Name: 組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶPEGASOS組織透明化と3D再構成を用いたマウス切歯の標識保持細胞の可視化と定量法。EdUラベリングにより幹細胞ニッチの細胞動態を正確に解析し、再生医療研究への応用が期待される。

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原稿を編集してくれたメーガン・K・ホルトに感謝します。この研究は、NIH / NIDCR助成金DE026461およびDE028345、およびテキサスA&M歯学部からXiaofang Wang博士へのスタートアップ資金によってサポートされました。

ここに記載されているすべての方法は、テキサスA&M大学歯学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. EdUラベリングカクテルの準備
<ol><li>表1に記載のようにカクテルストック溶液を調製する。</li>
	<li>表1に記載されているようにEdUラベリングカクテルを準備します。</li>
</ol>2. マウスおよびEdU溶液の調製
<ol><li>EdU ソリューションを準備します。EdUを20 mg/mLのDMSOに溶解し、-20°Cの冷凍庫に保管します。 注意:EdUは変異原です。この物質を取り扱うときは、ユーザーは適切な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。</li>
	<li>5日齢のC57BL/6Jマウスに、調製したEdU溶液を腹腔内に3 μL/g体重で注射します。マウスは7日間連続して1日1回溶液を受け取らなければならない。次に、分析のために収穫される前に、6週間の追跡期間を経ます(図1)。 注意: マウスにEdUを注射するときは、針を刺さないように注意してください。EdUを7日間連続して注射した後、マウスを新しいケージに入れる。マウスが新しい家に入ったら、適切なバイオハザードルールを使用して古いケージの寝具を処分します。</li>
</ol>3.経心臓灌流によるサンプル調製(6週間の追跡期間後の生後53日齢マウス)
注:マウスの肝臓は、経心臓灌流が成功すると青白くなるはずです。
<ol><li>腹腔内注射でマウスを麻酔する。彼らはキシラジンとケタミン麻酔薬の組み合わせを与えられる必要があります(キシラジン10-12.5 mg / kg;ケタミン、80-100 mg / kg体重)。</li>
	<li>マウスが痛みを伴う刺激(足のピンチ反射など)に反応しなくなるまで、~10分間待ちます。</li>
	<li>マウスを発泡スチロール支持体上で安定した仰臥位に置き、各足に針を刺します。</li>
	<li>ピンセットとはさみを使用して上にある皮膚を開くことにより、胸腔を露出させます。</li>
	<li>鋭利なハサミを使用してダイヤフラムを切り開きます。心臓を突き刺さないように注意してください。</li>
	<li>胸郭を切り裂き、胸骨の付け根をクランプハサミでつかんで心臓を露出させます。</li>
	<li>マウスをヒュームフードの循環ポンプ近くの灌流ステージに移します。</li>
	<li>25 Gの針(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)/ 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で満たされたチューブから)を左心室の頂点に挿入します。針の先端を心室の内腔に保つように注意してください。 注意: PFAは中程度の毒性があり、発がん性の可能性があります。PPEを使用してPFAを処理し、化学ヒュームフードの下で溶液を調製します。廃棄物PFAは、施設のガイドラインに従って適切な処分を必要とします。</li>
	<li>針を左心室に挿入した直後に鋭利なハサミを使用して右心室を切断します。このステップにより、血液がマウスから流出し、収集皿に排出されます。</li>
	<li>サンプルを50 mLのPBS溶液で7 mL/分の流速で灌流します。</li>
	<li>PBS灌流後、活栓を切り替えて、5 mL/分の同じ流量で20 mLの4%PFA溶液の流れを可能にします。</li>
	<li>循環ポンプがまだオンの状態で、左心室から針を外します。 注意: マウスは組織収集用に固定されました。蛍光を維持するために、プロトコル全体を通して可能な限り光への曝露を避ける必要があります。組織の処理中、組織サンプルを含む50mLのコニカルチューブをアルミホイルで覆うことができます。</li>
