組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)
2022年6月10日
マウス切歯には、幹細胞ニッチに貴重なラベル保持細胞が含まれています。私たちは、ラベル保持細胞を偏りなく検出して定量化する新しい方法を持っています。私たちの研究では、下顎骨のPEGASOS組織除去後のEdU標識と3D再構成アプローチを使用しました。
このプロトコルは、マウス切歯幹細胞ニッチのラベル保持細胞のin vivoおよび3次元可視化および定量化のための方法を記載する。この手法は、時間を節約し、新しい学習者にとってユーザーフレンドリーです。3D画像は、組織に損傷を与えることなく取得されます。
3D定量により、データの信頼性と精度が向上します。はじめに、下顎骨を解剖します。サンプルを4%パラホルムアルデヒドに固定し、室温で一晩保管します。
孵卵後、下顎骨から筋肉を取り除きます。それらを0.5モルのエチレンジアミン四酢酸溶液に浸し、摂氏37度の振とう機で毎日培地を交換しながら4日間脱灰します。下顎骨を摂氏37度のシェーカーで15ミリリットルの25%Quadrol溶液で1日間脱色し、残りの血液ヘムを除去します。
マウント全体の5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン染色の場合は、本文に記載されているように、新しい5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジンラベルカクテルを準備します。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でTween 20またはPBSTで摂氏37度のシェーカーで30分間すすぎます。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でそれぞれ3分間繰り返し、続いて、新たに調製した5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識カクテルでシェーカーで一晩インキュベートします。
リン酸緩衝生理食塩水洗浄を3回繰り返し、下顎骨を本文に記載されている溶液に摂氏37度のシェーカーでそれぞれ6時間入れて連続脱脂質化を行います。下顎骨をtert-ブタノール-ポリエチレングリコール(tB-PEG)溶液で摂氏37度で2日間脱水し、毎日培地を交換します。2日後、安息香酸ベンジル75%、ポリエチレングリコール-メチルエーテルメタクリレート平均500またはPEG-MMA500、および3%クアドロールを含む安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体で下顎骨をクリアして、屈折率マッチングを取得し、透明性が得られるまで。
組織で透明化された下顎骨全体を、安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体のブランドキャビティスライドに取り付け、ガラスカバースライドで覆います。共焦点イメージングソフトウェアで、目的の画像取得パラメータを設定します。蛍光励起パネルで、蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザーを活性化します。
蛍光検出パネルで、スライダーを動かして測定する波長を選択します。ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に合わせて、カバーガラスの上に屈折率1.52の液浸オイルを一滴加え、取り付けた下顎骨を顕微鏡ステージに置きます。蛍光灯をオンにし、関心領域を画像化するための適切な倍率対物レンズを選択します。
ライブスキャンモードでは、視野を特定して、下顎骨の領域全体をX次元とY次元で視覚化します。マウス切歯における幹細胞ニッチの体積を正確にカバーする上下のZステージ取得パラメータを設定する。2マイクロメートルのZステップサイズを使用するか、要件に応じて使用します。
Zスタック画像ファイルをlif形式で取得して保存します。イメージングソフトウェアファイルコンバータを使用して、Zスタックイメージファイルをネイティブ形式のファイルタイプに変換します。イメージングソフトウェアで、「アリーナ」ボタンをクリックしてから、「イメージ」を選択します。
元の lif ファイルを選択し、マージされたファイルを選択します。画像はイメージングソフトウェアにインポートされます。インポートしたファイルをダブルクリックして、画像データセットを開きます。
イメージングソフトウェアで、ディスプレイ調整パネルにアクセスします。ディスプレイ調整パネルで、チャンネルの名前をクリックします。通常、デフォルトモードでは赤とラベル付けされます。
[画像のプロパティ]ウィンドウで、[マップされた色]タブをクリックします。[カラー タブ ファイル] オプションで [Fire Flow] を選択し、[OK] をクリックします。サンプルから背景蛍光と陽性蛍光を区別するために、表示色を選択します。画面の左上の [シーン プロパティ] ウィンドウで、[Add New Surface] というラベルの付いた青いアイコンをクリックします。
