Name: 変異型メチオニンtRNA合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶ細胞型特異的タンパク質標識法。変異型メチオニンtRNA合成酵素マウスを用いてアジドノルルシンで標識し、クリックケミストリーと質量分析で精製・同定する。神経科学・細胞生物学研究に有用です。

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B.A-Cは、スペイン科学イノベーション省(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I)、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)、およびMICINN(PID2020-113270RA-I00)の助成金によって資金提供されています。R. A-Pは、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057)から資金提供を受けています。E.M.S.は、欧州研究会議の上級研究者賞であるマックスプランク協会(助成金743216)、DFG CRC 1080:神経恒常性の分子および細胞メカニズム、およびDFG CRC 902:RNAベースの制御の分子原理によって資金提供されています。我々は、D.C DieterichとP. Landgrafの技術的助言とDST-Alkyneの合成に感謝する。E. Northrup、S. Zeissler、S. Gil Mast、およびMPI for Brain Researchの動物施設の優れたサポートに感謝します。Nex-Creマウスラインを共有してくれたサンドラゲッベルスに感謝します。アントニオ・G・カロッジョ氏の英文校正にご協力いただき、ありがとうございました。学士実験を設計、実施、分析しました。B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., および S. T.D.実験を実施し、分析した。B.A-CとE.M.S.は実験を設計し、プロジェクトを監督し、B.A-Cは論文を書いた。すべての著者が論文を編集した。

<ol><li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+synaptic+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+protein+synthesis%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li>
<li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939(2020).</li>
<li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li>
<li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+metabolic+labeling%2C+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li>
<li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li>
<li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li>
<li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li>
<li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li>
<li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li>
<li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BONCAT%3A+Metabolic+labeling%2C+click+chemistry%2C+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).</li>
<li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+by+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
<li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li>
<li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li>
<li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspension+trapping+%28S-Trap%29+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li>
<li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li>
<li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li>
<li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377(2016).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioID%3A+A+screen+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

プロトコルの重要な側面は次のとおりです。陰性対照を含めること、十分な生物学的複製を有すること、ANL投与経路、量、および期間、サンプルのアルキル化、アルキン濃度、およびDST-アルキンを使用する場合のβ-メルカプトエタノールの除去。
Creドライバーなしで、したがってMetRS*発現のないANL標識動物から進行する陰性対照サンプルを含めることが重要です。これらのサンプルは、ANL標識されたCre誘導MetRS*マウスのサンプルと並行して、プロトコルに記載されているすべてのステップにかける必要があります。クリックされていないサンプルは、このコントロールのみを使用して達成された結果が非特定のクリックが原因である可能性があるため、有効なコントロールではありません。MetRS*遺伝子を発現していない細胞でのANLの取り込みや、Creのない細胞でのMetRS*発現は観察されていません。したがって、ANLで標識されたwt動物は、陰性対照として使用することができる。
本明細書に記載されるプロトコルは、サンプルが失われる可能性のある多くのステ...

