Name: マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学ぶマウスにおけるサルモネラ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価法。腹腔内投与による単一細菌性グラム陰性敗血症モデルを用いて、炎症性宿主応答と致死性反応のメカニズムを解明する。

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研究のためにマウスを提供してくれた中央動物施設IIScに感謝します。この研究は、インド政府バイオテクノロジー・サイエンス・アンド・エンジニアリング研究委員会(Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board)からのDpNへの助成金によって資金提供されました。DBT-IIScプログラムとDST-FIST助成金からのインフラ支援は大いに認められています。DpNラボの過去および現在のすべてのメンバーのサポートに感謝します。

サルモネラ・チフス菌を用いたすべての実験は、バイオ安全レベル2(BSL-2)施設で実施された。適切な個人用保護具(PPE)を使用し、安全性を確保し、標準的なBSL-2バイオハザード処理方法に従うように注意する必要があります。全てのマウス実験は、IIScの動物倫理委員会によって述べられたガイドラインに従って実施した。マウスは、インド政府環境森林省によって承認されたIIScの中央動物施設(登録番号:48/1999/CPCSEA、1999年1月3日付)で飼育および維持された。実験プロトコルは、動物実験の目的および管理および監督委員会によって承認され、承認された許可番号CAF/Ethics/797/2020で承認されました。
BSL2の定義:BSL2評価は、バイオハザード剤が環境および実験室スタッフに中程度の脅威をもたらすことを表す5。
1. サルモネラ・チフス菌の培養調製         
<ol><li>サル モネラ ・チフス菌NCTC 12023グリセロールストック100 μLをルリア・ベルタニ(LB)ブロス3 mLに加える。培養物を37°Cで160rpmで一晩インキュベートする。</li>
	<li>LBブロス中で一晩増殖させた培養物のストリーク50 μLをサルモネラ赤痢菌(SS)寒天プレート上に、37°Cで約12時間インキュベートした。細菌コロニーを有するSS寒天プレートを in vivo 感染実験の前に数日間4°Cで保存する。</li>
	<li>マイクロチップを用いて縞模様のSS寒天プレートから単一のコロニーを選ぶ。マイクロチップを3mLのLBブロスに吐出し、37°Cで160rpmで一晩培養した。</li>
	<li>0.1 mLの細菌培養物を50 mLのLBブロスに加え、160 rpmのシェーカーインキュベーター内で37°Cで3〜4時間インキュベートして、増殖の対数段階に達する。LBブロスを用いて培養物を2倍に希釈する。 注:対数期の間、細菌細胞は最高の健康状態にあり、積極的に分裂しています。</li>
	<li>分光光度計またはマイクロプレートリーダーで600nmの波長の光における培養物の光学密度(OD)を測定する。ODが1.0に達したら、1.5mLマイクロフュージチューブに1mLの培養液の2つのアリコートを作る。</li>
	<li>チューブを 7,750 × g で 15 分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1mLの1x PBS 2xで洗浄する。チューブを 7,750 × g で 15 分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを2つの異なる1.5mLマイクロフュージチューブ内の0.5mLの1x PBSに再懸濁する。両方のチューブからの懸濁液を、約2 ×108 コロニー形成単位(CFU)/mLを含む1つの1.5 mLチューブに結合します。</li>
	<li>この原液を希釈して1×106CFU /mLの菌体懸濁液を調製する。 注意: 実験を開始する前に、OD に対応する CFU を特定の実験室条件下で最適化して、OD 1.0 の CFU を決定してください。</li>
</ol>2.マウスと感染症
<ol><li>8〜10週齢の雄C57BL / 6マウスを飼育し、動物施設のクリーンエアルームで数日間、体重〜20gを収容します。</li>
	<li>感染の日には、片手でマウスを持ち、腹部の皮膚を70%エタノールで拭き取り、腹壁のアクセシビリティを向上させるために後肢を広げます。</li>
	<li>1 mLシリンジの助けを借りて、0.5 mLの1×106 CFU/mL細菌懸濁液を腹腔内に注入する。したがって、各マウスは 5 ×105 CFU を受け取ります。対照、非感染マウスは、0.5mLのPBSのみを受け取る。感染後、注入された実際のCFUをチェックするために培養物をプレートし、これは0.2〜0.8百万CFU/0.5mLの間で変化し得る。</li>
	<li>マウスを割り当てられたとおりにケージに戻します。</li>
	<li>最良の応答を得るために、感染後〜12〜18時間のCO2 窒息を用いてマウスを屠殺する。通常、感染したすべてのマウスは96時間以内に死亡する。いくつかの実験的介入の下では、いくつかのマウスは生き残るかもしれない。96時間後にこれらのマウスを安楽死させる。また、体温が33.2°C未満で96時間で急性苦痛を感じたマウスを人道的エンドポイントとして安楽死させる。 注:このモデルでは、一部のマウスは サルモネラ菌 注射の12時間後に死に始めることがあります。したがって、複数の時点を含む実験を適切に計画してください。</li>
</ol>3. 臓器のCFU評価
<ol><li>感染したマウスをCO2 窒息により屠殺し、70%エタノールに浸した綿片で腹部を拭いた。腹部の皮膚を切り開きます。腹膜洗浄液6の収集方法に関するビデオプロトコルについては、RayとDirtelの記事を参照してください。腹腔を切り開き、目的の器官をマイクロフュージチューブに集める。さらに、敗血症のマウスの血液は急速に凝固し、量が少ないので、犠牲にした後はすぐに集めてください。 注:このビデオは、敗血症のこのモデルで肝臓が広範な組織病理学的損傷を受けるにつれて、肝臓からの臓器CFUの列挙を示しています。</li>
	<li>肝臓の小片を切ってマイクロフュージチューブに入れます。 注:これは、次のステップに進む前に、最大2〜3時間氷上に保管することができます。</li>
	<li>少量の計量を行い、微量遠心チューブに移します。好ましくは、適切な均質化のために〜10〜15mgの重量を量る小片を切断する。腸間膜リンパ節(MLN)や胸腺などの小さな臓器の場合は、臓器全体を使用してください。</li>
