Name: エクスビボ げっ歯類の三叉神経血管系からのカルシトニン遺伝子関連ペプチドの放出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶ エクスビボ法によるげっ歯類三叉神経血管系からのCGRP放出測定。カプサイシンや薬理学的因子の効果を定量化し、片頭痛の神経生物学的メカニズム解明に貢献する実験手法です。

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この作品はキャンディーズ財団によって資金提供されました。

すべての動物の世話と実験手順は、動物の世話と使用に関する欧州共同体ガイド(2010/63 / UE)に準拠して実施されました。このプロトコルを実証するために、10週齢の雄C57BL/6JBomTacマウスおよび10週齢の雄のSprague Dawleyラットを使用した。
1.合成間質液の調製
<ol><li>次のレシピに従って合成間質液(SIF)を調製する:108 mM NaCl、3.48 mM KCl、3.50 mM MgSO 4、26 mM NaHCO3、11.70 mM NaH 2 PO4、1.50 mM CaCl2、9.60 mM Na-グルコン酸塩、5.50 mMグルコースおよび7.60 mMスクロース(材料表を参照)。 注:SIFは刺激ターゲットに応じて変えることができ、例えば、カルシウムチャネルを研究するときにカルシウムフリー溶液を使用することができます。</li>
	<li>pHを7.4に調整し、カルボゲンガス(5%CO2および95%O2)46によってpHを安定させます。</li>
</ol>2.安楽死
<ol><li>成体マウスおよびラットを70%CO2 および30%O2の混合物で麻酔する。はさみを使用してマウスを斬首し、ギロチンを使用してラットを斬首します( 材料の表を参照)。 注:研究の目的に合った系統と年齢を使用してください。このモデルでは、男性と女性の両方を使用できます。</li>
	<li>脊髄のC3-C4レベルで頭を体から分離します。 注:安楽死は、ペントバルビタール(100-150 mg / kg)の腹腔内注射でも実行できます。.</li>
</ol>3.解剖
<ol><li>以下の手順に従ってラット組織を準備します。<ol><li>はさみを使用して頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除きます(図1A)。</li>
		<li>骨トリマーとはさみを使用して、下顎を頭から分離します(図1B-C)。</li>
		<li>椎骨の背部に尾側に挿入して脊髄を開き、椎骨の背側部分を取り外して脊髄と脳幹を露出させます(図1D)。</li>
		<li>後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨の尾側部分を切断し、小脳を露出しているこれらの骨構造を取り除きます(図1E)。 注:脊椎を切断および除去する際に、脳幹と脊髄を傷つけないことが重要です。</li>
		<li>脳幹の背外側部分をスプリングハサミで切断することにより、両側のブレグマから約13〜16 mm尾方向に走るTNC(Sp5C)を隔離します。左側と右側のTNCをSIFに浸します(図1E-I)。 注:説明は成体ラットに対応しています。</li>
		<li>のこぎりを使用して頭蓋骨を矢状に中央に切り、頭蓋骨を2つに分割します(図1J-L)。</li>
		<li>ヘラを使って頭蓋に付着した硬膜に触れず、脳幹に入る三叉神経を切断することなく、慎重に脳を取り除きます(図1M-P)。</li>
		<li>TGを分離するには、視覚的な境界線の周りの枝を含めてTGを切り取ります。卵円孔に入る下顎枝を切ります。頭蓋骨に入る眼科枝と上顎枝は巨視的に分割されていないため、切断します。TGを解剖しながら、TGを覆っている硬膜を取り外します(図1Q-T)。</li>
		<li>頭蓋骨の半分とTGをSIFに浸します。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順に従ってマウス組織を準備します。<ol><li>小さなハサミを使用して頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除きます(図2A-B)。</li>
		<li>椎骨の背部に小さなハサミを尾側に挿入して脊髄を開き、椎骨の背側部分を削除して脊髄と脳幹を露出させます(図2C)。 注意: 脊椎を切断して除去する際に脊髄を傷つけないことが重要です。</li>
		<li>後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨を切り取り、小脳を露出しているこれらの骨構造を取り除きます(図2D-F)。</li>
		<li>次に、頭頂骨を矢状中央に切断し、骨を除去して大脳を露出させます(図2G-I)。</li>
		<li>へらで小脳を慎重に取り除き、脳幹を露出させます(図2J)。</li>
		<li>スプリングハサミを使用して脳幹のTNC含有部分を分離します(図2K-N)。脳幹をTNCでSIFに浸します(図2O)。</li>
		<li>脳を取り出し、脳幹に入る三叉神経を切断します(図2P-Q)。</li>
		<li>TGを分離するには、視覚的な境界線の周りの枝を含めてTGを切り取ります。卵円孔に入る下顎枝を切ります。頭蓋骨に入る眼科枝と上顎枝は巨視的に分割されていないため、切断します。TGを解剖しながら、TGを覆っている硬膜を取り外します(図2R-S)。</li>