</ol>4.ペガソス法を使用した下顎骨の組織除去
注:組織の体積に応じて15 mLまたは50 mLのコニカルチューブを使用して、各ステップでサンプルを処理できるようにしておくことができます。サンプルは、ステップ4.2から4.7まで37°Cの振とう機(~100 rpm)で処理されます。プラスチックが溶けないように、有機溶剤に耐性のあるポリプロピレンベースのプラスチック容器を使用してください。あるいは、ガラス製品を使用することもできます。
注意: ペガソスの組織透明化技術は、クアドロール、ポリエチレングリコール(PEG)、安息香酸ベンジル(BB)、MMA500などの有毒溶液を使用します。潜在的な曝露を避けるために、適切なPPEが必要です。
<ol><li>下顎骨を解剖し、さらに4%PFAでサンプルを固定します。室温で一晩保管してください。</li>
	<li>下顎骨から筋肉を取り除き、0.5 M EDTA溶液(pH 8.0)に浸して4日間脱灰します。この間、37°Cの振とう機で毎日培地交換を行います。 注:サンプルから筋肉をできるだけ取り除くことが望ましいです。この予防措置により、イメージングプロセスが簡素化され、筋肉からの自家蛍光が減少します。</li>
	<li>下顎骨を37°Cの振とう機で25%クアドロール溶液(H2O中でv/v)で1日間脱色し、残りの血液ヘムを除去します。</li>
	<li>完全なホールマウントEdU染色。<ol><li>表1に従って、新鮮なEdUラベリングカクテルを準備します。 注:最適なEdUラベリング結果を得るには、EdUラベリングカクテルを毎回新鮮にして、作りたてのアスコルビン酸塩溶液を追加する必要があります。</li>
		<li>下顎骨をPBSTで37°Cのシェーカーで30分間すすぎます。</li>
		<li>下顎骨をPBSで毎回3分間3回すすぎます。</li>
		<li>下顎骨を37°Cのシェーカーで一晩作りたてのEdUラベリングカクテルでインキュベートします。</li>
		<li>下顎骨をPBSで毎回3分間3回すすぎます。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の各溶液で37°Cで6時間連続脱脂を行います。 30%tert-ブタノール(tB)溶液:75%v/v H2O、22% v/v tB、および3%v/vクアドロール。 50%tB溶液:50%v/v H2O、47%v/v tB、および3%v/vクアドロール。 70% tB ソリューション: 30% v/v H2O、67% v/v tB、および 3% v/v クアドロール 注:脱脂質化ステップは重要です。脱脂質化は、30%および50%tB溶液中で4〜6時間、および70%tB溶液中で1日間行うことができる。</li>
	<li>下顎骨をtB-PEG溶液で2日間脱水し、次の毎日の培地交換を行います:75%tB、22%v/vポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート平均MMA500、および3%v/vクアドロールを37°Cで。</li>
	<li>安息香酸ベンジル(BB)-PEG透明媒体で下顎骨をクリアして、屈折率マッチングを取得します:透明度が達成されるまで、75%v / v BB、22%v / v PEG-MMA500、および3%クアドロール。 注:屈折率マッチングに関する情報があります。水、脂質、タンパク質、ミネラル、細胞小器官などの組織内の無機および有機成分。1.33〜1.55の範囲で異なる屈折率(RI)を有する。組織成分間のこのRIミスマッチは、イメージングプロセスを妨げる。透明性は、組織内のRIミスマッチを排除することによって達成できます。組織透明化サンプルをBB-PEGの透明化媒体に浸すことをお勧めします。このステップにより、標本全体に~1.54の均一な内部RI(RIマッチングと呼ばれる)が得られ、イメージングプロセスが容易になります。</li>
	<li>下顎骨をBB-PEG組織透明化培地に室温で保存し、保存およびイメージングを行います。 注意: 蛍光レポーターが徐々に失われないように、できるだけ早くイメージングを完了することをお勧めします。ただし、PEGASOS法は、数週間の保存後でも蛍光レポーターをよく保存します20,21。長期保存の場合、サンプルは4°Cで保存することもできます。</li>
</ol>5.組織クリア下顎骨の共焦点イメージング
