マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価

敗血症は、微生物の侵入または組織損傷に対する調節不全の宿主免疫応答であり、感染または損傷のそれから離れた部位で器官損傷をもたらす。一般の人々は、COVID-19パンデミックの間、この障害をより認識するようになりました。2017年には、世界中で4,890万件の敗血症発生率と1,100万人が死亡し、世界の全死亡のほぼ20%を占めています。

予想通り、ほとんどの症例は病院にいます。実際、ある研究では、敗血症のICU患者からの陽性分離株のほぼ62%がグラム陰性生物であることが判明しました。いくつかのモデルがあり、敗血症の一般的に使用されるマウスモデルのいくつかは、LPS誘発性エンドトキシー血症、盲腸結紮および穿刺モデル、および単細菌感染モデル系を含む。

当研究室では、マウスモデルシステムを標準化し、サルモネラ・チフス菌を用いて腹膜敗血症を誘導している。サルモネラ・チフムリウムはグラム陰性敗血症の臨床的に関連する状態を模倣する細胞内病原体であるため、このモデルは他のモデルよりも有利である。このモデルにおける腹膜炎敗血症の結果は、感染後96時間以内に100%の死亡率で全身性である。

したがって、このモデルは、炎症性宿主応答を研究する上で有用である。このモデルでは、敗血症は、8〜10週齢のC57BL/6マウスに50万CFUのサルモネラ・チフス菌を腹腔内注射することによって誘発される。全身感染は、感染後約16時間で臓器細菌負荷を評価することによって確認することができる。

サルモネラ・チフムリウムを用いた実験には、BSL-2施設、およびBSL-2ガイドラインの遵守が必要である。適切なPPEを使用し、安全性を確保し、標準的なBSL-2バイオハザード処理方法に従うように注意する必要があります。すべての実験は、機関の動物倫理委員会によって承認されています。

サルモネラ・チフス菌の培養調製。100マイクロリットルのサルモネラ・チフムリウムNCTC 12023グリセロールストックを3mLのLBブロスに加える。毎分160回転、摂氏37度で一晩培養します。

LBブロス中で一晩生育培養した培養液のストリーク50マイクロリットルを、サルモネラ赤痢菌寒天プレート上に、摂氏37度で12時間インキュベートした。縞模様のSS寒天プレートから単一のコロニーを、マイクロチップを用いて拾い上げる。マイクロチップを3mLのLBブロスに排出し、摂氏37度で160RPMで一晩培養した。

0.1 mLの細菌培養物を50 mLのLBブロスに加え、摂氏37度で、160RPMのシェーカーインキュベーター内で、3〜4時間インキュベートし、増殖の対数段階に達する。LBブロスを用いて培養物を2倍に希釈する。分光光度計で600ナノメートルの波長の光における培養物の光学密度を測定する。

ODが1に達したら、1.5mLマイクロフュージチューブに1mLの培養液の2つのアリコートを作る。チューブを7, 750 Gで15分間遠心分離する。この上清を捨て、ペレットを1mLの1XPBSで2回洗浄した。

チューブを7, 750 Gで15分間遠心分離する。ペレットを0.5 mLの1XPBSに、2つの異なる1.5 mLマイクロフュージチューブに再懸濁する。両方のチューブからの懸濁液を、1つの1.5mLチューブに結合し、今、収容し、約2つに10を掛けて、1mLあたり8個のコロニー形成単位の累乗に上げた。

原液を希釈して10パワー6CFU/mLの菌体懸濁液を調製する。重要な注意点として、実験を開始する前に、実験室でODに対応するCFUを最適化し、OD1のCFUを決定する。マウスと感染症。

感染の日に、片手でマウスを持ち、腹部の皮膚を70%エタノールで拭き取り、腹壁のアクセシビリティを向上させるために後肢を広げます。1 mLシリンジの助けを借りて、パワー6 CFU/mL細菌懸濁液に上げた10の0.5 mLを腹腔内に注入する。感染後、培養物をプレート注入した実際のCFUをチェックし、これは0.5mLあたり0.2〜0.8百万CFUの間で変化し得る。

臓器のCFU評価。マウスを二酸化炭素窒息法を用いて屠殺した。感染したマウスを犠牲にした後、70%エタノールに浸した綿片で腹部を拭きます。

腹部の皮膚を切り開きます。腹膜洗浄液の収集方法に関するビデオプロトコルについては、RayとDittleの記事を参照してください。腹腔を切り開き、目的の器官を集める。

このビデオでは、肝臓からの臓器CFUの列挙を実証しています。肝臓は、敗血症のこのモデルにおいて、広範な組織病理学的損傷を受ける。肝臓の小片を切って、それをマイクロフュージチューブに入れます。

これは、次のステップに進む前に、氷に2〜3時間保存することができます。ピースの重量を量り、マイクロフュージチューブに移します。好ましくは、適切な均質化のために、約10〜15mgの重さの小片を切断する。