		<li>TGをSIFに浸します(図2T)。</li>
	</ol></li>
</ol>4.洗濯
<ol><li>頭蓋骨の半分、TNC、およびTGをSIFで30分間洗浄し、室温で5分ごとにSIFを交換します。 注意: 洗浄手順は、SIF交換を容易にするために、チュール蓋付きのプラスチック容器にティッシュを入れたまま実行できます(図3A-B)。</li>
	<li>以下の手順に従ってラット組織を準備します。<ol><li>TNCの半分を350 μLのSIFで分離した微小遠心チューブキャップに移します(図3C)。</li>
		<li>TGをマイクロ遠心チューブキャップに移します-350 μLのSIFを含むマイクロ遠心チューブキャップあたり1つのTG(図3C)。</li>
		<li>頭蓋骨の半分を粘土または6ウェル培養プレート製のプラットフォームに置き、頭蓋骨に400 μLのSIFを満たします(図3C)。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順に従ってマウス組織を準備します。<ol><li>TNCを含む脳幹を、250 μLのSIFを含む微量遠心チューブキャップに移します(図3D)。</li>
		<li>2つのTGを250 μLのSIFを含むマイクロ遠心チューブキャップに移します(図3D)。 注:マウスの組織を使用する場合は、微量遠心チューブキャップごとに2つのTGを配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>ラットの頭蓋骨と微小遠心チューブキャップをラットとマウスの組織とともに、37°Cの加湿インキュベーターに入れます。 5分ごとにピペットを使用してSIFを20分間交換します。 注意: SIFを追加および除去するときは、組織に触れないことが重要です。</li>
</ol>5.薬物検査
<ol><li>基礎CGRP放出レベルを決定します。<ol><li>最後の洗浄後、250 μLのSIFをマウスTGおよびTNCに加えます。ラットTGおよびTNCに350 μL、各ラット頭蓋骨に400 μLを加えます。</li>
		<li>10分間のインキュベーション後、200 μLのサンプルをマイクロ遠心チューブに集め、50 μLの10x EIAバッファー(CGRP酵素免疫測定キットに付属、 材料の表を参照)を加えて、基礎CGRP放出の測定を可能にします(ステップ6)。残りの液体を捨てます。 注:インキュベーション時間はすべてのサンプルで同じでなければなりません。</li>
		<li>直ちに、サンプルを-20°Cで保存してください。</li>
		<li>基礎CGRP放出レベルのサンプリング後、3つの方法のいずれかに従います:(A)単一刺激(ステップ5.2);(b)濃度反応刺激(ステップ5.3);(C)刺激の阻害(ステップ5.4)(図4)。 注:使用される試験化合物と濃度は、研究の目的によって異なります。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順に従って単回刺激を実行します。<ol><li>試験化合物またはビヒクルを組織に加え、10分間放置します(容量:マウスTGおよびTNCの場合は250 μL、ラットTGおよびTNCの場合は350 μL、各ラット頭蓋骨の場合は400 μL)。</li>
		<li>10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを収集します。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを-20°Cで保管してください。 注:インキュベーション時間はすべてのサンプルで同じでなければなりません。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順に従って濃度反応刺激を実行します。<ol><li>試験化合物またはビヒクルを所望の濃度に希釈する。最低濃度から始めて、濃度を上げて試験化合物を追加します。 注:使用される試験化合物と濃度は、研究の目的によって異なります。例えば、本研究では、1μM、10μM、および100μMのスーパーシンナムアルデヒドを使用しました。</li>
		<li>試験化合物と対応するビヒクルの最低濃度(本研究では1 μM)を2つの同一の組織調製物に加え、10分間インキュベートします(容量:マウス組織で250 μL、ラットTGおよびTNCで350 μL、各ラット頭蓋骨で400 μL)。</li>
		<li>10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを収集します。</li>
		<li>残りの液体を廃棄し、2番目に低い濃度(本研究では10μM)を組織に追加します。</li>
		<li>直ちに、サンプルを-20°Cで保存してください。</li>
		<li>残りの濃度(本研究では100μM)でこの手順を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順で刺激の抑制を行います。<ol><li>ブロッカーまたはビヒクルを組織に加え、10分間インキュベートします(容量:マウス組織用に250 μL、ラットTGおよびTNC用に350 μL、および各ラット頭蓋骨に対して400 μL)。 注:使用されるブロッカーと濃度は、研究の目的によって異なります。例えば、図 5の代表的な結果には3 μMのグリベンクラミドを使用しました。</li>