	<li>0.5mLの1x PBSをチューブに加え、ハンドホモジナイザーを使用して臓器を均質化する。臓器が完全に均質化されていることを確認してください。0.5 mL の 1x PBS を加えて、体積を 1 mL にします。</li>
	<li>チューブを200 × g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を新鮮なマイクロフュージチューブに集め、96ウェルプレートに1×10-1 および10-2 の希釈液を調製する。</li>
	<li>希釈液50 μLを新鮮なSS寒天プレートに広げ、プレートを37°Cで12時間インキュベートします。</li>
	<li>各条件に出現するコロニーの数をカウントし、式(1)を使用して臓器重量でデータを正規化します。 CFU/mg = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) 注: 式では、プレートあたりのコロニー数を CFU/mL に変換するために、数値 20 が使用されます。この数値は、1mLを播種した培養物の所与の体積の量で割ることによって到着する−この場合、50μLである。 例えば、SS寒天プレートに100個のコロニーが見出され、重量10mgのホモジナイズド臓器の1×10-1 希釈液の50μLが広がる場合、 CFU/mg = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>4. 腹膜滲出液中の各種免疫細胞集団のフローサイトメトリー解析
<ol><li>RayとDittel6によって以前に説明したように腹膜細胞を集める。</li>
	<li>腹膜洗浄液から細胞ペレットを10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1mLのRPMIに再懸濁する。血球計数器を用いて腹膜洗浄中の全細胞数を列挙する。すべてのチューブが0.2-0.5百万個のセルを受け取るようにセル番号を調整します。 注:敗血症のマウスの腹膜洗浄には、おそらく出血のために現れる赤血球が含まれることがあります。腹膜細胞をカウントする際に赤血球を除外するように注意してください。明視野顕微鏡では、赤血球は免疫細胞よりもはるかに小さく見えます。これらは、中央にくぼみがある円形の平らなディスクまたはドーナツとして表示されますが、中空ではありません。赤血球を溶解する工程7を加えてもよい。</li>
	<li>細胞を4°Cで200× g で10分間スピンダウンし、上清を捨て、細胞1xを1x冷PBSで洗浄した。細胞を200 × g で4°Cで10分間遠心分離する。</li>
	<li><li> </li><li><li><li></li><li></ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+Analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+murine+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Current murine models of sepsis.</a> Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).</li>
<li>Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+and+biohazards%3A+Understanding+biosafety+levels+and+meeting+safety+requirements+of+a+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank.</a> Biobanking. 1897, 213-225 (2019).</li>
<li>Ray, A., Dittel, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Peritoneal+Cavity+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).</li>
<li>Yadav, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+2+enhances+the+survival+of+mice+during+Salmonella+Typhimurium+infection-induced+sepsis+by+increasing+reactive+oxygen+species%2C+inflammatory+cytokines+and+recruitment+of+neutrophils+to+the+peritoneal+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity.</a> Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).</li>
<li>Verma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+hemoglobin+is+a+marker+of+systemic+inflammation+in+mouse+models+of+sepsis%3A+A+Raman+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study.</a> Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).</li>
<li>Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+mouse+peritoneal+macrophages%3A+Heterogeneity%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function.</a> Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).</li>
<li>Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+pathophysiology+of+sepsis%2C+an+inflammatory+disorder%3A+Key+roles+of+oxidative+and+nitrosative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress.</a> Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