<ol><li>BB-PEG透明化培地のブランドキャビティスライドに下顎骨全体を組織で取り除き、ガラスカバースライドで覆います。気泡を避けてください。</li>
	<li>適切なレーザー走査型共焦点顕微鏡で画像取得を行います。[取得]を選択し、画像 取得 パラメータを512 x 512ピクセル解像度と400Hz取得速度に設定します。これらの設定は、顕微鏡を制御するソフトウェアの取得モードメニューにあります。</li>
	<li>蛍光励起パネルでは、蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザー(TRITC)を活性化します(LRCの可視化に使用したプローブは、548 nmでの励起と563 nmのレーザー波長での発光を伴うCy3などの蛍光特性を持っています)。</li>
	<li>蛍光検出パネルで、スライダーを動かして測定する波長を選択します(たとえば、Cy3様蛍光色素の場合は555〜625 nm)。</li>
	<li>取り付けた下顎骨を顕微鏡ステージに置き、白色光と低倍率の対物レンズ(2〜10倍)を使用してサンプルを視覚化して見つけます。</li>
	<li>ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に合わせて、カバーガラスの上に屈折率1.52の液浸油を一滴加えます。 注意: 対物レンズ、イメージングメディア、および組織の屈折率をできるだけ一致させて、画像取得中の光学的歪みの発生を最小限に抑えます。</li>
	<li>蛍光灯をオンにし、関心領域を画像化するための適切な倍率対物レンズを選択します。口径0.9、作動距離1.95mmの20倍対物レンズを使用しました。共焦点顕微鏡でより大きな組織サンプルをイメージングする場合は、より長い作動距離レンズが必要になる場合があります。あるいは、より大きな組織サンプルに対しては、ライトシート顕微鏡を使用して簡単にイメージングを行うことができます。</li>
	<li>共焦点イメージングソフトウェアで、ライブボタンを押して ライブ スキャンモードを開始します。画像のダイナミックレンジを最大化し、ピクセルの飽和を回避するには、選択したチャンネルのゲインとレーザー強度を調整します。</li>
	<li>視野を特定して、下顎骨の領域全体をX次元とY次元で視覚化します。マウス切歯の幹細胞ニッチの体積を正確にカバーする上下のZステージ取得パラメータを設定します。2 μmのZステップサイズを使用するか、要件に応じて使用してください。新しいバージョンの共焦点顕微鏡は、さまざまな重なり合う領域のzスタックを自動的に取得できるはずです。</li>
	<li>Zスタック画像ファイルを.lif形式で取得して保存します。 注:.lifハエは.tiffファイルに変換して、他の3D解析ソフトウェアに使用できます。</li>
</ol>6. 表面の作成、関心領域(ROI)のセグメンテーション、ROIのマスキング、スポットの作成によるラベル保持細胞の画像処理、3D画像再構成、定量化
注:画像処理と3D再構成にはImaris(ビットプレーン9.0.1)を使用しましたが、他のソフトウェアスイート(ImageJ / Fiji、3Dスライサー、Avizo、Arivis、Amiraなど)を使用して同様の画像処理手順を実行できます。
<ol><li>イメージングソフトウェアで、「 アリーナ 」ボタンをクリックしてから、「 イメージ」を選択します。元の .lifファイルを選択し、マージされた ファイル を選択すると、画像がイメージングソフトウェアにインポートされます。 注: または、イメージング ソフトウェア ファイル コンバータを使用して、Z スタック イメージ ファイルをソフトウェアのネイティブ形式のファイル タイプに変換します。たとえば、Imaris ファイル コンバータを使用して .lif ファイルを .ims ファイルに変換し、イメージング ソフトウェアで .ims ファイルを開きます。データをソフトウェアのネイティブファイル形式に変換すると、迅速なファイル変換が可能になり、エラーが最小限に抑えられます。</li>
	<li>インポートしたファイルをダブルクリックして、画像データセットを開きます。</li>
	<li>ディスプレイ調整パネルにアクセスし、チャンネルの名前をクリックします。通常、デフォルトモードでは赤とラベル付けされます。<ol><li>[画像のプロパティ]ウィンドウで、[マップされた色]タブをクリックします。カラーテーブルファイルオプションで、ファイアフローを選択し、OKをクリックします。表示色は通常、サンプルからのバックグラウンド蛍光と陽性蛍光を区別するために選択されます。</li>
