Name: 骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学ぶ骨格筋の線維タイプ特異的な脂肪滴定量化法。Bodipy染色と共焦点顕微鏡を用いて、脂質滴の形態と亜細胞分布を自動解析します。マウス筋肉のミオステアトーシス評価に応用可能です。

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この研究は 、Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20)と Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care)からの助成金によって支援されました。M.A.D.-L.d.C.はワロニー・ブリュッセル国際エクセレンス・プログラムからフェローシップを受けました。
著者らは、このプロトコルの開発に貢献したアリス・モニエと、画像取得プロセスにおける彼女の専門知識と技術的支援に対してキャロライン・ブーザンに感謝します。我々はまた、クライオスタット及び顕微鏡へのアクセスについて、2IP-IRECイメージングプラットフォーム(2IP-IRECイメージングプラットフォーム、実験臨床研究所、ルーヴァンカトリック大学、1200ブリュッセル、ベルギー)にも感謝する。最後に、著者らは、原稿の建設的な批判に対して、ニコラ・デュビュイソン、ロマン・ヴェルセル、ミシェル・アブー=サムラに感謝したい。これらの記事の数字のいくつかは、BioRender.com で作成されました。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

ここで詳述するプロトコルは、繊維タイプおよびサブセルラー特異的にBodipyでタグ付けされたLDを定量する効率的な方法を説明しています。近年、OROやスーダンブラックBなどの古典的な脂質色素は、中性脂質に結合する細胞透過性、親油性、蛍光色素(例えば、Bodipy)の新しい配列で置き換えられています。異なるコンジュゲートとして利用可能なBodipyは、異なる固定組織および細胞23、38、39、40だけでなく、生細胞41,42においても、それらの形態、ダイナミクス、および他の細胞小器官との相互作用を研究するためにLDをタグ付けするのに非常に有効であることが証明されている41,42。
プロトコル内には、研究者が最適な結...