		<li>10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを採取します。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを-20°Cで保管してください。</li>
		<li>アゴニストまたはアゴニスト+ブロッカー( 材料表を参照)を組織に加え、10分間インキュベートします。 注:使用されるアゴニスト、ブロッカー、および濃度は、研究の目的によって異なります。本研究では、3 μMのグリベンクラミドと1 μMのカプサイシンを使用しました( 図5)。</li>
		<li>10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを採取します。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを-20°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>実験のポジティブコントロールを実行します。<ol><li>必要に応じて、ポジティブコントロール(例:.、1〜10 μMのカプサイシン、 材料表を参照)をプロトコルの最後に組織に追加し、10分間のインキュベーション期間の後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを収集します。 注:セットアップと組織が機能していることを確認するために、ポジティブコントロールを含めることが有利です。カプサイシン48,49,50またはカリウムの脱分極刺激(40-60mMのKCl)46,47,49は、三叉血管系からのCGRPの放出を引き起こすために日常的に使用される。40〜60mMのKCl SIFはSIFとして調製されるが、NaClは等モルベースでKClと交換される。</li>
	</ol></li>
</ol>6. CGRP濃度の分析
<ol><li>メーカーのプロトコルに従って、酵素免疫測定法(EIA)キットを使用して放出されるCGRPの量を測定します(材料の表を参照)。</li>
	<li>プレート光度計を使用して410nmでの光学密度を測定します。別のCGRP EIAキットを使用する場合は、製造元のプロトコルで提供されている波長で光学密度を測定します。 注:サンプルは、検量線に一致するように希釈する必要があります。</li>
	<li>データ分析を実行します。<ol><li>データを絶対濃度として提示するか、特定の組織からの基礎CGRP放出に正規化します。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

記載された方法は、片頭痛の病態生理学におけるCGRPの重要性を示す研究に続いて開発された。頭部領域の痛みのシグナル伝達に重要な三叉神経血管系からのCGRPの放出に関与するメカニズムを調査するのに適しています。このモデルで得られたCGRPの量は、硬膜を神経支配する三叉神経、TG、およびTNCからのCGRP放出を直接測定します。CGRP放出の量は、ヒトにおける熱凝固後の血漿中で測定された放出よりも定量的に大きい45,54、ネコ39、55、56、および片頭痛発作中の三叉神経刺激23。1つの説明は、CGRPが血中で希釈および分解されることである可能性があります54。ただし、化学物質による直接刺激は病態生理学的活性化よりも優れている可能性があることに注意してください。さらなる利点は、三叉神経血管系内の3つの異なる部位からの放出を見つけることが可能であり、薬理学的操作と一緒に、および遺伝子組み換えげっ歯類からの組織内で使用することができることである。
最近、多くの前臨床げっ歯類モデルは、フォンフレイテスト57,58、顔をしかめる59,60,61、または軽い嫌悪感62,63,64を使用して、物質の全身投与とその後の痛みまたは片頭痛関連の読み出しに焦点を当てています。これらの方法は、さまざまな物質の痛みを誘発する特性と痛みを和らげる特性を理解するのに役立ちます。しかしながら、これらのアプローチは、関与する特定の標的組織に関する情報を提供しない。本方法では、三叉神経血管系は硬膜、TG、TNCの3つの構造に分かれています。これにより、各構造の局所暴露と特定の物質の作用位置の評価が可能になります。これは、ラットにおける電位依存性カルシウムチャネルの役割が調査された2011年の研究では利用され、これらのチャネルの阻害は、三叉神経血管経路の3つの構造で異なることがわかりました47。神経系の構造を解剖するとき、軸索切開は避けられません。軸索切開は、様々な遺伝子の転写を変化させることが示されている65。これらの転写変化は、この方法の結果に影響を与えるには遅すぎるが、in vivoの状況と比較した場合、リン酸化の変化を排除することはできない46。CGRPなどの神経ペプチドは細胞体内で形成されるが、神経ペプチドの放出および作用は通常、中枢神経終末または末梢神経終末にある。したがって、末端を含む無傷のニューロンの研究は、神経ペプチド放出を研究する際に興味深いものである。したがって、単離された神経節からのニューロンの培養を研究する方法は、末端のモデルとして役立つように確立されている。しかしながら、ニューロン細胞培養物は、機械的解離が培養物46中のニューロンを破壊する可能性があるため、いくつかの問題にさらされる。細胞の培養に関連するより長い時間枠は、この方法を軸索切開および培養条件によるトランスクリプトーム変化に敏感にする65。さらに、成長因子の添加および表面コーティング上での培養は、伝達物質および受容体発現としてのニューロン特性を変化させた66、67、68、69。これらの問題は、神経細胞培養の代わりに新たに単離された無傷の神経節を研究するときに回避されます。
