Name: Na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学ぶ ミトコンドリア内膜のNa⁺感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする簡便なアッセイ法。電子伝達機構の理解に貢献します。

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我々は、技術支援をしてくれたR・マルティネス・デ・メナ博士、M・M・ムニョス・エルナンデス・A・C・ヒメネス博士及びE・R・マルティネス・ヒメネス博士に感謝する。この研究はMICIN:RTI2018-099357-B-I00およびHFSP(RGP0016/2018)によって支援された。CNICは、カルロス3世サルード研究所(ISCIII)、シエンシア大臣、イノヴァシオン・イ・ユニベルシダデス(MCNU)、プロCNIC財団の支援を受けており、セヴェロ・オチョア・センター・オブ・エクセレンス(SEV-2015-0505)です。図 2 は、BioRender.com で作成したものです。

すべての動物実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って行われ、2010年9月22日の欧州連合指令(2010/63/UE)および2013年2月1日のスペイン勅令(53/2013)に従って、スペインのCentro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III(CNIC)の機関倫理委員会によって承認されました。使用される動物の数とその苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。
注:ミトコンドリアCoQプールのセグメンテーションを研究するためのこの比較アッセイは、以下のように記載されている:
1. タンパク質の定量
<ol><li>実験前に野生型マウス肝臓から単離したミトコンドリア26 (すなわち、ミトコンドリア膜)を3回凍結融解し、細胞小器官を反応基質に透過させる。</li>
	<li>単離されたミトコンドリア試料のタンパク質量をブラッドフォードまたはビシンコニン酸(BCA)法により定量する。ブラッドフォードの場合、1 mLの1xブラッドフォード試薬に2 μLのサンプルを加えます。</li>
	<li>サンプルをそれぞれ20μgの4つのサブサンプルに分割します(すなわち、A、B、C、D; 図2A)。</li>
</ol>2. CI+CIII活性の測定
メモ:プロトコルのこの部分では、サンプルAとBを使用してCI + CIII活性を測定します(図2B)。
<ol><li>サンプルAとBをそれぞれ10μgの2つのサブサンプル(すなわちA1、A2、B1、およびB2)に分割します。各サブサンプルを 1 mL キュベットに 30 μL の cyt c (10 mg/mL)、10 μL の 100 mM マロン酸塩と混合し、予熱した C1/C2 バッファー (表 1) を 37 °C で 980 μL まで加えます (キュベット A2 および B2 の場合は 979 μL)。 警告: この手順では、有毒な試薬であるマロン酸塩とシアン化カリウムを使用します。 注:cyt c(10 mg/mL)は、pHを7.2に調整した10 mMK2HPO4 溶液1 mLに10 mgのcyt cを混合することによって新鮮に調製する必要があり、実験中ずっと氷中で維持されなければならない。</li>
	<li>キュベットA1およびA2に10 μLの1 M KClを加え、キュベットB1およびB2に10 μLの1 M NaClを加える。</li>
	<li>1 μL の 1 mM ロテノンをサブサンプル A2 および B2 を含むキュベットに加えます。 警告: この手順では、毒性試薬ロテノンを使用します。</li>
	<li>測定の直前に、すべてのキュベットに10 μLのNADH(10 mM)を加えます。 注:10μLは、好ましくはキュベットのステップに添加されるので、反応は混合時に開始される。</li>
	<li>キュベットを慎重に3回ひっくり返して混ぜる。吸光度キュベットリーダー(UV/VISJASCO分光光度計)に入れます。</li>
	<li>[測定>パラメータ>全般]をクリックし、測定パラメータを波長:550nm、時間:4分の読み取り値に設定します。[同意する] ボタンと [開始] ボタンを押して、実験を開始します。</li>
	<li>測定の最後に、[ ファイル ]と[名前 を付けて保存]をクリックして、吸光度の線形増加を含む傾きを保存します。斜面は手動で収集することもできます。</li>
</ol>3. CII+CIII活性の測定
注: プロトコルのこの部分では、サンプル C と D を使用して CII+CIII 活性を測定します (図 2C)。
<ol><li>サンプル C と D をそれぞれ 10 μg の 2 つのサブサンプル (つまり、C1、C2、D1、および D2) に分割します。各サブサンプルを 1 mL キュベットに 30 μL の cyt c (10 mg/mL)、1 μL の 1 mM ロテノンと混合し、予熱した C1/C2 バッファーを 37 °C で 980 μL まで加えます (キュベット C2 および D2 の場合は 970 μL)。 警告: この手順では、シアン化カリウムとロテノンの毒性試薬を使用します。 注:cyt c(10 mg/mL)は、pHを7.2に調整した10 mMK2HPO4 溶液1 mLに10 mgのcyt cを混合することによって新鮮に調製する必要があり、実験中ずっと氷中で維持されなければならない。</li>
	<li>キュベットC1およびC2に10 μLの1 M KClを加え、キュベットD1およびD2に10 μLの1 M NaClを加える。</li>
	<li>1 μL の 1 mM アンチマイシン A をサブサンプル C2 および D2 を含むキュベットに加えます。 警告:このステップには、毒性試薬アンチマイシンAの使用が含まれます。</li>
	<li>測定の直前に、10 μLのコハク酸塩(1 M)をすべてのキュベットに加えます。 注:10μLは、好ましくはキュベットのステップに添加されるので、反応は混合時に開始される。</li>
	<li>キュベットを慎重に混ぜ、3回ひっくり返します。吸光度キュベットリーダー(UV/VIS分光光度計)に入れます。</li>
	<li>一般>測定>パラメータをクリックし、測定パラメータを波長:550nm、時間:4分の読み取りに設定します。[同意する] ボタンと [開始] ボタンを押して、実験を開始します。</li>
	<li>測定の最後に、[ ファイル ]と[名前 を付けて保存]をクリックして、吸光度の線形増加を含む傾きを保存します。斜面は手動で収集することもできます。</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

