Name: MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶMALDI-TOF質量分析法による酵素分解RNA断片の同定法。少量サンプルでin vitro実験が可能で、DNAやタンパク質研究にも応用できる信頼性の高い手法です。

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この研究は、3つの機関、2つの研究グループ、1つのコア施設間の共同作業であったことに注意することが重要です。分布および作業負荷を以下のように実施した:タンパク質(Xrn−1)発現は、デンバー大学(コロラド州デンバー)で行った。オリゴヌクレオチドの合成、定量、および実験(主に酵素分解)をコロラド大学デンバー校(コロラド州デンバー)で行った。最適化もそこで行われました。MALDI-TOFの発見、取得、分析は、コロラド州立大学の分析資源コアファシリティで実施されました。(コロラド州フォートコリンズ)。SSはUROP賞(CUデンバー)とユーレカ助成金(CUデンバー)の支援を認めたいと思います。E. G.C. は、R00GM115757 を介して NIGMS からのサポートを認めています。MJER は、1R15GM132816 を介して NIGMS からのサポートを認識しています。K.B. はリソース ID: SCR_021758 を確認します。この研究は、ヘンリー・ドレフュス財団の教師学者賞(MJER)、TH-21-028によっても支援されました。

<ol><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+polymer+analyses+up+to+m%2Fz+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li>
<li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73(2003).</li>
<li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin%3A+Source%2C+synthesis%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Forests%22%5BJournal%5D)">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516(2021).</li>
<li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn%2C+emmer+spelt%2C+common+wheat%2C+and+tritordeum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li>
<li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li>
<li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li>
<li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+%28MALDI%29+mass+spectrometry%3A+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li>
<li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li>
<li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li>
<li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li>
<li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).</li>
<li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+%CE%B7+and+%CE%BA+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).</li>
<li>Su, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).</li>
<li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS%2FMS+and+Top-Down+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).</li>
<li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+%288-oxoG%29+by+the+exoribonuclease+Xrn-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).</li>
<li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2%27-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).</li>
<li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li>
<li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5%27-mononucleotides+by+a+5%27+leads+to+3%27+mode+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li>
<li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).</li>
<li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li>
<li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).</li>
<li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li>
<li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule%2Fpeptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li>
<li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521(2022).</li>
<li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

このワークフローの主な課題は、実験の完了と質量分析の実行の間に生じました。実験はコロラド大学デンバー校で実施され、完了し、コロラド州立大学の施設に(一晩)出荷された。データ取得は、便宜上、受領時に実施した。いくつかの予期せぬ状況により、プロセスの時間遅れが発生しました。ある例では、予期せぬ機器の誤動作により、発見と取得の前にサンプルを凍結(21日間1回)する必要がありました。しかし、この時間の遅れは実験結果に影響を与えていないようであったが、RNAの分解(シグナル強度の低下につながる)を排除することはできない。
記載された実験の限界は、RNA濃度に関して、単一のRNA配列23、24について、インビボで得ることができるものよりも高い[RNA]を用いて実験を行ったことであった。我々は、20pmolのRNA(プレート上に2pmolのスポット)またはそれより低い量で実験を行った場合、期待されるピークは観察されないことを見出した。レーザー出力が向上した分光器...