ボリュームアイコンの選択を解除すると、バックグラウンド蛍光の大部分が除去され、手動セグメンテーション中に正の蛍光がはっきりと表示されます。次に、[作成]タブをクリックし、[自動作成をスキップして手動で編集]タブを選択して、関心領域またはROIの手動セグメンテーションを開始します。手動サーフェス作成ウィザードで、[コンター]タブをクリックしてサンプルに基づいて方向を選択し、ROIを簡単にコンター化します。
次に、右隅のポインタメニューが選択モードになっていることを確認します。スライス位置を調整して、組織内のROIを見つけます。前述のように、ほとんどのバックグラウンド蛍光はすでに除去されています。
[描画] ボタンをクリックし、一時的な関心領域を描画します。ROI 以外の領域からの干渉を避けるために [可視性] オプションを [なし] に選択し、関心領域をスライスごとにセグメント化します。ROIの描画が完了したら、[サーフェスの作成]をクリックしてROIの3Dジオメトリを取得します。
手動サーフェス作成ウィザードの「編集」(Edit) ボタンをクリックし、「すべてマスク」(Mask All) を選択します。ポップアウトされたマスクチャンネルウィンドウで、チャンネル選択オプションのチャンネル1を選択します。その後、マスクを適用する前に[チャンネルを複製]を選択します。
マスク設定で、[内側/外側に一定]を選択し、ボクセルの外側サーフェスをゼロに設定します。[シーン プロパティ]ペインで、[サーフェス]オブジェクトの選択を解除し、[ボリューム]オブジェクトを選択します。ディスプレイ調整で、元の赤チャンネルの選択を解除し、マスクされた赤チャンネルを選択します。
また、色の強度を調整して、目的の3Dレンダリングおよび陽性標識された蛍光ROIを取得します。スポットアイコンをクリックして新しいスポットオブジェクトを作成し、3Dレンダリングされたラベル保持セルと比較的重なる3Dスポットを作成して、3Dレンダリングされたラベル保持セルを定量化します。下の矢印を使用して、スポット作成ウィザードのステップ間を移動します。
[完了] ボタンをクリックし、[統計] ボタンを選択します。次に、[全体] タブを選択して、画像内のスポットの総数の値を見つけます。5−エチニル−2−プライム−デオキシウリジン標識およびポリエチレングリコール関連溶媒系組織透明化処理の後、透明な下顎骨が得られた。
修飾サンプルを組織透明化プロセスのない通常の下顎骨と比較し、5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識を施した透明な下顎骨を共焦点イメージングに供した。切歯の光学切片は、XY平面における切歯頂部の幹細胞ニッチに標識保持細胞を示した。切歯頂点の3D画像構築は、上皮および間葉系幹細胞ニッチの両方で5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性ラベル保持静止幹細胞を示した。
5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性細胞を、間葉系標識保持細胞と同等に重複する定量用スポットに移した。間葉系ラベル保持細胞のみおよび上皮ラベル保持細胞に対してのみ作成されたスポットが画像に表示されます。上皮および間葉系ラベル保持細胞の定量も行った。
処理と透明化の特性は最も重要なステップであり、満足のいく結果を得るには、組織の用途に応じて最適化する必要があります。この方法は、S2VGFPレベルのLRCを視覚化したり、細胞系譜追跡で子孫の位置とその定量または寄与の詳細を取得したりするように変更することもできます。
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概要
本研究では、マウス切歯の幹細胞ニッチにおけるラベル保持細胞をin vivoで可視化および定量するための新しい手法を提示します。EdUラベル化とPEGASOS組織透明化後の3D再構築アプローチを用いることで、本手法はデータ収集の信頼性と精度を向上させます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 幹細胞研究
- 3Dイメージング技術
背景
- ラベル保持細胞は、幹細胞ニッチを理解する上で極めて重要である。
- マウス切歯は、これらの細胞を研究するためのモデルとして利用される。
- 従来の方法では、正確な定量化が困難な場合がある。
- PEGASOS組織透明化法により、細胞構造のより優れた可視化が可能になる。
研究目的
- ラベル保持細胞を定量化するためのユーザーフレンドリーな手法を開発すること。
- 生物学的試料における3Dイメージングの精度を向上させること。
- 幹細胞生物学および組織再生の研究を促進すること。
使用した手法
- マウス下顎骨の解剖。
- 室温で一晩、4%パラホルムアルデヒドを用いて固定。
- ラベル保持細胞を同定するためのEdU標識。
- PEGASOS組織透明化法を用いた3D再構成。
主な結果
- ラベル保持細胞の3Dでの可視化に成功した。
- 細胞の定量において精度の向上が実証された。