ex vivo CGRP放出法の課題の1つは、再現性のある結果を得るために必要な組織の正確な解剖です。TNCの特に正確な解剖は、目に見える境界のない脳幹内の構造であるため、困難です。さらに、硬膜は壊れやすく、無傷の構造を確保するために脳の除去を慎重に行う必要があります。これらの障害物は、組織サイズを変化させ、したがって、基礎および刺激誘発性CGRPレベルを変化させる可能性がある。ただし、この変動は、基礎CGRPリリースへの正規化によって説明できます。また、マウスからTNCを単離する場合、脳幹の下部全体が単離され、ラットで行われたようなより特異的なTNC含有部分ではないことにも留意すべきである。一般に、硬膜からのCGRP放出の測定およびTNCのより正確な解剖を可能にするので、ラット組織を使用することは利点であり得る。さらに、組織のサイズは、1匹のラットが2つの頭蓋半分、2つのTG、および2つのTNCをもたらし、組織の1つの部分が物質刺激に使用され、もう1つの組織がビヒクルに使用されるため、ビヒクル制御としてラットを使用することも可能にします。マウスを使用する場合、両方のTGを1つのサンプルにプールし、TNCを1つの脳幹として解剖するため、1回の実験に2匹の動物が必要です。したがって、物質刺激には2つのTGと1つの脳幹が使用され、別のマウスの2つのTGと1つの脳幹がビヒクル制御に使用されます。これにより、ラットと比較して2倍のマウスを使用して、同じ数の反復が得られます。使用するマウスの数を減らすために、脳幹スライスからのCGRP放出を測定する方法が示唆されている49。この方法は、マウスの使用を可能にするように改変されているという利点である。これは、多くの既に利用可能なトランスジェニックマウス系統の使用を可能にし、例えばシグナル伝達経路を研究するための有用なツールである。実験の最後にポジティブコントロールを含めて、実験に使用された組織がCGRPを放出できるようにする必要があります。陽性対照は、TRPV1アゴニストカプサイシンまたは脱分極刺激カリウム(KCl)である可能性があり、これらはマウスおよびラットの両方で三叉血管系からCGRPを放出することが見出されている46,47,48,49,50。さらに、この方法は、片頭痛研究70において非常に興味深い別のペプチドである下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド(PACAP)として他の関連ペプチドの放出を測定するようにも適合されている。
この方法は、ラットおよびマウスにおける特定の標的組織からのCGRP放出を調べるための有用なツールを提供する。これは、ニューロンの培養に関連する問題を回避する比較的高速な方法です。本方法プロトコルは、濃度−応答関係または様々な薬理学的化合物による応答の阻害を研究するために容易に改変することができる。 ex vivo CGRP放出法は、片頭痛の病態生理学におけるCGRPおよびCGRP放出に関連する他のメカニズムの役割を研究するために有用ないくつかの前臨床方法の1つである。

片頭痛は、WHOによると、10億人以上が罹患していると推定される神経障害であり、世界中の障害の主な原因の1つです1。したがって、片頭痛は患者と社会の両方に大きな影響を与えます。CGRP拮抗薬の最近の臨床的成功にもかかわらず、患者の大部分は改善された治療選択肢を必要としています2,3,4,5。新たな治療法につながる片頭痛の病態解明が求められています。髄膜、三叉神経節(TG)、および三叉神経核尾筋(TNC)からなる三叉神経血管系内のシグナル伝達は、片頭痛の病態生理学の中心です6,7。
37アミノ酸の神経ペプチドカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、1980年代初頭にアマラらがカルシトニン遺伝子の一次RNA転写産物を処理して、カルシトニン8,9に加えてCGRPをコードするmRNAを与えることができることを実証したときに最初に発見されました。その後の研究は、片頭痛の病態生理学との関連を示唆しました10。CGRPは強力な血管拡張特性を持つ神経伝達物質です11,12,13,14,15,16,1 7、そしてそれは中枢および末梢神経系に広く分布しています13,14,18,19,20,21,22 .片頭痛におけるCGRPの関与は、ヒトにおける片頭痛発作中の脳外循環におけるCGRPレベルの増加の発見23、およびCGRPの注入が患者24に片頭痛様疼痛を引き起こすことを強調した。2年後、片頭痛の治療におけるCGRP拮抗薬オルセゲパントの有効性に関する最初の概念実証研究が発表されました25。
CGRPは、TG21、26、硬膜27、28、29、およびTNC30を神経支配する感覚神経線維で実証されているように、三叉神経血管系に豊富にあります。三叉神経血管系では、CGRPはTGの小中型のニューロン、無髄C線維に見られ、TGのニューロン集団のほぼ50%で発現しています。CGRP受容体は主により大きなニューロンで発現し、有髄Aδ線維に見られます31,32。CGRPは、化学的または電気的刺激によってニューロンから放出される33、34。CGRPの放出につながる経路とこの活性化の場所の研究は、片頭痛の病態生理学を理解するために重要です。過去5年間を通じて、前臨床試験は片頭痛関連のシグナル伝達に関する広範な知識の獲得に貢献し、新しい治療法の開発に貢献してきました35。血管および神経原性の関与を考慮した多くの方法が修正され、片頭痛の研究に適用されています。生物学的化合物または薬理学的処置に対する動脈応答のインビボおよびインビトロモデル17、36、37、および電気神経刺激38、39が挙げられる。さらに、TNCにおける活性化ニューロンは、c−Fos発現40、41、42およびこの領域における電気生理学的記録43、44によって検出することができる。どちらの方法も、頭から脳に伝達される侵害受容信号、例えば硬膜を測定します。1つの前臨床モデルのみを使用しても、片頭痛の病態生理学の全体像は示されません。したがって、片頭痛の病態生理学のできるだけ多くの側面をカバーする異なるモデルを組み合わせることが重要です。新しいモデルの継続的な開発は、片頭痛のメカニズムのさまざまな側面をカバーし、やがて片頭痛の病態生理学の謎が明らかになるでしょう。
