組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)

このプロトコルは、マウス切歯幹細胞ニッチのラベル保持細胞のin vivoおよび3次元可視化および定量化のための方法を記載する。この手法は、時間を節約し、新しい学習者にとってユーザーフレンドリーです。3D画像は、組織に損傷を与えることなく取得されます。

3D定量により、データの信頼性と精度が向上します。はじめに、下顎骨を解剖します。サンプルを4%パラホルムアルデヒドに固定し、室温で一晩保管します。

孵卵後、下顎骨から筋肉を取り除きます。それらを0.5モルのエチレンジアミン四酢酸溶液に浸し、摂氏37度の振とう機で毎日培地を交換しながら4日間脱灰します。下顎骨を摂氏37度のシェーカーで15ミリリットルの25%Quadrol溶液で1日間脱色し、残りの血液ヘムを除去します。

マウント全体の5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン染色の場合は、本文に記載されているように、新しい5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジンラベルカクテルを準備します。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でTween 20またはPBSTで摂氏37度のシェーカーで30分間すすぎます。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でそれぞれ3分間繰り返し、続いて、新たに調製した5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識カクテルでシェーカーで一晩インキュベートします。

リン酸緩衝生理食塩水洗浄を3回繰り返し、下顎骨を本文に記載されている溶液に摂氏37度のシェーカーでそれぞれ6時間入れて連続脱脂質化を行います。下顎骨をtert-ブタノール-ポリエチレングリコール(tB-PEG)溶液で摂氏37度で2日間脱水し、毎日培地を交換します。2日後、安息香酸ベンジル75%、ポリエチレングリコール-メチルエーテルメタクリレート平均500またはPEG-MMA500、および3%クアドロールを含む安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体で下顎骨をクリアして、屈折率マッチングを取得し、透明性が得られるまで。

組織で透明化された下顎骨全体を、安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体のブランドキャビティスライドに取り付け、ガラスカバースライドで覆います。共焦点イメージングソフトウェアで、目的の画像取得パラメータを設定します。蛍光励起パネルで、蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザーを活性化します。

蛍光検出パネルで、スライダーを動かして測定する波長を選択します。ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に合わせて、カバーガラスの上に屈折率1.52の液浸オイルを一滴加え、取り付けた下顎骨を顕微鏡ステージに置きます。蛍光灯をオンにし、関心領域を画像化するための適切な倍率対物レンズを選択します。

ライブスキャンモードでは、視野を特定して、下顎骨の領域全体をX次元とY次元で視覚化します。マウス切歯における幹細胞ニッチの体積を正確にカバーする上下のZステージ取得パラメータを設定する。2マイクロメートルのZステップサイズを使用するか、要件に応じて使用します。

Zスタック画像ファイルをlif形式で取得して保存します。イメージングソフトウェアファイルコンバータを使用して、Zスタックイメージファイルをネイティブ形式のファイルタイプに変換します。イメージングソフトウェアで、「アリーナ」ボタンをクリックしてから、「イメージ」を選択します。

元の lif ファイルを選択し、マージされたファイルを選択します。画像はイメージングソフトウェアにインポートされます。インポートしたファイルをダブルクリックして、画像データセットを開きます。

イメージングソフトウェアで、ディスプレイ調整パネルにアクセスします。ディスプレイ調整パネルで、チャンネルの名前をクリックします。通常、デフォルトモードでは赤とラベル付けされます。

[画像のプロパティ]ウィンドウで、[マップされた色]タブをクリックします。[カラー タブ ファイル] オプションで [Fire Flow] を選択し、[OK] をクリックします。サンプルから背景蛍光と陽性蛍光を区別するために、表示色を選択します。画面の左上の [シーン プロパティ] ウィンドウで、[Add New Surface] というラベルの付いた青いアイコンをクリックします。

ボリュームアイコンの選択を解除すると、バックグラウンド蛍光の大部分が除去され、手動セグメンテーション中に正の蛍光がはっきりと表示されます。次に、[作成]タブをクリックし、[自動作成をスキップして手動で編集]タブを選択して、関心領域またはROIの手動セグメンテーションを開始します。手動サーフェス作成ウィザードで、[コンター]タブをクリックしてサンプルに基づいて方向を選択し、ROIを簡単にコンター化します。

次に、右隅のポインタメニューが選択モードになっていることを確認します。スライス位置を調整して、組織内のROIを見つけます。前述のように、ほとんどのバックグラウンド蛍光はすでに除去されています。

[描画] ボタンをクリックし、一時的な関心領域を描画します。ROI 以外の領域からの干渉を避けるために [可視性] オプションを [なし] に選択し、関心領域をスライスごとにセグメント化します。ROIの描画が完了したら、[サーフェスの作成]をクリックしてROIの3Dジオメトリを取得します。

手動サーフェス作成ウィザードの「編集」(Edit) ボタンをクリックし、「すべてマスク」(Mask All) を選択します。ポップアウトされたマスクチャンネルウィンドウで、チャンネル選択オプションのチャンネル1を選択します。その後、マスクを適用する前に[チャンネルを複製]を選択します。

マスク設定で、[内側/外側に一定]を選択し、ボクセルの外側サーフェスをゼロに設定します。[シーン プロパティ]ペインで、[サーフェス]オブジェクトの選択を解除し、[ボリューム]オブジェクトを選択します。ディスプレイ調整で、元の赤チャンネルの選択を解除し、マスクされた赤チャンネルを選択します。

また、色の強度を調整して、目的の3Dレンダリングおよび陽性標識された蛍光ROIを取得します。スポットアイコンをクリックして新しいスポットオブジェクトを作成し、3Dレンダリングされたラベル保持セルと比較的重なる3Dスポットを作成して、3Dレンダリングされたラベル保持セルを定量化します。下の矢印を使用して、スポット作成ウィザードのステップ間を移動します。

[完了] ボタンをクリックし、[統計] ボタンを選択します。次に、[全体] タブを選択して、画像内のスポットの総数の値を見つけます。5−エチニル−2−プライム−デオキシウリジン標識およびポリエチレングリコール関連溶媒系組織透明化処理の後、透明な下顎骨が得られた。

修飾サンプルを組織透明化プロセスのない通常の下顎骨と比較し、5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識を施した透明な下顎骨を共焦点イメージングに供した。切歯の光学切片は、XY平面における切歯頂部の幹細胞ニッチに標識保持細胞を示した。切歯頂点の3D画像構築は、上皮および間葉系幹細胞ニッチの両方で5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性ラベル保持静止幹細胞を示した。

5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性細胞を、間葉系標識保持細胞と同等に重複する定量用スポットに移した。間葉系ラベル保持細胞のみおよび上皮ラベル保持細胞に対してのみ作成されたスポットが画像に表示されます。上皮および間葉系ラベル保持細胞の定量も行った。

処理と透明化の特性は最も重要なステップであり、満足のいく結果を得るには、組織の用途に応じて最適化する必要があります。この方法は、S2VGFPレベルのLRCを視覚化したり、細胞系譜追跡で子孫の位置とその定量または寄与の詳細を取得したりするように変更することもできます。