	</ol></li>
	<li>画面の左上の [シーン – プロパティ ] ペインで、[ 新しいサーフェスの追加] というラベルの付いた青いアイコンをクリックします。 ボリューム アイコンの選択を解除すると、バックグラウンド蛍光のほとんどが削除され、陽性蛍光がはっきりと表示されます(ステップ6.4.2を参照)。<ol><li>関心領域(ROI)の手動セグメンテーションのプロセスを開始するには、[作成]タブをクリックし、[自動作成をスキップして手動で編集]タブを選択します。手動サーフェス作成ウィザードで、[コンター]タブをクリックして、サンプルに基づいて方向(XY、YZ、またはXZ)を選択し、ROIを簡単にコンター化します。ここでは、XY方向を選択します。</li>
		<li>次に、右隅のポインタメニューが選択モードになっていることを確認します。スライス位置を調整して、組織内のROIを見つけます。ステップ6.4で述べたように、バックグラウンド蛍光のほとんどが明確な正の蛍光で除去されていることに気付くでしょう。[描画]ボタンをクリックして、一時的な関心領域を描画します。ROI 以外の領域からの干渉を避けるために、[可視性] オプションを [なし] に選択します。</li>
		<li>手順 6.4.2 を繰り返します。スライスごとに、関心領域全体を描画します。</li>
		<li>ROIの描画が完了したら、[ サーフェスの作成 ]をクリックしてROIの3Dジオメトリを取得します。</li>
		<li>手動サーフェス作成ウィザードの「 編集」(Edit ) ボタンをクリックし、「 すべてマスク」(Mask All) を選択します。</li>
		<li>ポップアウトされた マスク チャンネルウィンドウで、チャンネル選択オプションで チャンネル 1を選択します。その後、[ マスクを適用する前にチャンネルを複製]を選択します。マスク設定で、[ 内側/外側に一定 ]を選択し、ボクセルの外側サーフェスを 0 に設定します。</li>
		<li>[シーン プロパティ]ペインで、[サーフェス オブジェクト]の選択を解除し、[ボリューム]オブジェクトを選択します。ディスプレイ調整で、元の「赤」チャンネルの選択を解除し、マスクされた赤チャンネルを選択して色の強度を調整し、目的の3Dレンダリングおよびポジティブラベルの蛍光ROIを取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>新しいスポットオブジェクトを作成します。まず、[スポット に追加 ] アイコンをクリックして、3D レンダリングされた LRC と比較的重なる 3D スポットを作成して、3D レンダリングされた LRC を定量化します。 下の矢印を使用して、スポット作成ウィザードのステップ間を移動します。<ol><li>スポット作成ウィザードには、ソフトウェアを使用してスポットを自動的に作成するための4つの連続した手順があります。最初のステップで [関心領域のみをセグメント化] オプションが選択されていることを確認します。 [次へ ]アイコンをクリックします。</li>
		<li>2番目のステップでは、「XYZ 3Dボックス」があります。ROIをカバーするようにXYZボックスを調整します。 [次へ ]アイコンをクリックします。</li>
		<li>3番目のステップで、[ ソースチャネル ]オプションに移動します。マスクされた赤いチャンネルを選択します。サンプル蛍光ドットにフィットして重ね合うように推定XYスポット径を入力する。 [次へ ]アイコンをクリックします。</li>
		<li>4番目のステップでは、「品質」フィルタータイプを追加し、識別可能なLRCの大部分にラベルが付けられるまで「品質」ヒストグラム上でスライディングウィンドウを移動して、低強度しきい値を調整します。 注:セグメンテーション、したがって統計的読み出し(例:セル数)は、強度のしきい値に大きく依存します。適切なしきい値を正確に設定するように注意してください。</li>
		<li>[ 完了 ]ボタンをクリックし、[ 統計 ]ボタンを選択します。 [全体] タブを選択して、画像内のスポットの総数の値を見つけます。</li>
		<li>[ファイルに表示]タブボタンをクリックして統計をエクスポートし、結果を.xlsファイルで受け取ります。</li>
		<li>適切な図を使用して、定量結果を提示します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