異常なタンパク質恒常性は、タンパク質の合成と分解の不均衡によって引き起こされます。いくつかの疾患は、タンパク質恒常性の変化に関連しています。いくつかの疾患の特徴は、異なる細胞内位置および脳領域に凝集体が存在することです。タンパク質の恒常性は、疾患において重要であるだけでなく、正常な臓器および細胞機能においても重要な役割を果たします1。例えば、タンパク質合成は、タンパク質合成を阻害する化学阻害剤の使用によって決定されるように、多くの形態のニューロン可塑性2,3に必要である4。しかし、学習と記憶をサポートするためにプロテオームがどの細胞型で変化しているかは明らかではなく、各細胞型のどの特定のタンパク質がそれらの合成または分解において増加または減少するかも理解されていません。したがって、タンパク質の恒常性を包括的に研究するには、特定の細胞型に由来するプロテオームを区別する能力が必要です。実際、多細胞環境で起こる細胞プロセスを研究するための細胞種特異的プロテオームの同定は、プロテオミクスにおける重要なハードルでした。このため、MetRS*発現と生体直交法を組み合わせた技術を開発し、細胞型特異的プロテオームを同定および精製する効果的な方法であることが証明され、このギャップを埋めました5,6,7。
変異体MetRS*(MetRS L274G)の発現により、非標準的なメチオニン類似体ANLを対応するtRNA 8,9にロードし、その後タンパク質に組み込むことができます。MetRS*発現が細胞型特異的プロモーターによって調節されると、非標準アミノ酸が細胞選択的にタンパク質に取り込まれます。ANLがタンパク質に組み込まれると、クリックケミストリーによって選択的に機能化され、その後、イメージング(FUNCAT)またはウエスタンイムノブロット(BONCAT)によって視覚化されます。あるいは、タンパク質を選択的に精製し、質量分析(MS)によって同定することができる。この技術を用いて、Creリコンビナーゼの制御下でMetRS*タンパク質を発現するマウス株を作製しました。利用可能なCreマウス株の数が増えていることを考慮すると、MetRS*システムは、既存のCre-lineが存在するあらゆる組織からあらゆる細胞タイプを研究するために、あらゆる分野で使用することができます。ANLによるタンパク質標識は、in vitroまたはin vivoで可能であり、マウスの行動やタンパク質の完全性を変化させません6。標識期間は、各研究者の科学的問題に適合させることができ、新しく合成されたタンパク質(より短い標識時間)またはプロテオーム全体(より長い標識時間)を標識します。この技術の使用は、研究者が研究を希望するタイプの細胞の数によって制限されます。したがって、この方法では、数が少ない、または代謝率が低い細胞型からのタンパク質の単離は不可能です。提示された方法の目標は、in vivoで標識された細胞型特異的タンパク質/プロテオームを特定することです。このプロトコルでは、生きたマウスで細胞種特異的プロテオームをANLで標識し、標識タンパク質を精製する方法について説明しています。精製後、タンパク質は、ルーチン質量分析プロトコル5、10によって同定することができる。特定の細胞集団からのタンパク質の選択的精製によってこの方法において達成される試料の複雑さの低減は、例えば環境変化に応答して、プロテオームの微妙な変化を検出することを可能にする。標識タンパク質の精製は、MS分析や標識期間を含まない~10日で達成できます。ここでは、MetRS*発現マウスへのANL投与の2つの方法、すなわち(1)飲料水にアミノ酸を添加する方法と、(2)腹腔内注射によるANLの導入方法について説明する。ANL投与に選択した方法に関係なく、分離および精製のステップは同じです(ステップ2以降)。

<table><tbody><tr><td>12% アクリルアミドゲル</td><td>GenScript</td><td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td><td></td></tr><tr><td>-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>毒性; 白衣、手袋、ヒュームフードを使用してください。</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Σ</td><td>9830</td><td>毒性; 白衣、手袋、および</td></tr><tr><td>前述の AHA 用に合成された ANL</td><td></td><td></td><td></td> (参考文献 5 および 11 を参照)</tr> <tr><td>ANL-HCl</td><td>IrishBotech</td><td>HAA1625.0500</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン アルキン</td><td>サーモ,</td><td>B10185</td><td></td></tr><tr><td>チキン抗体抗GFP</td><td>Aves</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Toxic;白衣と手袋を使用してください。</td></tr><tr><td>銅(I)臭化</td><td>物シグマ</td><td>254185</td><td>99.999%(wt/wt)</td></tr><tr><td>ジスルフィドタグ(DST)-アルキン</td><td></td><td></td>参照<td>番号15で報告されているように合成され、プローブ20</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>メルク</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド(IAA)</td><td>シグマ</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>IRアンチチキン800</td><td>LI-COR</td><td>IRDye 800CW</td><td>ロバ抗チキン二次抗体</td></tr><tr><td>IR 抗ラビット 680</td><td>LI-COR</td><td>IRDye 680RD</td><td>ヤギ抗ウサギ IgG 二次抗体</td></tr><tr><td>マルトース</td><td>シグマ</td><td>M9171</td><td></td></tr><tr><td>手動ミキサー</td><td>BioSpec 製品</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド</td><td>シグマ</td><td>4259</td><td>毒性;白衣、手袋、ドラフトを使用してください。</td></tr><tr><td>NeutrAvidin ビーズ</td><td>Pierce</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>Bio-rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>J62036.K2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X pH 7.8</td><td></td><td></td><td>参照番号に記載されている調製 5</td></tr><tr><td>PD SpinTrap G-25 カラム</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>バッファー交換</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo、</td>Pierce BCAタンパク質アッセイキットの<td>23225</td><td>試薬は、水生生物に有毒です。</td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ抗ビオチン抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>5597</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE&nbsp;ランニングバッファー</td><td>MOPS GenScript</td><td>M00138</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO ルビー染色</td><td>Sigma</td><td>S4942</td><td></td></tr><tr><td>テーブル 自動 ボルテクサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>ミックスメイト</td><td></td></tr><tr><td>トリアゾール配位子</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>分子生物学グレード</td></tr></tbody></table>