MALDI-TOF 1,2,3は、さまざまなサイズおよび特性の分子の特性評価および/または検出に広く使用されている技術です。その用途には、天然資源4からのタンニンの検出、食品中の代謝産物のイメージング5、細胞薬物標的またはマーカーの発見またはモニタリング6、臨床診断7など、さまざまな用途が含まれます。本研究に関連するのは、DNAまたはRNAを用いたMALDI-TOFの使用であり、オリゴヌクレオチドに対するその使用は30年以上前にさかのぼる8、そこでいくつかの制限が指摘された。この技術は、現在、生体高分子9の両方を特徴付け、化学的および生化学的反応を同定/理解するために、信頼性が高く一般的に使用される手段、例えば、RNA10中の白金化部位の特性評価、鎖切断後のRNA断片の同定11、12、またはタンパク質-DNA架橋の形成13に進化した。.したがって、この手法を使用する際の重要な側面を説明し、強調することは有益です。MALDI-TOFの基本は、ビデオフォーマットで説明されており、14と同様に、本明細書ではさらに詳しく説明しない。さらに、DNAまたはタンパク質の文脈におけるその適用は、前記フォーマット15、16、17において以前に記載および例示されている。
酵素加水分解後に形成されるRNA断片を検出するためのプロトコールが本明細書に報告される。実験モデルは、我々のグループ18によって発表された最近の知見に基づいて選択され、MALDI-TOFを用いて、酸化的病変8-oxoGを含むRNAのエキソリボヌクレアーゼXrn-1とオリゴヌクレオチドとの間のユニークな反応性を決定した。20ヌクレオチド長鎖を固相合成19、[5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA GU]により得、Xrn-1は前述の報告20に従って発現および精製した。簡単に言えば、Xrn−121は、酸化RNA22を含む複数のタイプのRNAを分解する様々な重要な生物学的役割を有する5'−3'エキソリボヌクレアーゼである。8-oxoGに遭遇すると酵素のプロセス性が失速し、5'-リン酸化末端[5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5'-H2PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG)cua AAA GU]、および[5'-H2PO4-(8-oxoG)CUA AAA GU]18を含むRNA断片が生じたことが判明した。
最後に、質量分析は、様々な方法論を通じて、他の目的に適合させることができる強力な方法であることに注意することが重要です23,24。したがって、適切なイオン化方法と他の実験セットアップを選択することが最も重要です。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL MCT 目盛り付きバイオレット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6'-トリヒドロキシアセトフェノン一水和物 98%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル 99.9%、HPLC グレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン三リン酸、10 mM</td><td>ニューエングラングバイオサイエンス</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸アンモニウム、二塩基性 98%</td><td>シグマAldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr>フ<tr><td>ッ化アンモニウム98.0%、ACSグレード</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Bruker細菌試験基準</td><td>Bruker Daltonics 8255343</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート、97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>フレックス分析の商用ソースソフトウェア</td><td>Bruker daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis ソフトウェアバージョン 3.4、Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 UV-vis 分光光度計</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI プレート: MSP 96 グランドスチールターゲット</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF 質量分析計 (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Milipore Sigma</td><td></td><td>A Mili-Qシステムは、この作業で使用したすべての水を精製するために使用されました</td></tr><tr><td>OmegaTM膜付きNanosep遠心装置 10 K、青色(24 /pkg)</td><td>ポールコーポレーション</td><td>OD010C33</td><td>フィルターメディア、オメガ(変性ポリエーテルスルホン)10 Kポアサイズ</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>これはソリューションB</td></tr><tr><td>オリゴアナライザーツール</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>ですhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>ピペットチップ P10</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ P200</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNase アウェイ</td><td>モレキュラーバイオプロダクツ</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー</td><td>新製品England BioLabs</td><td>B0201S</td><td>This is solution A</td></tr><tr><td>Triflouroacetic Acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 exoribonuclease</td><td>Expressed in house</td> See <td>ref. 20</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 & micro;LピペットチップにはC18標準0.6&microが装填されています。Lベッド</td></tr></tbody></table>

maldi−tof質量分析法を用いた酵素分解によるrna断片の同定

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNAは生命のすべてのドメインに存在する生体高分子であり、他の分子および/または反応種、例えばDNA、タンパク質、イオン、薬物、およびフリーラジカルとの相互作用は遍在している。その結果、RNAは、その切断、分解、または修飾を含む様々な反応を受け、別個の機能および含意を有する生物学的に関連する種をもたらす。1つの例は、グアニンの7,8−ジヒドロ−8−オキソグアニン(8−oxoG)への酸化であり、これは活性酸素種(ROS)の存在下で起こり得る。全体として、このような製品と変換を特徴付ける手順は、科学界にとって主に価値があります。この目的のために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)質量分析法は広く使用されている方法である。本プロトコールは、酵素処理後に形成されたRNA断片を特徴付ける方法を記載する。選択されたモデルは、RNAとエキソリボヌクレアーゼXrn-1との間の反応を使用し、酵素消化は酸化部位で停止する。2つの20ヌクレオチド長のRNA配列[5'-CAUガアACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5'-CAUガアACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]を固相合成によって得、UV-vis分光法によって定量し、MALDI-TOFを介して特徴付けた。次いで、得られた鎖を(1)5'-リン酸化し、MALDI−TOFを介して特徴付け;(2)Xrn-1で処理する工程;(3)濾過および脱塩;(4)マルディ-TOFを介して分析する。この実験セットアップは、Xrn-1の失速に関連する断片の明確な同定につながった:[5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua aaa gu]、および[5'-H2PO4-(8-oxoG) cua aaa gu]。記載された実験を、200個のピコモールのRNA(MALDI分析に20pmol使用した)を用いて実施した。しかし、量が少ないと、この作業で使用されたものよりも強力なレーザー光源を使用する分光器で検出可能なピークが生じる可能性があります。重要なことに、記載された方法論は一般化され、RNAおよびDNAを含む他のプロセスの産物同定に拡張することができ、他の生化学的経路の特性評価/解明に役立つ可能性がある。