複数回投与の注射(BrdU、EdU)は、通常、増殖細胞を可能な限り標識するために、成長中の新生児マウスに使用されます1、6、13。追跡期間は、組織の再生率に関する重要なステップと見なされます6,13。マウス切歯は毎月更新されます。この特性により、研究者は追跡期間を4週間以上に設定できます4,5,22。私たちの6週間の追跡期間は、間葉系および上皮(唇および舌頸部ループ)コンパートメントの幹細胞を標識することができました。この領域には、上皮コンパートメントと間葉系コンパートメントの両方からのTAC(トランジット増幅細胞)の前駆細胞の一部が含まれていました。...

継続的に成長するマウス切歯は、成体幹細胞を研究するための優れたモデルです1。切歯の近位側に存在する上皮(唇と舌の頸部ループ)と間葉系幹細胞(唇と舌の頸部ループの間)は、アメロブラスト、歯芽細胞、歯髄細胞に分化します。このユニークなプロセスは、組織の喪失と代謝回転を補償するための細胞の供給源を提供します2。Sox2、Gli1、Thy1 / CD90、Bmi1などのいくつかの幹細胞マーカーですが。マウス切歯における成体幹細胞のサブセットについてインビボで同定されているが、それらは単独で使用した場合の幹細胞集団を表すには不十分である1、3、4、5。ヌクレオチド類似体DNAの標識と保持によって長寿命の静止細胞を可視化することで、成体幹細胞のほとんどのサブセットを偏りなく検出できます6。さらに、このアプローチは、多くの幹細胞同定方法7の中で、歯科幹細胞集団の細胞挙動および恒常性を理解するために有用である3、8。分裂した幹細胞は、かなりの追跡の後にDNA標識を失いますが、推定静止幹細胞はDNA標識を保持し、ラベル保持細胞(LRC)と見なします6。非分裂幹細胞によるDNA標識と保持は、推定成体幹細胞をニッチにマークして配置します。
過去数年間、チミジン類似体5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識は、細胞増殖アッセイ用の面倒で時間のかかる高解像度顕微鏡法に適合しない3H-チミジンDNA標識法に取って代わりました6,9。近年、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)標識技術がBrdUよりもますます使用されています。このパターンはいくつかの理由で現れました。まず、BrdU法は遅く、労働集約的です。使用条件はさまざまであり、検体の微細構造を保存することはできません(DNA変性のため)。同様に、BrdU法は細胞の抗原性を失うため、共局在実験やin vivo幹細胞移植などの下流の機能解析やアッセイには非効率的になります3、7、9、10、11、12。BrdUは催奇形性物質でもあり、胚発生におけるLRCの標識には適していません6。また、BrdU法は、ホールマウント試験片に使用すると非効率的です。欠点は、検体の深部での抗体の浸透性が低いこと、または深部浸透のために抗体のインキュベーション期間が長いことです13。EdU標識は、試料を変性させるステップを回避し、微細構造を保存します。この特徴は、共局在実験や幹細胞移植などの下流の機能解析に有利です11,12。また、EdUラベリングは非常に感度が高く迅速です。Cu(I)触媒による[3 + 2]環化付加反応(「クリック」化学)を介してEdU標識を検出するために、急速に吸収され、より小さなサイズの蛍光アジドを使用しているため、試料の浸透率は高くなります14。
ますます適用されている別のDNA標識法は、操作されたトランスジェニックマウスの使用です。これらのマウスは、テトラサイクリン応答性調節因子5,14によって制御されるヒストン2B緑色蛍光タンパク質(H2B-GFP)を発現する。マウスにテトラサイクリンチャウ/水を4週間から4ヶ月の追跡期間与えた後、GFP蛍光はサイクリング細胞で減少し、LRCのみが蛍光を保持します6。この方法の利点は、標識されたLRCを単離し、細胞培養または下流の機能解析のために生存し続けることができることです6,7。いくつかの研究は、長期使用のために追いかけられたときの静止幹細胞の不正確な標識を報告した。この結果は、H2B-GFP株からの漏出したバックグラウンド発現によるものであり、適切なテトラサイクリン調節応答によるものではなかった15。
さらに、過去のほとんどの文献では、LRCの検出を主に切片化されたスライドで使用していましたが、これは2次元であり、LRCの正確な位置と数を示すのに誤って偏っていることがよくあります。アプローチは、複雑な組織構造の切片に対して誤った角度を表示しました16。もう一つは、連続切片から3D画像を取得し、ポスト画像再構成を行う方法であった。これらのステップは、圧縮または引き伸ばされたセクションによる各シリアルセクションの変動による画像の歪みのために不正確であり、その結果、情報が欠落した16、17、18。この方法はまた、面倒で時間がかかりました。
LRCのホールマウントイメージングを容易にするには、蛍光を十分に維持しながらサンプルを透明化する必要があります。現在の組織透明化技術は、3つの主要なカテゴリーに分類することができる:有機溶媒ベースの組織透明化技術、水性試薬ベースの組織透明化技術、およびヒドロゲルベースの組織透明化技術17,19。ポリエチレングリコール(PEG)関連溶剤系(PEGASOS)が最近開発されました。このアプローチは、ほぼすべてのタイプの組織を透明にし、骨や歯などの硬組織を含む内因性蛍光を維持します20。PEGASOS法は、特に歯や骨の材料の除去において、他の組織透明化方法よりも優れています。他のほとんどの方法は、硬組織を部分的にしか除去できず、処理時間が長く、または高価な試薬を必要とする21。また、PEGASOS法は、他の方法よりも内因性蛍光を効率的に保存することができます。
この文献により、細胞研究のための新しい方法を作成しました。EdU標識のLRC検出の利点と、組織クリア標本の最も優れた3Dホールマウントイメージングを組み合わせました。サンプルは、高度なポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム(PEGASOS)組織透明化技術15で処理されました。硬組織の透明性により、歯や下顎骨を壊すことなく、 in vivoで LRCの蛍光の3Dシグナルを再構築することができ、LRCをより正確に視覚化および定量する方法を作成しました。
この研究では、マウス切歯のLRCを視覚化するための革新的なガイドを提供します。マウス切歯幹細胞ニッチ内のLRCの位置と量を決定するために、3D視覚的アプローチを行いました。このプロジェクトでは、EdUラベリング、PEGASOS組織透明化技術、および共焦点顕微鏡を使用しました。ホールマウント組織上のLRCをEdU標識する方法と、透明で透明な標本を使用することで、従来の切片スライドの制限やその他の不利なDNA標識方法の両方を克服します。したがって、私たちの技術は、LRCの検出を必要とする幹細胞恒常性、特に硬組織の研究に適しています。このプロトコルは、他の組織や臓器における幹細胞の恒常性に焦点を当てている人にとっても同様に有利であり得る。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>シグマ Aldrcih</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>20 &times;Objective/NA 0.9</td><td>Leica</td><td>507702</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 遠心分離管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>REF 305111</td><td></td></tr><tr><td>安息香酸ベジル (BB)</td><td>Sigma Aldrcih</td><td>409529</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane 9.0.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND キャビティ スライド</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR475505</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>Strain #:000664</td><td></td></tr><tr><td>循環ポンプ</td><td>VWR</td><td>23609-170</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrcih 451657</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrcih</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Carboynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Miiilipore Σ</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>イメージングシステム</td><td>オリンパス</td><td>DP27</td><td></td></tr><tr><td>LAS X ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリンパス 実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>PEGMMA500</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>TBS-10X</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8 共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tert-butanol (tB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