ここでは、CGRP放出法の詳細なプロトコールが提示され、化学刺激後にマウスから単離されたTGおよびTNCにおいて エクスビボ で行われる。CGRP放出は、ラットの硬膜でも研究することができる。したがって、ラットの実験プロトコルでは、硬膜はTGおよびTNCとともに記載されている。CGRP放出法の基礎は1999年に最初に記述され、Ebersbergerらは先駆的な研究を行い、ラットの硬膜求心性の化学的および電気的刺激後にCGRPが硬膜から放出されることを発見しました45。その後、このアプローチはTG46 とTNC47からのCGRPリリースに拡張されました。続いて、この方法は、マウスのTGおよびTNCに適用されるように改変された。これまでのところ、硬膜からのCGRP放出はマウスでは困難でした。

<table><tbody><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>メルク</td><td>1.02382.1000</td><td>SIFバッファー</td></tr><tr><td>用 プラスチック容器用キャップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>カプサイシン</td><td>メルク</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRPキット</td><td>AH診断</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Strandm&oslash;llen</td><td>4.6</td><td>SIFのカルボゲンガス化用</td></tr><tr><td>繊細な骨トリマー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>グリベンクラミド</td><td>トクリス</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>メルク</td><td>G7021</td><td>SIF緩衝液</td></tr><tr><td>用 ネズミ用ギロチン</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>メルク</td><td>M5921</td><td>SIF緩衝液用</td></tr><tr><td>マイクロセンターチューブ+蓋/キャップ</td><td>VWR700-5239</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミニ弓のこ</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash;llen</td><td>4.5</td><td>SIFのカルボゲンガス処理用</td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>グロストラップ薬局</td><td>NA</td><td>Magistral</td></tr>式 <tr><td>プラスチック容器</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>プレート光度計 - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200は製造中止です。無限の200 PROはTecan. ソフトウェアで利用可能です: SWマゼランv.6.3</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>P9333</td><td>SIFバッファー</td></tr><tr><td>シザー</td><td>用 Allgaierインスツルメンツ</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>スモールシザー</td><td>オールガイヤーインスツルメンツ</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S6014</td><td>SIFバッファー用</td></tr> 塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S9888</td><td>SIF緩衝液</td></tr>用二<tr><td>水素ナトリウム一水和物</td><td>メルク</td><td>1.06346.1000</td><td>SIF緩衝液</td></tr><tr><td>用グルコン酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S2054</td><td>SIF緩衝液用</td></tr><tr><td>へら</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Spring はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>メルク</td><td>84097</td><td>SIFバッファー</td></tr><tr><td>スーパーシンナムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>チュール(生地)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>地元の生地店で購入</td></tr></tbody></table>