筋症として知られている骨格筋脂質浸潤は、肥満および老化とともに増加する。筋症は、筋肉量および強度およびインスリン感受性1と負の相関がある。さらに、最近の研究は、筋食症の程度が心血管疾患2、非アルコール性脂肪性肝疾患3、または癌4などの他の状態の予後因子として使用できることを示している。脂質は、筋細胞外脂質として、または筋線維内の骨格筋に筋細胞内脂質(IMCL)として蓄積することができる。IMCLsは、主に脂肪滴(LD)中のトリグリセリドとして貯蔵され、身体運動中に代謝燃料として使用される5,6。しかし、脂質供給が需要を上回ったり、ミトコンドリアが機能不全になったりすると、IMCLは代謝的に不健康な肥満の個人や2型糖尿病患者に見られるように、筋肉インスリン抵抗性に関与します7。興味深いことに、持久力アスリートは、高いインスリン感受性を維持しながら、2型糖尿病の肥満患者に見られるものと同様のレベルのIMCLを有する。この現象は「アスリートのパラドックス」8,9として記述され、筋肉LDのサイズ、密度、局在化、動態、脂質種の組成に関連する筋肉LDのより微妙な評価によって説明される。
第1に、LDサイズはインスリン感受性および体力に反比例する10、11。実際、より小さいLDは、リパーゼ作用に対して比較的大きな表面積を示し、したがって、潜在的に、脂質12を動員するより大きな能力を有する。第二に、LD密度(数/表面)は、インスリン作用において物議を醸す役割を果たしている8,10;しかし、アスリートでは増えているようです。第3に、表面膜のすぐ下に位置するLDs(サルコレマール下または末梢)は、中心膜よりもインスリン感受性に対してより有害な影響を及ぼすので、LDの細胞内局在化は重要である8、9、13。後者は、より大きな呼吸活動を有し、収縮に必要な高いエネルギー需要を満たすためにより専門化された中枢ミトコンドリアに燃料を供給する14。対照的に、末梢LDは、膜関連プロセスに関与するサルコレンマル下ミトコンドリアを供給する8。最後に、トリグリセリドを超えて、筋肉内の特定の複合脂質は、他の脂質よりも有害であり得る。例えば、ジアシルグリセロール、長鎖アシルCoA、およびセラミドは、トリグリセリドの代謝回転率が低いときに筋肉に蓄積し、それによってインスリンシグナル伝達を損なう9、15。「アスリートのパラドックス」に戻ると、持久力アスリートはI型(酸化)線維において高い回転率を有する多数のより小さな中枢LDを有するが、肥満および糖尿病患者は、II型(解糖系)線維において低いターンオーバー率を有するより大きな末梢LDを有する8,15,16。エネルギー貯蔵および放出におけるそれらの役割に加えて、誘導脂肪酸(FA)およびコートタンパク質(ペリリピン5)を介したLDは、FA酸化およびミトコンドリア生合成の転写調節に関与する重要なプレーヤーとしても機能し得る8。生理学および病態生理学におけるそれらの決定的な意味合いのために、LDsのダイナミクスおよび機能に関する詳細な研究が正当化される。
IMCLを研究するにはいくつかの手法がありますが、繊維固有の方法でLDのサイズ、密度、および分布を正確に定量化するのには適していません。例えば、磁気共鳴分光法によるIMCLの評価は、非侵襲的でありながら、繊維内のLDのサイズおよび正確な位置を研究するのに十分ではないレベルの分解能を提供し、繊維タイプ特異的ではない17,18。同様に、全筋ホモジネート19に対して行われる生化学的技術は、脂質の位置およびサイズを評価することができない。したがって、LDの形態および位置を分析するための最も適切な方法は、定量的透過電子顕微鏡13であるが、この技術は高価で時間がかかる。したがって、オイルレッドO(ORO)20,21、モノダンシルペンタン(MDH)22、またはボディピー23,24,25などの色素を含む調製物に対する共焦点蛍光イメージングは、これらの研究のための最良のツールとして浮上している。
ここでは、組織サンプリングと処理、ボディ染色、共焦点画像の取得と分析を含む完全なプロトコルが説明され、マウス筋肉凍結切片におけるLDのサイズ、数、および局在を定量化します。IMCLは酸化性繊維と解糖系繊維の間で均等に分布しておらず、各繊維タイプはLDダイナミクスを異なる方法で調節するので、IMCLの研究は繊維タイプ特異的でなければならない16,25,26,27。したがって、このプロトコルは、シリアルセクションの免疫蛍光を使用して、各ファイバーによって発現されるミオシン重鎖(MyHC)アイソフォームを同定します。このプロトコルのもう1つの利点は、解糖系(伸筋デジトルムロンガス、EDL)と酸化的(ヒラメ)筋肉を同時に処理して凍結前に並べて配置することです(図1)。この同時処理により、時間を節約できるだけでなく、サンプルの個別の処理による変動も回避されます。
<img alt="組織凍結および凍結切片のプロトコルスキーム。免疫組織化学と顕微鏡による図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63718/63718fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:手順の概略概要 筋肉解剖(1)後、類似の大きさの選択された筋肉が調製され、一緒に凍結される(2)。10μmの連続横切片は、クライオスタットを使用して得られ、接着スライドに直接取り付けられる(3)。2つの連続スライドから、第1の(4A)はラミニンについて免疫標識され、LDを認識するためにボディピーで染色され、第2の(4B)は筋線維タイプの認識のためにMyHCに対する抗体で免疫染色される。画像は、ボディピーの共焦点顕微鏡(5A)および筋線維タイプの落射蛍光顕微鏡(5B)を使用して取得される。フィジーでは、閾値を適用し、粒子(6A)を定量化して、LD(7)または計数細胞(6B)が占める総面積の数、平均サイズ、密度、および割合を取得して、セクション(7)内の各タイプの繊維の割合を得ることによって、画像が分析されます。