組織透明化後の3d再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

マウス切歯は、マウスの寿命を通して継続的に成長する器官です。切歯の近位組織に存在する上皮幹細胞および間葉系幹細胞は、アメロブラスト、歯芽細胞、および歯髄線維芽細胞に分化する子孫を生じさせる。これらの細胞は、切歯組織の持続的なターンオーバーをサポートする上で非常に重要であり、マウス切歯を成体幹細胞の恒常性を研究するための優れたモデルにします。幹細胞は、5−エチニル−2'−デオキシウリジン(EdU)などのヌクレオチド類似体によって標識することができる長寿命の静止細胞を含むと考えられている。細胞は長期にわたってこのラベルを保持し、それに応じてラベル保持細胞(LRC)と呼ばれます。 LRCをin vivoで 可視化するアプローチは、幹細胞の恒常性をモニタリングするための堅牢なツールを提供します。本研究では、LRCを可視化・解析する手法について述べる。私たちの革新的なアプローチは、組織透明化後のマウス切歯のLRCとホールマウントEdU染色、それに続く共焦点顕微鏡検査、およびイメージングソフトウェアによる3次元(3D)再構成を特徴としています。この方法では、セクション化されたスライドでの従来のLRC分析と比較して、3Dイメージングの取得とバイアスのない定量が可能になります。

EdU標識とPEGASOS組織透明化プロセス(図2)の後、画像(図3B)に示すように透明な下顎骨が得られました。修正されたサンプルを、組織クリアリングプロセスのない通常の下顎骨と比較しました(図3A)。EdU標識を施した透明下顎骨(図3B)を共焦点イメージングに供した。我々は、(補足図1)に示すように幹細胞ニッチを示す切歯頂点に着目した。切歯の光学切片は、XY平面における切歯頂部の幹細胞ニッチにLRCを示した(図4A)。上皮(緑)と間葉系(赤)の両方の幹細胞ニッチにEdU+ ラベルを保持する静止幹細胞を示す切歯頂点の3D画像を再構築しました(図4B)。EdU+ 細胞は、間葉系LRCとほぼ重なる定量のためにス...