エクスビボ げっ歯類の三叉神経血管系からのカルシトニン遺伝子関連ペプチドの放出

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、カルシトニン遺伝子のスプライス変異体として1980年代に最初に発見されました。その発見以来、片頭痛病態生理学におけるその役割は、最初はその強力な血管拡張特性によって、続いて感覚三叉神経血管系における神経伝達物質としての存在および機能によって十分に確立されてきた。CGRPの片頭痛誘発能力は、CGRPの効果を阻害するモノクローナル抗体およびアンタゴニストを開発するために製薬業界を支援しました。新しい治療パラダイムは、片頭痛の予防的治療に効果的であることが証明されています。片頭痛のメカニズムをさらに理解するための有用なツールの1つは、三叉神経血管系からのCGRP放出の ex vivo モデルです。これは比較的簡単な方法であり、さまざまな薬理学的ツールを使用して、新しい効果的な片頭痛治療薬をさらに開発するためのノウハウを得ることができます。本プロトコルは、CGRP放出モデルおよびげっ歯類における三叉神経血管系から放出されるCGRPの量に対する薬理学的薬剤の効果を定量化する技術を記載する。安楽死からタンパク質レベルの測定までの実験的アプローチを説明する手順が提供される。マウスおよびラットの両方からの三叉神経節および三叉神経核尾筋の本質的な単離ならびにラット硬膜の調製が詳細に説明されている。さらに、両方の種(ラットおよびマウス)からの代表的な結果が提示される。この技術は、さまざまな薬理学的化合物や遺伝子改変動物を用いて、片頭痛の病態生理に関与する分子メカニズムを調べるための重要なツールです。

この技術は、片頭痛に関与するCGRP関連の分子メカニズムを調べるためのツールです。トリジェミノ血管系の異なるレベルからのCGRP放出を評価するという利点があり、さまざまな薬理学的化合物と組み合わせて、野生型およびトランスジェニックマウスおよびラットの両方に適用できます。ここでは、ラットからの濃度応答およびブロッキング実験、および野生型およびトランスジェニックマウスからの濃度応答結果が提示されます。
CGRP放出法を使用して、雌の自発的三叉神経異痛(STA)ラットのTGおよび硬膜からのCGRP放出に対するKATPチャネル阻害剤グリベンクラミドの効果を研究しました。まず、カプサイシンの最適濃度を濃度反応研究デザインを使用して見つけました。カプサイシン曝露は、ビヒクルと比較して硬膜およびTGからの有意なCGRP放出を誘発した(図5)。硬膜ではCGRPの最大放出は1 μMのカプサイシンで、TGでは10 μMのカプサイシンでCGRPの最大放出が見られました(図5A-B)。濃度反応実験に基づいて、1 μMのカプサイシンと3 μMのグリベンクラミドをブロッキング実験に使用しました。グリベンクラミドは、一元配置ANOVA 51で分析した場合、硬膜(P = 0.441)およびTG(P = 0.881)からの基礎CGRP放出に影響を示さなかった。グリベンクラミドは、一元配置分散分析法で分析した場合、ビヒクルを用いたカプサイシンと比較して、硬膜におけるカプサイシン誘発性CGRP放出を40%(P = 0.031)およびTGを39%(P = 0.003)有意に減少させた(図5C-D)51。
マウスでは、GTN誘発性過敏症がTRPA1チャネルに完全に依存していた片頭痛のGTNマウスモデルにおける一過性受容器電位アンキリン1(TRPA1)イオンチャネルの関与を調べるためにプロトコルが使用されました。TRPA1アゴニストスーパーシンナムアルデヒド(SCA)は、1μM、10μM、および100μMのSCAでTGから用量依存的にCGRPを放出し、その結果、双方向ANOVAで分析した場合、ビヒクルと比較してそれぞれ9%(P = 0.23)、51%(P = 0.011)、および69%(P = 0.0097)のCGRP放出が増加しました。この放出は、1μM、10μM、および100μMのSCAへの曝露が、双方向ANOVAで分析した場合、ビヒクルと比較してCGRPの放出にそれぞれ11%(P &gt; 0.99)、-13%(P &gt; 0.99)および9%(P = 0.97)の変化をもたらしたTrpa1ヌルマウスのTGには存在しなかった。その後の10 μMのカプサイシンによる刺激(ポジティブコントロール)は、すべての組織サンプルがCGRPを放出できることを示しています(図6)50。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> 図1:ラットからの組織の段階的な解剖。 (A〜T)の詳細は、プロトコルセクション(ステップ3.1)に記載されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> 図2:マウスからの組織の段階的な解剖。 (A〜T)詳細は、プロトコルセクション(ステップ3.2)で提供されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> 図3:げっ歯類組織の洗浄とインキュベーション。 (A-B)SIFを含むプラスチック容器中の新たに単離された組織。容器はチュールで覆われており、SIFを簡単に交換できます。(C)ラット組織-6ウェル培養プレート上に置かれた頭蓋骨の内層を覆う硬膜を有する2つの頭蓋骨の半分。左右の三叉神経核尾部を別々の微小遠心管蓋(上段の蓋)に。個々の微小遠心管蓋(蓋の一番下の列)における2つの三叉神経節。(D)マウス組織−脳幹の三叉核尾部含有部分を別の微小遠心管蓋(上段)。2つのマウス三叉神経節は、1つの微小遠心管蓋(下)にある。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> 図4:CGRPリリースのための研究デザイン。 CGRPリリース実験を実施するための3つの異なるプロトコル。薬物は合成間質液(SIF)で希釈する必要があります。(A)単回刺激。(B)濃度反応刺激。(C)刺激の阻害。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> 図5:グリベンクラミドは、ラット硬膜および三叉神経節からのカプサイシン誘発性CGRP放出を阻害します。トーマスジェファーソン大学52から最初に供給された雌の自発的三叉神経異痛(STA)ラット(215-318g)から単離された三叉神経節および硬膜からのCGRPレベルは、市販のヒトCGRP EIAキットで測定されました。(A-B)カプサイシンの濃度(10 nM、100 nM、1 μMおよび10 μM)を増加させた後の(A)硬膜および(B)三叉神経節からのCGRP放出(n = 4)。データは個々の点として提示され、二元配置ANOVAで分析されました。p &lt; 0.0001(C-D)ビヒクル、3μMグリベンクラミド(glib)、1μMカプサイシンおよび1μMカプサイシン+ 3μMグリブ(n = 6-11)への10分間の曝露後に(C)硬膜および(D)三叉神経節から放出されたCGRPのレベル。データは個々の点と平均値として表示され、一元配置分散分析で分析されました。*車両との比較。#カプサイシンとカプサイシン+グリブの比較。#P &lt; 0.05, ** および ##P &lt; 0.01, ****P &lt; 0.0001.分析は、ボンフェローニの多重比較検定で続いた。すべての検定で有意水準α = 0.05が使用されました。この図はクリステンセンらから修正されています。51<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> 図6:SCA曝露は、マウス三叉神経節からのTRPA1依存性CGRP放出をもたらす。WTおよびTrpa1ヌル(Trpa1tm1/Dpc)53雄マウス(8〜10週間)から単離された三叉神経節から放出されたCGRPレベルを、陽性対照として1μM、10μM、および10μMのカプサイシンに曝露した後、ラットCGRP EIAキットで測定した(n = 6)。各マウスからのデータは個々のポイントとして表示され、バーは平均値を示します。統計:各濃度におけるSCAとビヒクルの比較、および基礎対照と陽性対照の比較は、双方向反復ANOVAを用いて行った。有意水準α = 0.05。*P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01.この図はクリステンセンらから修正されています。50<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、 ex vivo カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)放出モデルおよびげっ歯類の三叉神経系から放出されるCGRPの量に対する薬理学的物質の効果を定量化する戦略を記載している。

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

この方法は、三叉神経血管系からのCGRPの放出に関与するメカニズムを調べるためのツールです。この方法の主な利点は、三叉神経血管系を3つの異なる部位に分割し、各部位内でのCGRPの放出を評価できることです。手順を実演するのは、私と私たちのグループの上級科学者であるInger Jansen-Olesenです。はじめに、ハサミを使って頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除き、ラット組織を準備します。次に、骨トリマーとはさみを使用して、下顎を頭から分離します。次に、椎骨の背部に尾状に骨トリマーを挿入して脊髄と脳幹を露出させ、それを取り除きます。次に、後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨の尾側部分を切り取り、これらの骨構造を取り除き、小脳を露出させます。両側のブレグマから約13〜16ミリメートルの尾方向に走っているTNCを隔離するには、脳幹の背外側部分をスプリングハサミで切ります。その後、左側と右側のTNCをSIFに浸します。次に、のこぎりを使って頭蓋骨を2つに分けるために頭を矢状中程度に切ります。次に、ヘラを使用して頭蓋に付着した硬膜に触れずに脳を慎重に取り外します。TGを分離するには、下顎枝が卵円孔に入り、眼科枝と上顎枝が頭蓋骨に入る視覚的境界の周りの枝を含めてTGを切断します。次に、頭蓋骨の半分とTGをSIFに浸します。マウス組織を準備するには、ハサミを使用して頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除きます。