPBS溶液を除去して、蛹がかろうじて水没するようにしてから、すぐに次のステップに進みます。ノータムを解剖するには、一対のマイクロ解剖ハサミをつかみ、ハンドルの片側を利き手の人差し指と中指に押し付けて、利き手の親指が切削力を加えるようにします。次に、非利き手の中指に対してハサミの首を安定させ、カバースリップを補強しながら、非利き手の薬指で安定させる。次に、背腹部の中央を刈り取って、約0.2〜0.5ミリメートルの小さな穴を作ります。背部組織を単離するには、外皮を後部から前部まで0.5〜0.75ミリメートルの小さな切り込みを入れ、最後には背部組織を包囲する。さらに、蛹の反対側で後から前への切り傷を繰り返す。解剖ステージを回転させ、必要に応じてヘッドをきれいに切断できるようにします。ノータムが簡単に移動されているかどうかを確認して、ノタムが分離されているかどうかを確認します。カバースリップの中央に約200マイクロリットルの単一強度PBSを加え、ピペットチップをカバーガラスを横切って静かにドラッグして、元の解剖液滴に接続するチャネルを作り、新しい液滴から元の液滴に。一対の鈍い鉗子を使用して、孤立したノータムをカバースリップの中心に静かに押したりドラッグしたりして回転させ、内部側が上を向くようにします。腹部または頭部に押し込んで、鈍い鉗子でノータムを押し下げます。一対の鋭い鉗子と単強度PBSの穏やかな排出を使用して、200マイクロリットルのピペットから、残りの脂肪体、筋肉バンド、またはヘムリフトを除去し、単層上皮を完全に露出させた。組織がきれいになったら、200マイクロリットルのピペットを使用してできるだけ多くのPBS溶液を除去し、解剖スコープで監視して、小目が吸引されないようにします。最大限の液体除去後、吸収組織を使用して、カバースリップ上の残りの接着剤、瞳孔死体、およびその他の破片を慎重に拭き取ります。次に、150〜200マイクロリットルの4%PFAを加え、室温で20分間固定する。そして解剖速度に応じて、最初の蛹が別々のカバースリップに固定されている間に、さらに1〜3匹の蛹を解剖することができます。PFAを取り出し、これを単強度PBSと交換し、30秒間に1回ノータムを洗浄した。抗体染色を進める場合は、5分間洗浄を3回行い、単一強度PBSまたはPBST中で、抗原が細胞内であれば組織を透過処理する。サンプルは、加湿チャンバー内で一晩0.02%アジ化ナトリウムを含む単一強度PBSに保存することができる。染色後、トッパーと呼ばれる新しいカバースリップを支持体とともに準備する。トッパーの中央に約 1 cm 離れた 22 x 22 のカバー スリップから作られたスペーサーを使用して、約 200 マイクロメートルのギャップを作成します。接着するには、スペーサーの継ぎ目を中心から最も遠い、マニキュアの薄い層で塗り、乾燥させます。サンプルからできるだけ多くの水溶液を取り出し、直ちに2滴の退色防止マウント媒体をサンプルに塗布します。必要に応じて、清潔で鋭い鉗子を使用して、色あせ防止マウント媒体液滴の中心にノータムを配置します。カバースリップをノータムとともに約10×40ミリメートルのフォーム支持体の上に置き、サンプルが作業面に付着しないようにサンプルを持ち上げます。解剖スコープの下で、トッパーをサンプルの上にゆっくりと下げます。退色防止マウント媒体がトッパーに当たったら、静かに離し、毛細管現象がトッパーを下に引っ張るようにします。別のフォームをトッパーの上に置き、標準的な顕微鏡スライドを重りとして使用して、サンプルカバースリップ、トッパー、スペーサーの間に退色防止マウント媒体を静かに同軸にします。5~10分後、吸収組織を使用して、カバースリップの端にそっと触れて、余分な退色防止マウント媒体を吸い取ります。カバースリップの各角にマニキュアをそっと塗り、密着させます。カバースリップがずれて背部組織を傷つけないようにするには、まずエッジのコーティングを避け、コーナーのマニキュアが乾いたら、カバースリップのすべてのエッジをペイントしてシールします。このプロトコルは、抗体および細胞染色剤を使用して、固定サンプルのイメージングを可能にする。このプロトコルは、以前に傷付けられ、ライブ画像化されたサンプルで使用できます。ライブ画像と固定画像を比較すると、プロトコルが組織アーキテクチャおよび形態を保存することが示される。このプロトコルは、解剖されたnotumの異なるビューを可能にする。頂端ビューは、キューティクルの下の上皮細胞の境界と核を視覚化するのに理想的です。基底図は、創傷縁における基底構造をよりよく明らかにする。解剖中に結節を曲げたり反らせたりしないでください。横端を避けて平らな部分を切断します。腹側に近づきすぎないようにしてください、さもなければそれは取り付けの間に変形するでしょう。瞳孔を解剖した後、電子顕微鏡や断面など、他の多くの技術を適用することができます。これらの技術により、以前に画像化された構造を非常に詳細に調査することができます。

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