マウス切歯には、幹細胞ニッチに貴重なラベル保持細胞が含まれています。私たちは、ラベル保持細胞を偏りなく検出して定量化する新しい方法を持っています。私たちの研究では、下顎骨のPEGASOS組織除去後のEdU標識と3D再構成アプローチを使用しました。

組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

このプロトコルは、マウス切歯幹細胞ニッチのラベル保持細胞のin vivoおよび3次元可視化および定量化のための方法を記載する。この手法は、時間を節約し、新しい学習者にとってユーザーフレンドリーです。3D画像は、組織に損傷を与えることなく取得されます。3D定量により、データの信頼性と精度が向上します。はじめに、下顎骨を解剖します。サンプルを4%パラホルムアルデヒドに固定し、室温で一晩保管します。孵卵後、下顎骨から筋肉を取り除きます。それらを0.5モルのエチレンジアミン四酢酸溶液に浸し、摂氏37度の振とう機で毎日培地を交換しながら4日間脱灰します。下顎骨を摂氏37度のシェーカーで15ミリリットルの25%Quadrol溶液で1日間脱色し、残りの血液ヘムを除去します。マウント全体の5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン染色の場合は、本文に記載されているように、新しい5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジンラベルカクテルを準備します。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でTween 20またはPBSTで摂氏37度のシェーカーで30分間すすぎます。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でそれぞれ3分間繰り返し、続いて、新たに調製した5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識カクテルでシェーカーで一晩インキュベートします。リン酸緩衝生理食塩水洗浄を3回繰り返し、下顎骨を本文に記載されている溶液に摂氏37度のシェーカーでそれぞれ6時間入れて連続脱脂質化を行います。下顎骨をtert-ブタノール-ポリエチレングリコール(tB-PEG)溶液で摂氏37度で2日間脱水し、毎日培地を交換します。2日後、安息香酸ベンジル75%、ポリエチレングリコール-メチルエーテルメタクリレート平均500またはPEG-MMA500、および3%クアドロールを含む安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体で下顎骨をクリアして、屈折率マッチングを取得し、透明性が得られるまで。組織で透明化された下顎骨全体を、安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体のブランドキャビティスライドに取り付け、ガラスカバースライドで覆います。共焦点イメージングソフトウェアで、目的の画像取得パラメータを設定します。蛍光励起パネルで、蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザーを活性化します。蛍光検出パネルで、スライダーを動かして測定する波長を選択します。ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に合わせて、カバーガラスの上に屈折率1.52の液浸オイルを一滴加え、取り付けた下顎骨を顕微鏡ステージに置きます。蛍光灯をオンにし、関心領域を画像化するための適切な倍率対物レンズを選択します。ライブスキャンモードでは、視野を特定して、下顎骨の領域全体をX次元とY次元で視覚化します。マウス切歯における幹細胞ニッチの体積を正確にカバーする上下のZステージ取得パラメータを設定する。2マイクロメートルのZステップサイズを使用するか、要件に応じて使用します。Zスタック画像ファイルをlif形式で取得して保存します。イメージングソフトウェアファイルコンバータを使用して、Zスタックイメージファイルをネイティブ形式のファイルタイプに変換します。イメージングソフトウェアで、「アリーナ」ボタンをクリックしてから、「イメージ」を選択します。元の lif ファイルを選択し、マージされたファイルを選択します。画像はイメージングソフトウェアにインポートされます。インポートしたファイルをダブルクリックして、画像データセットを開きます。イメージングソフトウェアで、ディスプレイ調整パネルにアクセスします。ディスプレイ調整パネルで、チャンネルの名前をクリックします。通常、デフォルトモードでは赤とラベル付けされます。[画像のプロパティ]ウィンドウで、[マップされた色]タブをクリックします。[カラー タブ ファイル] オプションで [Fire Flow] を選択し、[OK] をクリックします。サンプルから背景蛍光と陽性蛍光を区別するために、表示色を選択します。画面の左上の [シーン プロパティ] ウィンドウで、[Add New Surface] というラベルの付いた青いアイコンをクリックします。ボリュームアイコンの選択を解除すると、バックグラウンド蛍光の大部分が除去され、手動セグメンテーション中に正の蛍光がはっきりと表示されます。次に、[作成]タブをクリックし、[自動作成をスキップして手動で編集]タブを選択して、関心領域またはROIの手動セグメンテーションを開始します。手動サーフェス作成ウィザードで、[コンター]タブをクリックしてサンプルに基づいて方向を選択し、ROIを簡単にコンター化します。次に、右隅のポインタメニューが選択モードになっていることを確認します。スライス位置を調整して、組織内のROIを見つけます。前述のように、ほとんどのバックグラウンド蛍光はすでに除去されています。[描画] ボタンをクリックし、一時的な関心領域を描画します。ROI 以外の領域からの干渉を避けるために [可視性] オプションを [なし] に選択し、関心領域をスライスごとにセグメント化します。ROIの描画が完了したら、[サーフェスの作成]をクリックしてROIの3Dジオメトリを取得します。手動サーフェス作成ウィザードの「編集」(Edit) ボタンをクリックし、「すべてマスク」(Mask All) を選択します。ポップアウトされたマスクチャンネルウィンドウで、チャンネル選択オプションのチャンネル1を選択します。その後、マスクを適用する前に[チャンネルを複製]を選択します。マスク設定で、[内側/外側に一定]を選択し、ボクセルの外側サーフェスをゼロに設定します。[シーン プロパティ]ペインで、[サーフェス]オブジェクトの選択を解除し、[ボリューム]オブジェクトを選択します。ディスプレイ調整で、元の赤チャンネルの選択を解除し、マスクされた赤チャンネルを選択します。また、色の強度を調整して、目的の3Dレンダリングおよび陽性標識された蛍光ROIを取得します。スポットアイコンをクリックして新しいスポットオブジェクトを作成し、3Dレンダリングされたラベル保持セルと比較的重なる3Dスポットを作成して、3Dレンダリングされたラベル保持セルを定量化します。下の矢印を使用して、スポット作成ウィザードのステップ間を移動します。[完了] ボタンをクリックし、[統計] ボタンを選択します。次に、[全体] タブを選択して、画像内のスポットの総数の値を見つけます。5−エチニル−2−プライム−デオキシウリジン標識およびポリエチレングリコール関連溶媒系組織透明化処理の後、透明な下顎骨が得られた。修飾サンプルを組織透明化プロセスのない通常の下顎骨と比較し、5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識を施した透明な下顎骨を共焦点イメージングに供した。切歯の光学切片は、XY平面における切歯頂部の幹細胞ニッチに標識保持細胞を示した。切歯頂点の3D画像構築は、上皮および間葉系幹細胞ニッチの両方で5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性ラベル保持静止幹細胞を示した。5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性細胞を、間葉系標識保持細胞と同等に重複する定量用スポットに移した。間葉系ラベル保持細胞のみおよび上皮ラベル保持細胞に対してのみ作成されたスポットが画像に表示されます。上皮および間葉系ラベル保持細胞の定量も行った。処理と透明化の特性は最も重要なステップであり、満足のいく結果を得るには、組織の用途に応じて最適化する必要があります。この方法は、S2VGFPレベルのLRCを視覚化したり、細胞系譜追跡で子孫の位置とその定量または寄与の詳細を取得したりするように変更することもできます。