変異型メチオニンtrna合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

in vivoでのタンパク質恒常性を理解することは、生理学的条件と疾患状態の両方で細胞がどのように機能するかを知るための鍵です。本プロトコルは、タンパク質標識を特定の細胞集団に向けるために改変されたマウス系統を使用して、新たに合成されたタンパク質のin vivo標識およびその後の精製を記載する。これは、L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)のCreリコンビナーゼ発現による誘導可能な系統であり、他の方法では起こらないタンパク質へのアジドノルロイシン(ANL)の取り込みを可能にします。ここで説明した方法を使用すると、in vivoで標識された細胞種特異的プロテオームを精製し、サンプルの複雑さの減少によるタンパク質含有量の微妙な変化を検出することができます。

記載されたプロトコル(図1に要約)に従って、ANLを毎日の腹腔内注射(400 mM ANL 10 mL / kg、Nex-Cre::MetRS *)で7日間、または飲料水(0.7%マルトース、1%ANL、CamkII-Cre::MetRS *)を介して21日間マウスに投与しました。標識後、対応する脳領域を解剖し、溶解し、アルキル化し、クリックした。クリック反応は、SDS-PAGEおよびウエスタンイムノブロットによって分析した。実験の代表的な画像を、IP注入によるANL投与については図2に、飲料水を介したANL投与については図3に示す。図の目的は、両方のラベリングプロトコルが機能することを示すことであり、それらを比較することではないことに注意してください。示された2つの実験(海馬および皮質の興奮性ニューロン、および小脳のプルキンエニューロン)において異なるニューロン集団が標識されているため、比...

このプロトコルでは、変異型L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)を発現するマウス株を使用して、アジドノールロイシン(ANL)による細胞種特異的タンパク質標識を実行する方法と、標識された細胞種特異的タンパク質の単離に必要な手順について説明します。生きたマウスにおける2つの可能なANL投与経路を、(1)飲料水と(2)腹腔内注射によって概説します。