この記事では、 サルモネラ・ チフス菌の腹腔内注射によって重篤な形態の細菌敗血症を誘発する方法について説明する。このモデルは、 サルモネラ・ チフムリウム菌が細胞内病原体であり、したがって、高病原性であり、グラム陰性敗血症の臨床的に関連する状態を模倣するので、他のモデルよりも有利である。このモデルにおける腹膜炎敗血症の結果は全身性であり、感染後96時間以内に100%の死亡率を有する。したがって、このモデルは、炎症性および致死性の宿主応答8 および敗血症の減弱における治療的介入の効果を研究する上で有用である。
このモデルシステムでは、腹腔の細胞組成は、接種された病原体と戦うために劇的に変化する。多数のLY6G+好中球が腹腔に浸潤し、F4/80+マクロファージの同時減少により、マクロファージ消失反応(MDR)が生じた8,10。したがって、このモ...

敗血症は、微生物の侵入または組織損傷に対する調節不全の全身性炎症および免疫応答として定義され、感染または損傷の部位から離れた器官損傷をもたらす。敗血症性ショックは、体積蘇生中に持続する低血圧を特徴とする敗血症のサブセットであり、死亡リスクが実質的に増加する1。一般の人々は、COVID-19パンデミックの間にこの障害をより認識するようになりました。その高い関連死亡率にもかかわらず、敗血症の世界的な負担に関する包括的な疫学的データは、その診断の複雑さのために欠けている。2017年には、世界中で4,890万人の敗血症発生率と1,100万人が死亡し、全世界の死亡の19.7%を占めています2。さらに、集中治療室の患者における感染および関連する敗血症の長期有病率に関する研究は、患者からの陽性分離株の62%がグラム陰性生物であることを発見しました3。
当初、敗血症の調査は微生物の病因を描写することに焦点を当てていました。しかし、宿主が自己と非自己をどのように区別するかを決定する「危険仮説」を理解することは、敗血症研究のバランスを、侵入する病原体に対する宿主の反応を理解する方向に傾けることにつながった。敗血症の広く用いられているマウスモデルには、リポ多糖(LPS)誘発内毒素血症モデル、多微生物敗血症モデル、盲腸結紮および穿刺(CLP)および結腸上突起ステント腹膜炎(CASP)、および単細菌感染モデル4が含まれる。
我々は、 サルモネラ・ チフス菌を用いて腹膜敗血症を誘導することにより、マウスモデル系を標準化した。 サルモネラ・ チフス菌はグラム陰性敗血症の臨床的に関連する状態を模倣する細胞内病原体であるため、このモデルは他のモデルよりも有利である。このモデルにおける腹膜炎敗血症の結果は全身性であり、感染後96時間以内に100%の死亡率を有する。したがって、このモデルは、炎症性および致死性の宿主応答を研究する上で有用である。このモデルでは、敗血症は、8〜10週齢のC57BL/6マウスに50万個のコロニー形成単位(CFU)の サルモネラ ・チフス菌を腹腔内注射することによって誘発される。全身感染は、感染後〜16時間の臓器細菌負荷を評価することによって確認することができる。この記事では、マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性腹膜炎敗血症を実証し、腹膜細胞組成の結果生じる変化を特徴付け、異なる器官における細菌負荷を定量化する。