このプロトコルは、部分的にセグメント化されたCoQプールの存在を識別するための非常に簡単な手順を表していますが、考慮すべきいくつかの重要なステップがあります。基質(すなわち、NADHまたはコハク酸塩)は、これらの化合物の自己酸化が起こり得るので最後に添加することが好ましい。キュベットの反転は、読み取りを妨げる可能性のある気泡の形成を避けるために注意する必要があります。
さらに、現在の手法には、言及する価値のあるいくつかの制限があります。測定は無傷のミトコンドリアでは行われない。したがって、緩衝液の人工的な含有量および割合は、ミトコンドリアの天然環境との相違をもたらし得る。 試薬は過剰に添加され、無傷の組織における基質の真の可用性を表していない可能性があります。
現在の方法は、多くの研究室で容易に入手できない非常に特異的な遺伝子モデルおよび機器の生成および使用を暗示している1。このプロトコルは、広く入手可能な試薬およびツールを使用して、部分的に分化したCoQプールの存在を測定...

ミトコンドリア酸化リン酸化系(OXPHOS)は、ミトコンドリアによるアデノシン三リン酸(ATP)合成、活性酸素種(ROS)産生、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)またはコハク酸塩などの還元等価物の消費を駆動する主な経路である。OXPHOS系は5つのタンパク質複合体から構成される:複合体I(CI)はNADHを酸化し、CoQをユビキノール(CoQH2)に還元する。複合体II(CII)は、コハク酸塩をフマル酸に酸化し、CoQをCoQH2に還元する。複合体III(CIII)は、CoQH2を酸化してCoQに戻し、シトクロムc(cyt c)を減少させる。最後に、複合体IV(CIV)はcyt cを酸化し、酸素を水に還元する。この酸化還元鎖、いわゆる電子輸送鎖(mETC)は、IMMを横切るH+のポンピングに結合し、複合体V(CV)がアデノシン二リン酸(ADP)をATPにリン酸化するために使用される電気化学的勾配を作り出す。
mETC 複合体は、IMM 内で単独で存在することも、スーパーコンプレックスと呼ばれる第 4 次構造にアセンブルすることもできます。CIVはCIIIと集合し、III2+IVまたはQ-レスピラソームを形成する(CoQH2の存在下で呼吸することができるように)1,2,3またはホモ二量体またはホモオリゴマー4を形成することができる。CIIIはCIと相互作用し、超錯体I+III25を形成することができる。最後に、CIはまた、Q-スピリアソームと相互作用することができ、I+III2+IVまたはN-スピリアソーム(NADHを消費する呼吸ができるので)1,6,7,8,9,10を構築する。
CoQおよびcyt cは、それぞれCI/CIIからCIIIへ、およびCIIIからCIVへ電子を伝達する役割を担う移動式電子伝達体である。スーパーコンプレックスがこれらのキャリアに機能的な局所的な制限を課すかどうかは、過去20年間にわたって激しい議論の問題でした2,7,11,12,13,14,15,16,17。しかし、いくつかの独立したグループは、CoQおよびcyt cがIMM内のプールに機能的にセグメント化できることを実証している。CoQに関して、CIのための特定のCoQプール(CoQNAD)およびFAD依存性酵素専用の別のプール(CoQFAD)1、7、12、18、19に機能的にセグメント化することができる。しかしながら、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を区別するために、代替オキシダーゼ(AOX)の過剰発現およびCIIIの非存在下でCIを組み立てることができる特異的mtDNA変異体の生成が必要であった1,19,20。
低酸素状態における活性酸素種(ROS)産生のメカニズムは最近まで知られていなかった。急性低酸素症では、CIは活性/不活性(A / D)遷移を起こし、これはH+ポンピングNADH-CoQ酸化還元酵素活性の低下を伴う。このようなH+ポンピングの減少は、ミトコンドリアマトリックスを酸性化し、ミトコンドリアマトリックス中のリン酸カルシウム沈殿物を部分的に溶解させ、可溶性Ca2+を放出する。この可溶性Ca2+の増加は、Na+と引き換えにCa2+を押し出すNa+/Ca2+交換体(NCLX)を活性化する。ミトコンドリアNa+増加は、IMMの内側のリン脂質と相互作用し、その流動性およびCIIとCIIIとの間のCoQ移動を減少させ、最終的にスーパーオキシドアニオン、酸化還元シグナル21を生成する。興味深いことに、CoQ転移はCIIとCIIIの間でのみ減少し、CIとCIIIの間では減少しなかったため、1)Na+はミトコンドリア内の既存のCoQプールの1つだけを調節することができた。2) IMM 内に機能的に分化した CoQ プールが存在する。したがって、ミトコンドリア酵素活性の研究に広く使用されているプロトコールを使用して、言及されたCoQプールの存在を評価することができる。