detection-quantitation-label-retaining-cells-mouse-incisors-using-3d

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

出典:Pekarek, B. T., et.al., CLARITY Tissue Clearingによる無傷のニューロン樹状突起のイメージングと定量化。J. Vis. Exp.

透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

継続的に成長しているマウスの門歯は、歯科上皮幹細胞（DESCs）から歯の組織の更新を研究するためのモデルを提供します。一貫して確実切歯からこれらの細胞を取得し、in vitroでそれらを拡張するための堅牢なシステムをここで報告されている。...

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。...

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

この方法は、R26R-Confetti(Confetti)マウスモデルを使用してミネラル化された組織を研究し、繁殖戦略から画像取得に至るすべてのステップをカバーすることを説明します。含まれているすべての軟部組織に適用することができる一般的なプロトコルおよびミネラル化されたティッシュに適用することができる改変されたプロトコル。...

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

マウスにおける歯の動きを発生させるプロトコルと、歯周靭帯のコラーゲン線維や血管の3D可視化法を、切り離さずに提示する。...

下顎マウスモデルにおける歯歯運動中のPDLコラーゲン線維の3Dイメージング

神経樹状形態は、しばしば機能の根底にある。実際、ニューロンの発達に影響を与える多くの疾患プロセスは、形態表現型で現れる。このプロトコルは、無傷の樹状樹状の樹状樹状の樹状樹状の、および関連する脊椎を分析するための簡単で強力な方法を記述します。...

CLARITY組織クリアリングによるインタクトニューロンデンドライトのイメージングと定量化

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。...

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。...

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

学ぶPEGASOS組織透明化と3D再構成を用いたマウス切歯の標識保持細胞の可視化と定量法。EdUラベリングにより幹細胞ニッチの細胞動態を正確に解析し、再生医療研究への応用が期待される。

組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)

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