<table><tbody><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 滅菌シリンジ 26 G ニードル付き</td><td>Beckton Dickinson, Singapore</td><td>303060</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tube</td><td>Tarsons, USA</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 滅菌シリンジ 21 G ニードル付き</td><td>Beckton Dickinson, Spain</td><td>307758</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Flask</td><td>Tarsons, USA</td><td>441150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL目盛り付き遠心分離チューブ</td><td>ターソン、米国</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>50 mL目盛り付き遠心分離チューブ</td><td>ターソン、米国</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Cell spreader</td><td>VWR、米国</td><td>VWRU60828-680</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'S Phosphate Buffered Saline</td><td>HiMedia, Mumbai, India</td><td>TS1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>FcR blocker</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC ラット抗マウス Ly6G (クローン 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551460</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>手作業式ホモジナイザー</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤(ノイバウアー計数室)</td><td>Rohem, India</td><td>I.S. 10269</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>HiMedia, Mumbai, India</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Tarsons, USA</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia, Mumbai, India</td><td>AT060-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella-Shigella 寒天</td><td>HiMedia, Mumbai, India</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Kubota</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD FACSverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>N-biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>島津</td><td></td><td></td></tr><tr><td>製作所 計量機</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

敗血症は、微生物の侵入または組織損傷に対する調節不全の宿主免疫応答であり、感染または損傷のそれから離れた部位で器官損傷をもたらす。現在、敗血症の広く使用されているマウスモデルには、リポ多糖(LPS)誘発性内毒素血症、盲腸結紮および穿刺(CLP)、および単細菌感染モデル系が含まれる。このプロトコールは、マウスにおける サルモネラ・ チフス菌感染誘発敗血症性腹膜炎の間の宿主応答を研究する方法を記載する。 S. グラム陰性細胞内病原体である腸チフスは、マウスに腸チフス様疾患を引き起こす。
このプロトコールは、培養調製、腹腔内注射によるマウスにおける敗血症性腹膜炎の誘導、および全身宿主応答を研究する方法を詳述する。さらに、異なる器官における細菌負荷の評価および腹膜洗浄における好中球数の増加のフローサイトメトリー分析が提示される。 サルモネラ マウスにおけるチフス誘発敗血症は、炎症誘発性サイトカインの増加および腹腔内の好中球の急速な浸潤をもたらし、生存率を低下させる。
このプロトコルのすべてのステップが最適化されており、敗血症性腹膜炎の病因の再現性が高い。このモデルは、細菌敗血症中の免疫学的応答、疾患進行における異なる遺伝子の役割、および敗血症を減弱させる薬物の効果を研究するのに有用である。

この特定のモデルを用いた宿主免疫応答の詳細な特徴付けは、以前の刊行物8、9に示されている。このセクションでは、説明したプロトコルのいくつかの代表的な結果が示されています。このモデルは、 Sの全身感染を誘導することを目的とする。腸チフスは細菌培養物の腹腔内注射により敗血症を誘導する。感染を確認するために、敗血症マウス由来の肝臓および脾臓の溶解液をSS寒天プレート上に広げ、コロニー数をカウントした。 図1において、SS寒天プレートの画像は、敗血症性マウスの肝臓および脾臓における臓器CFU負担を示す。ホモジナイズした器官溶解物を1×10−1 の希釈液で広げ、37°Cでインキュベートした。 黒色色素を S. チフス菌コロニーは、37°Cでの〜12時間のインキュベーション後に出現した。 さらに、マウスの感染に際し、血液および腹膜洗浄からの培養物は、細菌細胞に対して陽性であることが報告されている<sup class=...