次に、はさみを椎骨の背側に尾側に挿入して脊髄と脳幹を露出させ、取り外します。次に、後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨の尾側部分を切り取り、小脳を露出させるこれらの骨構造を取り除きます。頭頂骨を矢状中央に切り、骨を取り除くと大脳が露出します。ヘラを使用して小脳を慎重に取り除き、脳幹を露出させます。脳幹の一部を含むTNCをスプリングハサミで単離し、続いて脳幹をSIFに浸します。次に、へらを使用して脳を慎重に取り外し、脳幹に入る三叉神経を切ります。TGを分離するには、卵円孔に入る下顎枝と頭蓋骨に入る眼科および上顎枝との視覚的境界の周りの枝を含めてTGを切り取ります。次に、TGをSIFに浸します。SIFを簡単に交換できるように、プラスチック容器に料金の蓋を追加し、5分ごとにSIFを交換して、SIFでラットとマウスの組織を30分間洗浄し始めます。室温で30分間洗浄した後、ラットTNCハーフとラットTGを350マイクロリットルのSIFで分離した微量遠心チューブキャップに移します。TNCを含むマウス脳幹を、250マイクロリットルのSIFを含む微量遠心チューブキャップに移します。最後に、2つのマウスTGを250マイクロリットルのSIFを備えたマイクロ遠心チューブキャップに移します。ラットの頭蓋骨の半分を6ウェル培養プレートに置き、頭蓋骨に400マイクロリットルのSIFを満たします。ラットの頭蓋骨を、ラットとマウスの組織を入れた微量遠心チューブキャップに入れ、摂氏37度の加湿インキュベーターに入れます。組織に触れずに5分ごとに20分間ピペットを使用してSIFを交換します。適切なラベリングにより、サンプル収集用の微量遠心チューブを準備します。次に、50マイクロリットルの10強度EIAバッファーを各マイクロ遠心チューブに追加します。次に、全濃度のSIFで希釈して試験化合物溶液及びビヒクル溶液を調製する。最後の洗浄に続いて、マウスTGおよびTNCに250マイクロリットルのSIF、ラットTGおよびTNCに350マイクロリットルのSIF、および各ラット頭蓋骨に400マイクロリットルのSIFを加える。10分間のインキュベーション後、50マイクロリットルの10強度EIAバッファーを含む事前にラベル付けされたマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプルを収集し、基礎CGRP放出の測定を可能にします。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを摂氏マイナス20度で保管してください。試験化合物を対応するビヒクルに最低濃度から始めて濃度を上げて加え、10分間インキュベートします。10分間のインキュベーション後、50マイクロリットルの10濃度EIAバッファーを含む事前にラベル付けされたマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプルを収集します。残りの液体を捨て、2番目に低い濃度をティッシュに加えます。すぐにサンプルを摂氏マイナス20度で保管し、残りの濃度でこの手順を繰り返します。実験のポジティブコントロールを実行するには、プロトコルの最後にポジティブコントロールを組織に追加します。10分間のインキュベーション期間の後、50マイクロリットルの10強度EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプルを収集します。収集されたサンプルで放出されたCGRPの濃度は、EIAキットに付属の製造元の指示に従って、EIAキットを使用して測定されます。ラットでは、カプサイシン曝露は、ビヒクルと比較して硬膜およびTGからの有意なCGRP放出を誘導した。硬膜では、CGRPの最大放出はカプサイシンの1マイクロモルで見出された。そしてTGでは、最大CGRP放出はカプサイシンの10マイクロモルで見出された。一元配置ANOVAで分析した場合、グリベンクラミドは硬膜およびTGからの基礎CGRP放出に影響を示さない。グリベンクラミドは、一元配置ANOVAで分析した場合、ビヒクルを含むカプサイシンと比較して、硬膜中のカプサイシン誘発性CGRP放出を40%、TGを39%有意に減少させました。.一過性受容器電位アンキリン-1アゴニストスーパーシンナムアルデヒドは、1、10、および100マイクロモルのスーパーシンナムアルデヒドを含むTGから濃度依存的にCGRPを放出し、双方向ANOVAで分析した場合、ビヒクルと比較してそれぞれ9%52%および69%増加したCGRPの放出をもたらすことがわかりました。一過性受容器電位アンキリン-1ノックアウトマウスのTGでは、1、10、および100マイクロモルのスーパーシンナムアルデヒドへの曝露により、双方向ANOVAで分析した場合、ビヒクルと比較してCGRPの放出にそれぞれ11%マイナス13%および9%の変化をもたらしたCGRPの放出の増加は見られませんでした。サンプル採取中に組織に触れないように注意し、すべてのサンプルのインキュベーション時間を計るときは正確にすることが重要です。適切なELISAキットが利用可能であれば、この手順を適用して、三叉神経血管系に存在する他のペプチドの放出を測定することが可能である。

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エクスビボげっ歯類の三叉神経血管系からのカルシトニン遺伝子関連ペプチドの放出

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