略語: LDs = 脂肪滴;EDL = 伸筋デジトーラム・ロンガス;MyHCs=ミオシン重鎖アイソフォーム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63718/63718fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 モノラル 6 Mpix カメラ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm 1.4MPix CCD カメラ&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケミカルフード</td><td>ポトーラボ</td><td>EN-14175</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>コルクディスク (「オスラッシュ; 20 mm、厚さ 3 mm)」&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>クライオグローブ</td><td>テンプシールド</td><td>16072252</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>Microm Cryo Star HM 560</td><td></td></tr><tr><td>解剖実体顕微鏡 SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>AxioImage-Apotome Z1</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand 使い捨てベースモールド(0.7 x 0.7 cm)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>22-363-552</td> 凍結<td>用のコルクに筋肉を保持するピースをカット</td></tr>するために使用されます <tr><td>ガラスシャーレ(H 25&nbsp;mm、&oslash;150°Cmm)</td><td>ブランドシャーレ、MERK</td><td>のBR455751</td><td>解剖中に氷の上に筋肉を置くために使用されます</td></tr><tr><td>ImmEdge 疎水性バリア PAP ペン</td><td>ベクターラボ</td><td>H-4000</td><td>筋肉切片の周りに高ドロフォビックバリアを作成するために使用されます</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>MMM Medcenter</td><td>Incucell 707&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーグラス(24x50 mm)</td><td>アシスト&nbsp;</td><td></td><td></td>40990151</tr><tr><td>顕微鏡スライドボックス&nbsp;</td><td>Kartell</td><td>278</td><td>免疫組織化学のための湿潤チャンバーとして使用</td></tr><tr><td>ネックホルダー</td><td>Linie zwo</td><td>SB-035X-02</td><td>ステンレス製タンブラーを保持するためのストラップとして使用</td></tr><tr><td>No 15 滅菌炭素鋼メスブレード</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>Van Bleiswijck</td><td>Amazon B07W7KJQ2X</td><td>凍結切片の取り扱いに使用</td></tr><tr><td>油性マーカー ペン ブラック</td><td>Klinipath/VWR</td><td>98307-R</td><td>スライドのラベル付けに使用</td></tr><tr><td>ピアス固定鉗子</td><td>F.S.T</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンボックス&nbsp;</td><td></td><td></td><td>H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm、液体窒素容器およびサンプルをクライオスタットに輸送するために使用されます</td></tr><tr><td>メスハンドル、125 mm(5インチ)、No.3</td><td>Aesculap</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチールカップ10オンス&nbsp;</td><td>エボクサー</td><td>B07GFCBPFH</td><td>タンブラーは、筋肉凍結のためにイソペンテンを充填します</td></tr><tr><td>スーパーフロストウルトラプラススライド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>外科用ピンセット 1/2歯</td><td>Medische Vakhandel</td><td>1303152</td><td>「ラットの歯のピンセット」とも呼ばれます</td></tr> <tr><td>Vannas 春のはさみ - 3 mm カッティングエッジ</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>計量ボート</td><td>VWR国際</td><td>611-2249</td><td></td></tr><tr><td>蛍光</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 ヤギ アンチマウス IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600477</td><td>最終濃度 1:500</td></tr><tr><td>で使用 Alexa Fluor 488 ヤギ アンチマウス IgG1</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21121</td> で<td>使用最終濃度 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ヤギ 抗マウス IgM</td><td>Abcam</td><td>ab175702</td><td>最終濃度 1:1,000 で使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ヤギ抗ラット IgG (H+L) 二次抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21247</td><td>最終濃度 1:500</td></tr><tr><td>で使用 BODIPY-493/503 (4,4-ジフルオロ-1,3,5,7,8-ペンタメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセノ)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D3922</td><td>最終濃度1 & microで使用。