このプロトコールは、マウスモデル系におけるグラム陰性単細菌敗血症の誘導を記載する。このモデルは、敗血症中の炎症性および致死性の宿主応答を調査するのに有用である。

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

敗血症は、微生物の侵入または組織損傷に対する調節不全の宿主免疫応答であり、感染または損傷のそれから離れた部位で器官損傷をもたらす。一般の人々は、COVID-19パンデミックの間、この障害をより認識するようになりました。2017年には、世界中で4,890万件の敗血症発生率と1,100万人が死亡し、世界の全死亡のほぼ20%を占めています。予想通り、ほとんどの症例は病院にいます。実際、ある研究では、敗血症のICU患者からの陽性分離株のほぼ62%がグラム陰性生物であることが判明しました。いくつかのモデルがあり、敗血症の一般的に使用されるマウスモデルのいくつかは、LPS誘発性エンドトキシー血症、盲腸結紮および穿刺モデル、および単細菌感染モデル系を含む。当研究室では、マウスモデルシステムを標準化し、サルモネラ・チフス菌を用いて腹膜敗血症を誘導している。サルモネラ・チフムリウムはグラム陰性敗血症の臨床的に関連する状態を模倣する細胞内病原体であるため、このモデルは他のモデルよりも有利である。このモデルにおける腹膜炎敗血症の結果は、感染後96時間以内に100%の死亡率で全身性である。したがって、このモデルは、炎症性宿主応答を研究する上で有用である。このモデルでは、敗血症は、8〜10週齢のC57BL/6マウスに50万CFUのサルモネラ・チフス菌を腹腔内注射することによって誘発される。全身感染は、感染後約16時間で臓器細菌負荷を評価することによって確認することができる。サルモネラ・チフムリウムを用いた実験には、BSL-2施設、およびBSL-2ガイドラインの遵守が必要である。適切なPPEを使用し、安全性を確保し、標準的なBSL-2バイオハザード処理方法に従うように注意する必要があります。すべての実験は、機関の動物倫理委員会によって承認されています。サルモネラ・チフス菌の培養調製。100マイクロリットルのサルモネラ・チフムリウムNCTC 12023グリセロールストックを3mLのLBブロスに加える。毎分160回転、摂氏37度で一晩培養します。LBブロス中で一晩生育培養した培養液のストリーク50マイクロリットルを、サルモネラ赤痢菌寒天プレート上に、摂氏37度で12時間インキュベートした。縞模様のSS寒天プレートから単一のコロニーを、マイクロチップを用いて拾い上げる。マイクロチップを3mLのLBブロスに排出し、摂氏37度で160RPMで一晩培養した。0.1 mLの細菌培養物を50 mLのLBブロスに加え、摂氏37度で、160RPMのシェーカーインキュベーター内で、3〜4時間インキュベートし、増殖の対数段階に達する。LBブロスを用いて培養物を2倍に希釈する。分光光度計で600ナノメートルの波長の光における培養物の光学密度を測定する。ODが1に達したら、1.5mLマイクロフュージチューブに1mLの培養液の2つのアリコートを作る。チューブを7, 750 Gで15分間遠心分離する。この上清を捨て、ペレットを1mLの1XPBSで2回洗浄した。チューブを7, 750 Gで15分間遠心分離する。ペレットを0.5 mLの1XPBSに、2つの異なる1.5 mLマイクロフュージチューブに再懸濁する。両方のチューブからの懸濁液を、1つの1.5mLチューブに結合し、今、収容し、約2つに10を掛けて、1mLあたり8個のコロニー形成単位の累乗に上げた。原液を希釈して10パワー6CFU/mLの菌体懸濁液を調製する。重要な注意点として、実験を開始する前に、実験室でODに対応するCFUを最適化し、OD1のCFUを決定する。マウスと感染症。感染の日に、片手でマウスを持ち、腹部の皮膚を70%エタノールで拭き取り、腹壁のアクセシビリティを向上させるために後肢を広げます。1 mLシリンジの助けを借りて、パワー6 CFU/mL細菌懸濁液に上げた10の0.5 mLを腹腔内に注入する。感染後、培養物をプレート注入した実際のCFUをチェックし、これは0.5mLあたり0.2〜0.8百万CFUの間で変化し得る。臓器のCFU評価。マウスを二酸化炭素窒息法を用いて屠殺した。感染したマウスを犠牲にした後、70%エタノールに浸した綿片で腹部を拭きます。腹部の皮膚を切り開きます。腹膜洗浄液の収集方法に関するビデオプロトコルについては、RayとDittleの記事を参照してください。腹腔を切り開き、目的の器官を集める。このビデオでは、肝臓からの臓器CFUの列挙を実証しています。肝臓は、敗血症のこのモデルにおいて、広範な組織病理学的損傷を受ける。肝臓の小片を切って、それをマイクロフュージチューブに入れます。これは、次のステップに進む前に、氷に2〜3時間保存することができます。ピースの重量を量り、マイクロフュージチューブに移します。好ましくは、適切な均質化のために、約10〜15mgの重さの小片を切断する。チューブに0.5mLの1XPBSを加え、ハンドホモジナイザーを使用して臓器を均質化する。臓器が完全に均質化されていることを確認してください。0.5 mL の 1XPBS を加えて、体積を 1 mL にします。