この作業で使用したオリゴヌクレオチドは、使用前に合成、特性評価、および定量を行った。すべてのオリゴヌクレオチドの濃度は、二次構造の潜在的な形成から生じる誤った読み取り値を避けるために、90°Cで記録されたUV-vis分光法 を介して 決定された。 図3 は、この作業で用いたRNAのモデルオリゴヌクレオチドを、室温で、かつ熱を加えた後に採取したスペクトルを示す。
全体的な手順は、Xrn−1失速を引き起こす酸化的病変の構造と共に、 図4に示されている。オリゴヌクレオチド(1)は、位置−11に1つの8−oxoGを含み、Xrn−1活性が遮断され、RNA鎖の加水分解が停止する場所である。重要なことに、この図に描かれた結果は、200pmolの親鎖を含む溶液(1)を用いて実施された実験に対応するが、プレート上には20pmolのみが斑点を付けられた。すべての計算で平均質量が使用され、1〜3原子質量単位(amu)間で異なる不一致が観察されたことに注意することが重要...

MALDI−TOFを用いて、酸化されたRNAとエキソリボヌクレアーゼXrn−1との間の反応性から得られた断片を特徴付けた。本プロトコルは、RNAおよび/またはDNAを含む他のプロセスに適用できる方法論を記載する。

MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

質量分析法は、様々な用途に広く採用されている。この記事の方法論は、in vitro酵素プロセスから得られたRNA断片の明確な特性評価を提供します。この技術の利点には、分子鉄ピークが得られること、in vitro適用のために少量の材料で実験を行うことができること、およびプロトコルを最小限のトレーニングで達成できることが含まれる。記載された方法論は、DNA、RNA、またはタンパク質を含むプロセスの研究に広く適用することができる。例としては、交差情報などの生化学的変換、化学修飾の同定、または他の生体高分子相互作用および反応性が挙げられる。1つの困難は、MALDI分光計またはこのサービスを提供するコア施設へのアクセスから発生する可能性があります。別の態様は、機器に応じて高くても低くてもよい検出限界を確立することである。まず、UV-Vis分光光度計をオンにし、PerkinElmer UV WinLabアイコンをクリックして機器操作制御ウィンドウを開きます。機器の右側にあるスイッチを使用してペルチェ温度コントローラ分光光度計をオンにし、[基本メソッド]の下にあるScan-Lambda 365をクリックします。別の画面が開き、セルホルダーが空であることを確認するようにユーザーに求めます。OKをクリックし、計測器がシステムチェックを実行できるようにします。次に、[データ収集]を選択してスキャンパラメータを調整します。[スキャン設定] の下の新しいウィンドウで、開始を 350 ナノメートルに、終了を 215 ナノメートルに変更します。アクセサリーの左側にあるプラスを選択してペルチェをアクティブにします。次に、複数セルペルチェをクリックし、温度を摂氏25度に変更し、ペルチェオンをクリックします。サンプル情報タブに移動し、必要なサンプル数、名前、セル位置を入力します。オートゼロをクリックし、背景溶液を含むキュベットを挿入します。「スタート」をクリックし、キュベットを目的のセルに挿入し、キュベットウィンドウが器具の前面と平行に向いていることを確認します。次に、[OK]をクリックして、最初のスキャンを摂氏25度で開始します。より高い温度での測定の場合は、マルチセルペルチェをクリックし、温度を目的のサンプル温度に変更してスキャンを繰り返します。[ファイル]、[エクスポート]の順にクリックし、目的のファイルの場所を選択し、[XY Data]を選択してテキストファイルを取得します。RNAの5'リン酸化を行うには、33.5マイクロリットルのRNase非含有水、5マイクロリットルの溶液A、10ミリモルのアデノシン三リン酸6マイクロライト、200マイクロモルRNA水溶液の1マイクロライト、および4.5マイクロリットルのポリヌクレオチドキナーゼを加えて、0.6マイクロリットルのマイクロ遠心管に溶液を調製し、溶液を穏やかに混合する。反応混合物を摂氏37度で45分間インキュベートし、それを水浴に入れる。その後、反応管をヒートブロックに入れ、摂氏65度で10分間予熱して酵素を失活させた。溶液を室温まで冷却し、最終的な5'リン酸化RNA溶液を得る。インキュベーション後、50マイクロリットルのこの溶液を使用し、5マイクロリットルの溶液B、および5マイクロリットルのXrn−1の1−フェムトモール溶液を加えてRNA加水分解を行う。反応管を室温で2時間インキュベートする。この反応混合物を10キロダルトン細孔サイズの遠心装置に移し、濾液を0.6ミリリットルの遠沈管に移し、700倍Gで10分間遠心分離することにより酵素をろ過する。次いで、20マイクロリットルのRNase非含有水を加えて遠心管上の残留RNAを洗浄し、遠心分離を行った。最後に、この濾液を、10キロダルトンの細孔サイズの遠心装置で遠心分離によって以前に得られた濾液と結合し、分析のために溶液を摂氏0度または船で凍結する。サンプルを脱塩および濃縮するには、市販の陽イオン交換 C18 ピペットチップを使用して、その末端に C18 クロマトグラフィー媒体のベッドをロードします。このために、10マイクロリットルのピペットチップを10マイクロリットルのピペットの上に置き、このチップを50%アセチルニトリル水溶液で2回洗浄する。毎回使用済み容量を別々の廃管に廃棄し、C18チップを10マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸水溶液で2回平衡化します。C18チップをピペットから手動で取り外し、P200ピペットチップが入った200マイクロリットルのピペットに固定します。次いで、Xrn-1によるRNAのオリゴヌクレオチドの加水分解中に調製した溶液にC18チップを浸漬し、C18チップを介して溶液を10回吸引放出する。次に、C18チップをP200ピペットから取り外し、10マイクロリットルのピペットに下ろし、0.1%トリフルオロ酢酸溶液の水溶液を使用してC18チップを2回洗浄します。使用済みの容量は、毎回別の廃管に廃棄してください。C18チップを10マイクロリットルのRNaseフリーの水で2回洗浄します。MALDIプレート上にスポッティングするために、サンプルを所望のマトリックスに浸漬し、溶液をチューブに10回分注することによって、C18チップからRNAオリゴヌクレオチドを溶出させる。この溶液をプレート上のそれぞれ1マイクロリットルの2つの別々のスポットにピペットで出し、スポットを風乾させます。この研究で使用されたRNAの濃度は、二次構造の潜在的な形成から生じる誤った読み取りを避けるために、摂氏90度で記録されたUV可視分光法によって決定された。イベントの全体的なシーケンスには、2 つの部分が含まれていました。一つは、RNAの効率的な5'リン酸化が、予想される産物に対応する1つのピークのみの出現によって証明される。そして2つは、Xrn−1によるサンプル混合物の処理から生じる失速断片である。2つの酸化病変を含む異なる配列を用いて同じ結果が得られた。考慮すべき潜在的な変更には、フィルタリング装置の使用を排除すること、またはMALDIスポッティングのための異なる行列を考慮することが含まれる。例えば、シナピン酸やピコリン酸が挙げられる。RNA断片を酵素プロセスから得た。このプロセスは、MALDIを結合させることによって確立され、電気泳動分析、固相合成、および円二色性。記載されたプロトコルは、化学科学の研究から生物医学分野での応用まで、さまざまな分野で使用される可能性を秘めています。

identification-rna-fragments-resulting-from-enzymatic-degradation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

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