g / mL</td></tr><tr><td>BODIPY-558/568 C12 (4,4-ジフルオロ-5-(2-チエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ドデカン酸)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーD3835</td><td>最終濃度1 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーD1306</td><td>最終濃度0.5 & microで使用。g/mL</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8418</td><td>1 mg/mL ストック溶液のボディの溶解に使用 CAUTION: 毒性があり、可燃性。蒸気は刺激を引き起こす可能性があります。ヒュームフードで操作します。皮膚に直接触れないようにしてください。ゴム手袋、保護メガネを着用してください。</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液4%、緩衝液、pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004969011</td><td>注意: アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。遺伝的欠陥を引き起こした疑いがあります。がんの原因となることがあります。ヒュームフードで操作します。皮膚に直接触れないようにしてください。ゴム手袋、保護メガネを着用してください。</td></tr><tr><td>イソペンタンGPR RectaPur</td><td>VWRインターナショナル</td><td>24872.298</td><td>CAUTION:非常に可燃性の液体と蒸気。飲み込んで気道に入ると致命的となる可能性があります。眠気やめまいを引き起こす可能性があります。繰り返しさらされると、肌の乾燥やひび割れの原因になります。保護手袋/保護服/目の保護具/顔の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td><ストロング>注意</ストロング>:&nbsp;非常に寒い。手袋を着用してください。沸騰や飛沫を最小限に抑えるために、換気の良い場所でゆっくりと取り扱ってください。低温液体用に設計された容器を使用してください。</td></tr><tr><td>マウスオンマウスブロッキング試薬&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>MKB-2213-1</td> 1<td>:30の濃度で使用</td></tr><tr><td>ミオシン重鎖I型(BA-D5-s一次抗体) 遺伝子:MYH7、モノクローナルウシ抗マウスIgG2b</td><td>DSHB アイオワ大学</td><td>BA-D5-上清</td><td>最終濃度1:10で使用</td></tr><tr><td>ミオシン重鎖IIA型(SC-71-s一次抗体) 遺伝子:&nbsp;MYH2、モノクローナルウシ抗マウスIgG1</td><td>DSHB アイオワ大学</td><td>SC-71-上清</td><td>最終濃度1:10で使用</td></tr><tr><td>ミオシン重鎖IIX型(6H1-s一次抗体)、遺伝子:&nbsp;MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>6H1-supernatant</td><td>最終濃度 1:5</td></tr><tr><td>で使用 Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0.1 M</td><td></td><td></td> 組織<td>学研究室で一般的に使用</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗ラミニン-2 (&α;-2 鎖) 一次抗体 (モノクローナル)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L0663</td><td>最終濃度1:1,000で使用</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T 化合物</td><td>Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>アドビ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td>のフィギュアのデザインに使用。<td></td><td>共焦点ソフトウェア</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>フィギュアのデザインに使用</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td> <td>取得した画像の分析に使用</td></tr><tr><td>マイクロソフト PowerPoint</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td>繊維タイプをスキャンした後、筋肉全体の組織学を再構築するために使用</td></tr><tr><td>Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td>繊維の種類をスキャンした後、筋肉全体の組織学を再構築するために使用されます</td></tr></tbody></table>