チューブを200Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を新鮮なマイクロフュージチューブに集めます。96ウェルプレートに、10の検出力マイナス1、および10の検出力マイナス2の希釈液を準備します。50マイクロリットルの希釈液を新鮮なSS寒天プレート上に広げ、プレートを摂氏37度で12時間インキュベートした。各条件に出現するコロニーの数をカウントし、以下の式を用いて臓器重量でデータを正規化する。CFU/mgはコロニー数に等しく、20を掛け、希釈倍率を掛け、全体を臓器重量(mg)で割った値である。なお、数20は、プレートあたりのコロニーをCFU/mLに変換するために、式で使用されています。この数値は、播種した培養物の所与の体積の量を1mLで割ることによって到達する。この場合、50マイクロリットルである。たとえば、SS寒天プレートで10個のコロニーが見つかった場合、10乗の50マイクロリットルから均質化した臓器の希釈液1個を引いたものが広がり、10mgの重さが広がると、CFU/mgは100に20を掛け、10を掛け、全体を10で割った値に等しくなり、2000CFU/mgに等しくなります。腹膜滲出液中の様々な免疫細胞集団のフローサイトメトリー分析。前述のように腹膜細胞を、レイおよびディトルによって収集する。腹膜洗浄液から細胞ペレットを再懸濁し、10%FBSを添加した1mLのRPMIに再懸濁する。腹膜洗浄液中の全細胞数を列挙し、血球計数器を用いる。すべてのチューブが2〜5に10を掛けて5セルの電力に上げるようにセル番号を調整します。セルを摂氏 4 度で 200 G で 10 分間スピンダウンします。上清を捨てる。1XPBSで細胞を一度洗ってください。細胞を200Gで10分間遠心分離する。FcRブロッカーを用いてFc受容体を遮断する。1つは、PBS中の5%FBSおよび0.02%アジ化ナトリウムからなるブロッキング緩衝液中で調製された400希釈液とする。氷上で15分間インキュベートする。細胞を200Gで10分間遠心分離する。上清を捨てる。目的の蛍光色素結合抗体をブロッキングバッファーで希釈する。ここでは、抗マウスLy6Gを500希釈したものを用い、好中球を染色する。注、B細胞のための抗マウスB220、T細胞のための抗マウスCD3、マクロファージのための抗マウスF4/80などを使用して、他の免疫細胞集団も示すことができる。約200万個の細胞を、200マイクロリットルの抗体の希釈溶液中で、別々のチューブにインキュベートする。陰性対照として、染色されていない対照のために、各蛍光色素タイプに1本のチューブを脇に置いておく。このチューブ内で、抗体を含まない200マイクロリットルのブロッキングバッファーで細胞をインキュベートする。サンプルを氷上で45分間インキュベートし、15分ごとに断続的にタップします。細胞を200Gで摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を捨てる。必要に応じて、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定し、数日間保存する。細胞を200マイクロリットルのFACS染色バッファー、PBS中の2%FBSに再懸濁する。フローサイトメーターでデータを取得します。ここに示したSS寒天プレートの画像は、敗血症性マウスの肝臓および脾臓における臓器CFU負荷を示す。均質化した器官Lys6を10の倍率マイナス1の倍率に希釈して広げ、摂氏37度でインキュベートした。黒色色素沈着したS.Typhimuriumコロニーは、インキュベーション後約12時間後に出現した。プレートの一部は、コロニーを強調表示するためにズームインセットとしてここに示されています。これらの結果は、病原体が全身にうまく播種し、内臓に定着したことを示唆している。この図は、健常および敗血症マウスから単離された血清を示す。敗血症マウスからの採取可能な血液の量は健康な対照よりも少ないので、得られる血清はより少ない。これは敗血症の凝固が高まったために起こります。敗血症性マウス由来の血清も、明確な赤色着色を示し、広範な溶血の発生を示す。図は、抗Ly6G抗体で染色された健常および敗血症マウス由来の腹膜細胞のサイトメトリープロットを示す。これらの画像は、1匹の健康なマウスと2匹の感染マウスの代表である。敗血症マウスは、腹腔への好中球の浸潤の増加を見た。このビデオでは、サルモネラ・チフス菌の腹腔内注射により、マウスに細菌性敗血症を誘導する方法を示した。これは、敗血症の減弱における治療介入の効果を研究するのに有用なモデルである。このモデルシステムでは、病原体と戦うために腹腔の細胞組成が劇的に変化する。したがって、敗血症中の免疫細胞組成および機能の動態変化を研究する上で有用なモデルである。このモデルは、敗血症中に起こる細胞間活性酸素種の増加、炎症誘発性サイトカインレベル、溶血、および血液凝固を理解するのにも有用である。

characterizing-salmonella-typhimurium-induced-septic-peritonitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価

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