チューブに0.5mLの1XPBSを加え、ハンドホモジナイザーを使用して臓器を均質化する。臓器が完全に均質化されていることを確認してください。0.5 mL の 1XPBS を加えて、体積を 1 mL にします。

チューブを200Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を新鮮なマイクロフュージチューブに集めます。96ウェルプレートに、10の検出力マイナス1、および10の検出力マイナス2の希釈液を準備します。

50マイクロリットルの希釈液を新鮮なSS寒天プレート上に広げ、プレートを摂氏37度で12時間インキュベートした。各条件に出現するコロニーの数をカウントし、以下の式を用いて臓器重量でデータを正規化する。CFU/mgはコロニー数に等しく、20を掛け、希釈倍率を掛け、全体を臓器重量(mg)で割った値である。

なお、数20は、プレートあたりのコロニーをCFU/mLに変換するために、式で使用されています。この数値は、播種した培養物の所与の体積の量を1mLで割ることによって到達する。この場合、50マイクロリットルである。

たとえば、SS寒天プレートで10個のコロニーが見つかった場合、10乗の50マイクロリットルから均質化した臓器の希釈液1個を引いたものが広がり、10mgの重さが広がると、CFU/mgは100に20を掛け、10を掛け、全体を10で割った値に等しくなり、2000CFU/mgに等しくなります。腹膜滲出液中の様々な免疫細胞集団のフローサイトメトリー分析。前述のように腹膜細胞を、レイおよびディトルによって収集する。

腹膜洗浄液から細胞ペレットを再懸濁し、10%FBSを添加した1mLのRPMIに再懸濁する。腹膜洗浄液中の全細胞数を列挙し、血球計数器を用いる。すべてのチューブが2〜5に10を掛けて5セルの電力に上げるようにセル番号を調整します。

セルを摂氏 4 度で 200 G で 10 分間スピンダウンします。上清を捨てる。1XPBSで細胞を一度洗ってください。

細胞を200Gで10分間遠心分離する。FcRブロッカーを用いてFc受容体を遮断する。1つは、PBS中の5%FBSおよび0.02%アジ化ナトリウムからなるブロッキング緩衝液中で調製された400希釈液とする。

氷上で15分間インキュベートする。細胞を200Gで10分間遠心分離する。上清を捨てる。

目的の蛍光色素結合抗体をブロッキングバッファーで希釈する。ここでは、抗マウスLy6Gを500希釈したものを用い、好中球を染色する。注、B細胞のための抗マウスB220、T細胞のための抗マウスCD3、マクロファージのための抗マウスF4/80などを使用して、他の免疫細胞集団も示すことができる。

約200万個の細胞を、200マイクロリットルの抗体の希釈溶液中で、別々のチューブにインキュベートする。陰性対照として、染色されていない対照のために、各蛍光色素タイプに1本のチューブを脇に置いておく。このチューブ内で、抗体を含まない200マイクロリットルのブロッキングバッファーで細胞をインキュベートする。

サンプルを氷上で45分間インキュベートし、15分ごとに断続的にタップします。細胞を200Gで摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を捨てる。

必要に応じて、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定し、数日間保存する。細胞を200マイクロリットルのFACS染色バッファー、PBS中の2%FBSに再懸濁する。フローサイトメーターでデータを取得します。

ここに示したSS寒天プレートの画像は、敗血症性マウスの肝臓および脾臓における臓器CFU負荷を示す。均質化した器官Lys6を10の倍率マイナス1の倍率に希釈して広げ、摂氏37度でインキュベートした。黒色色素沈着したS.Typhimuriumコロニーは、インキュベーション後約12時間後に出現した。

プレートの一部は、コロニーを強調表示するためにズームインセットとしてここに示されています。これらの結果は、病原体が全身にうまく播種し、内臓に定着したことを示唆している。この図は、健常および敗血症マウスから単離された血清を示す。

敗血症マウスからの採取可能な血液の量は健康な対照よりも少ないので、得られる血清はより少ない。これは敗血症の凝固が高まったために起こります。敗血症性マウス由来の血清も、明確な赤色着色を示し、広範な溶血の発生を示す。

図は、抗Ly6G抗体で染色された健常および敗血症マウス由来の腹膜細胞のサイトメトリープロットを示す。これらの画像は、1匹の健康なマウスと2匹の感染マウスの代表である。敗血症マウスは、腹腔への好中球の浸潤の増加を見た。

このビデオでは、サルモネラ・チフス菌の腹腔内注射により、マウスに細菌性敗血症を誘導する方法を示した。これは、敗血症の減弱における治療介入の効果を研究するのに有用なモデルである。このモデルシステムでは、病原体と戦うために腹腔の細胞組成が劇的に変化する。

したがって、敗血症中の免疫細胞組成および機能の動態変化を研究する上で有用なモデルである。このモデルは、敗血症中に起こる細胞間活性酸素種の増加、炎症誘発性サイトカインレベル、溶血、および血液凝固を理解するのにも有用である。