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

筋症として知られている骨格筋脂質浸潤は、肥満および老化とともに増加する。筋症はまた、心血管疾患および癌のようないくつかの他の障害のための負の予後因子として最近発見されている。過剰な脂質浸潤は筋肉量と強度を低下させます。それはまた、総筋細胞内脂質含量、脂肪滴(LD)形態、および細胞内分布に依存して脂肪毒性およびインスリン抵抗性をもたらす。酸化繊維は脂質を利用する能力が大きいため、繊維タイプ(酸化性対解糖系)も重要です。病態生理学におけるそれらの決定的な意味合いのために、LDのダイナミクスおよび繊維タイプ特異的な方法での機能に関する詳細な研究が正当化される。
本明細書では、筋細胞内脂質含量の定量化およびLD形態および細胞内分布の分析をファイバータイプ特異的な様式で分析するための完全なプロトコールが提示される。この目的のために、連続筋凍結切片を、蛍光色素Bodipyおよびミオシン重鎖アイソフォームに対する抗体で染色した。このプロトコルは、異なる筋肉の同時処理を可能にし、時間を節約し、可能性のあるアーチファクトを回避し、フィジーで作成されたパーソナライズされたマクロのおかげで、LD分析の自動化も可能です。

本明細書に記載されるプロトコルは、ファイバータイプおよびサブセルラー特異的な様式でLDsを容易に定量するための効率的な方法を提供する。EDLとヒラメなどの同様のサイズの2つの筋肉を一緒に凍結することによって、次のステップに費やされる時間とリソースが半分に減少する方法を示しています。
免疫染色、画像取得、および成体マウスの筋肉で発現するさまざまなMyHCアイソフォームの分析のための完全なプロトコルが提供されています。このプロトコルは、1989 33でSchiaffinoらによって最初に設計されたものに基づいており、ラミニンを標識するための追加の抗体の使用など、いくつかの調整が加えられています。この後の修飾は、IIb型線維の位置にとって重要であり、いずれの抗体でも染色されないため黒色になります。図5に示すように、この免疫組織化学的プロトコルは、マウスの低酸化性(I型およびIIa型)および速解糖系(IIx型およびIIb型)線維の認識を...

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

このプロトコルは、脂肪滴の定量化および線維型特異的な様式でのそれらの形態および細胞内分布の分析を可能にする。この技術により、異なる筋肉の同時処理が可能になり、時間を節約し、独立して処理されたときに発生する可能性のあるアーチファクトを回避できます。また、脂肪滴定量の自動化も可能になります。筋食症は海洋筋肉で評価されましたが、このプロトコルは肥満、老化、癌などのさまざまな状態の人間に翻訳することができます。平行したセクションで同じ繊維を認識することは難しいかもしれませんが、軸索の微調整や筋肉の紡錘などの顕著な構造は、研究者が両方のスライドで同じ繊維を見つけるのに役立つ良いランドマークです。まず、筋標本の2つの連続クライオ凍結断面を2つの予め標識された接着スライド上に配置する。1 つのスライドは繊維の種類を決定し、もう 1 つは脂質含有量を定量化します。筋線維型の免疫組織化学的検出のために、疎水性ペンで描かれた輪郭で切片を囲む。湿潤チャンバーに入れ、氷冷0.1モルPBSで室温で1分間すすいでください。次に、PBSを取り出し、ブロッキング溶液をスライドに加え、摂氏37度で90分間インキュベートする。その後、ブロッキング溶液を取り出し、一次抗体を含む溶液と共に37°Cでスライドを90分間インキュベートする。スライドをPBSで3回、室温でそれぞれ5分間洗浄する。二次抗体を含む溶液を加え、室温で1時間暗所でスライドをインキュベートし、その後、スライドを光から遠ざけ、PBS中で3回の洗浄をそれぞれ5分間進め、スライドを二重蒸留水ですすぎ、余分な水を除去した後、スライドを退色防止試薬で取り付け、光から保護された摂氏4度で保管する。脂肪滴を体で染色するには、筋肉部分を疎水性ペンで描いた輪郭で囲み、氷冷0.1モルPBSで10分間すすいでください。両方のスライドを同時に染色する必要があります。メタノールを含まない冷たい4%パラホルムアルデヒドでセクションを室温で10分間固定する。最初のクイックリンスの後、スライドをPBSで5分間3回洗浄します。PBS中の5%正常ヤギ血清でスライドをヒトチャンバーで1時間ブロックします。続いて、スライドをPBS中の2%正常ヤギ血清およびラット抗ラミニンを含む一次抗体の溶液と共に90分間インキュベートした。スライドをPBSで3回洗浄した後、PBS中でヤギ、抗ラット、Alexaフルア647抗体を含む二次抗体溶液と室温で1時間インキュベーションを行う。スライドがライトから保護されていることを確認します。インキュベーション後、スライドをPBSで3回洗浄する。次に、セクションをダピおよびボディピ溶液で20分間インキュベートする。すすぎを軽くした後、PBSで3回洗い、2倍の蒸留水で1回洗った後、余分な水を取り除き、退色防止試薬でセクションを取り付けます。筋肉をス

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医学

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