変異型メチオニンtRNA合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

このプロトコルにより、細胞タイプ特異的な方法でタンパク質を標識することができます。これはそのような可能性を提供する最初の技術であり、インビトロまたはインビボで行うことができます。この技術の主な利点は、標識された細胞型特異的タンパク質を未同定で精製したり、免疫蛍光によってその場で可視化したりできることです。組織の湿重量の12〜15倍の容量で溶解緩衝液を添加して組織ライセートを調製し始め、均質になるまで組織を粉砕する。このホモジネートを摂氏75度に15分間加熱してタンパク質を変性させ、サンプルを遠心分離して上清を新しいチューブに移します。このサンプルは摂氏マイナス80度で保存できます。次に、アルキル化のために、均質化した試料をEDTA非含有プロテアーゼ阻害剤を含むリン酸生理食塩水緩衝液で2〜3倍に希釈する。次に、新たに調製したヨードアセトアミドを最終濃度20ミリモルまで加えます。暗所で摂氏20度でサンプルを1〜2時間放置します。ヨードアセトアミドの添加とインキュベーションの手順を2回繰り返します。最初にカラムをボルテックスすることにより、製造元の指示に従ってカラムを準備します。次に、蓋を外して底部を切断し、遠心分離します。次に、最初にクリックケミストリー交換バッファーを使用してバッファー交換カラムを平衡化し、次にすべてのアルキル化サンプルを交換することにより、バッファー交換を実行します。アジドノルロイシンの取り込みを評価するには、ほのめかしたサンプルを40マイクロリットル取り、リン酸生理食塩水を最終容量120マイクロリットルに加えます。次に、反応を20秒間ボルテックスすることにより、クリック化学反応を設定します。各試薬を指示された順序でできるだけ早く添加した後、サンプルを摂氏4度の暗所で一晩連続回転させてインキュベートします。翌日、遠心分離後、サンプルを17, 000倍Gで5分間遠心分離すると、わずかにターコイズブルーのペレットが見えます。上清を新しいチューブに移し、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。標識タンパク質精製用。平衡化バッファーとしてニュートラアビジン結合バッファーを使用して遊離アルキンの残り物を洗浄することが実証されているように、すべてのサンプルをバッファー交換手順にかけます。次に、ニュートラアビジン高容量ビーズを結合バッファーと混合することにより3回洗浄します。混合物を遠心分離し、上清を捨ててこれを3回繰り返す。次に、同量のニュートラアジンドライビーズとニュートラアビジン結合バッファーを加えて1対1のスラリーを調製します。各サンプルを前精製ライセートとして20〜40マイクロリットル確保し、摂氏マイナス20度で保管します。試料のタンパク質濃度を測定した後、1ミリグラムのタンパク質を40マイクロリットルのビーズスラリーと混合する。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、連続的に回転させて標識タンパク質をビーズに結合させます。翌日遠心分離により上清を回収する。後で分析するために上清の20〜40マイクロリットルのアリコートを取っておき、残りを摂氏マイナス80度で凍結します。次に、洗浄バッファー1液に冷やしたニュートラアビジンを加えてビーズを3回洗浄する。ビーズを沈降させ、上清を捨てる。次に、同じバッファーを追加し、上清を廃棄する前に、摂氏4度で連続回転下でビーズを10分間インキュベートします。ニュートラアビジン洗浄バッファー2および3で洗浄を繰り返し、使用した乾燥ビーズの1容量に相当する量のニュートラアビジン溶出バッファーと共にビーズを摂氏20度で30分間インキュベートすることにより、クリックされたタンパク質を溶出する。溶出中は、サーモブロックシェーカーでビーズを毎分1000回転で懸濁状態に保ち、両方の溶出液を2回組み合わせます。クリック反応は、SDSページおよびウエスタンイムノブロットによって分析した。腹腔内注射によるアジドノルロイシン投与および飲料水を介したアジドノルロイシン投与について、実験の代表的な画像を示す。さらなる実験は、最適なジスルフィドビオチン切断可能なアルキン濃度を決定するための例を提供する。この例では、標識サンプルとコントロールとの間のフォールド変化は、14マイクロモルアルキン濃度で最も高くなります。対照と比較したアジドノルロイシン標識試料中の明確な富化を伴う質量分析結果の例をここに示す。この違いは、総タンパク質染色ですでに見られていました。ペプチド強度の変化に加えて、両方のサンプルに見られるユニークなタンパク質もあります。これは技術的に複雑なプロトコルであり、適切なネガティブコントロールアルキル化、適切(不明瞭)、および非クリックアーカイブの適切なクリーニングを使用して、慎重に手順に従う必要があります。このプロトコルにおける当社の重要なステップである精製タンパク質は、研究者がタンパク質を研究することに興味がある場合は質量分析によって同定するか、ウェスタンブロットによって目的のタンパク質を研究するためにゲルにロードすることができます。特定の細胞起源からのタンパク質を標識するこの方法の能力は、タンパク質の張力またはインビトロまたはインビボでのタンパク質合成の研究など、多くの用途があります。

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重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、...

PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

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Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

学ぶ細胞型特異的タンパク質標識法。変異型メチオニンtRNA合成酵素マウスを用いてアジドノルルシンで標識し、クリックケミストリーと質量分析で精製・同定する。神経科学・細胞生物学研究に有用です。

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