- 本手法は、時間の節約になり、ユーザーにとって使いやすいことが証明された。
- 得られたデータは、幹細胞ニッチに関するさらなる研究を支持するものである。
結論
- この新規手法により、ラベル保持細胞の研究が促進されます。
- 3Dイメージングは、幹細胞生物学に貴重な知見をもたらします。
- この技術は、当該分野の研究者に導入することが可能です。
よくある質問
業界への適応性
マウス切歯におけるラベル保持細胞（LRC）の定量的3D可視化により、成人幹細胞の恒常性とターンオーバーを高い信頼性で解析することが可能になります。このアプローチは、幹細胞ニッチのダイナミクスに関する予測信頼性を向上させ、再生医療および組織工学ポートフォリオにおける早期発見とメカニズム面でのリスク低減を支援します。本手法の非バイアス的な定量性と再現性は、トランスレーショナルリサーチおよび前臨床モデル開発における戦略的資産として位置づけられます。
バイオファーマ R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 仮説に基づいたターゲット検証のため、静止期幹細胞集団の直接的な定量を可能にする。
- 上皮性幹細胞と間葉系幹細胞の寄与を区別することで、メカニズム的なリスク低減をサポートする。
- 堅牢で再現性のある幹細胞ニッチデータを提供し、ポートフォリオの優先順位付けを促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けて、バリデーション済みの3D生物学的システムを調製します。
- アッセイの再現性と研究間の比較可能性を確保するため、標準化された定量的なアウトプットを提供します。
- 幹細胞の維持および分化に対する化合物の影響を、信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 組織再生および幹細胞ダイナミクスの研究において、疾患に関連したモデルと整合します。
- リネージトレーシングと子孫細胞の定量化を可能にすることで、発見から前臨床検証までの継続性を提供します。
- 再生医療および組織工学プログラムにおける、リスク調整後の推進決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この3D LRC定量法は、初期探索から前臨床研究までを統合し、仮説検証、ターゲット検証、およびトランスレーショナルモデルの開発を橋渡しします。
- ディスカバリーバイオロジー：幹細胞の恒常性における仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物評価のため、アッセイに適した再現性のある3Dイメージング出力を提供します。
- 分析：堅牢な統計的比較を可能にする、定量的従属変数測定値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：ディスカバリー段階から前臨床段階にかけてのバイオマーカーの整合性と連続性を実現します。
- エンタープライズ再利用：複数のプログラムにわたる幹細胞の定量化およびリネージトレーシングに利用可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：幹細胞研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：3D定量化およびイメージングのワークフローを標準化し、再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値：堅牢な定量データを提供することで、GO/NO-GO判断と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：再生医療および組織工学アセットのリスク調整後の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- 組織透明化、共焦点イメージング、および3D画像解析の専門知識が必要である。
- 高度なイメージング装置および互換性のある解析ソフトウェアへのアクセスが不可欠である。
- サンプル調製および定量プロトコルのチーム間での標準化が必要である。
- プロトコルの最適化により、さまざまな組織型やリネージトレーシングへの適用が可能である。
- 特定の組織状況に応じた透明化および処理工程の最適化に依存する。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Tissue Clearing of Mandible Using PEGASOS Technique
3:03
Confocal Imaging of Tissue-Cleared Mandible
4:37
Image Processing, 3D Image Reconstruction, and Quantification of Label-Retaining Cells
8:25
Results: Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors
9:50
Conclusion