現在のプロトコールは、酸化されたcyt cの還元の測定に基づいており、CIIIの基質は、コハク酸塩(すなわち、CII基質)またはNADH(すなわち、CI基質)の存在下での吸光度による。同じサンプルを2つに分け、そのうちの1つはKClで処理し、もう1つは同じ濃度のNaClで処理します。このように、Na+がIMM流動性を低下させることを考えると、CoQがIMM内のユニークなプールに存在する場合、CI+CIIIおよびCII+CIIIの両方がNa+の存在下で減少するであろう。しかし、部分的にセグメント化された機能的CoQプールにCoQが存在する場合、Na+の効果はCII + CIII活性にはほとんど(またはのみ)明らかであるが、CI + CIIIには明らかではない。最近発表された21のように、Na+はCIIとCIIIの間のCoQ転移にのみ影響し(図1C,D)、CIとCIIIの間(図1A,B)には影響しない。
このプロトコルは、多数の技術とともに、IMM内に部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を確認するために使用され、1つはCI(すなわち、CoQNAD)に捧げられ、もう1つはFAD結合酵素(すなわち、CoQFAD)専用である1,3,7;この観察は、議論され続けているが、22、いくつかのグループによって独立して裏付けられている7,19。したがって、スーパーコンプレックスへのCIのスーパーアセンブリは、CoQの局所移動度に影響を与え、スーパーコンプレックス1、7、13、14、23、24、25内のCIIIによるその使用を容易にする。

<table><tbody><tr><td>アンチマイシン A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Bradford タンパク質アッセイ</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>マロニン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium シアン化</td>物 <td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Managerソフトウェア</td><td>JASCO</td><td>バージョン2</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的coqプールを明らかにする

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

内側ミトコンドリア膜(IMM)のユビキノン(CoQ)プールは、複合体IまたはFAD依存性酵素のいずれかに部分的にセグメント化されている。このような細分化は、凍結融解ミトコンドリアにおける電子供与体としてNADHまたはコハク酸塩を用いた比較アッセイによって容易に評価することができ、そこではシトクロムc(cyt c)の減少が測定される。このアッセイは、IMMに対するNa+ の効果に依存しており、その流動性を低下させる。ここでは、NaClまたはKClの存在下でNADH-cyt-c酸化還元酵素活性およびコハク酸-cytc酸化還元酵素活性を測定するためのプロトコールを提示する。キュベット内の試薬の混合物に段階的に依存する反応は、Na+ またはK+の存在下で4分間分光光度法で測定される。同じ混合物を、吸光度の非特異的変化を差し引くために、特定の酵素阻害剤の存在下で並行して行う。NADH-cyt c酸化還元酵素活性は、これらの陽イオンのいずれの存在下においても低下しない。しかしながら、コハク酸−cytoc酸化還元酵素活性は、NaClの存在下では低下する。この簡単な実験は、1)IMM流動性およびCoQ伝達の減少におけるNa+ の効果を強調する。2)超錯体I+III2 がユビキノン(CoQ)転移をIMM流動性の低下による影響を受けることから保護すること。3)CIIとCIIIとの間のCoQ転移が、CIIとCIIIとの間のCoQ転移とは機能的に異なること。これらの事実は、IMMにおける機能的に分化したCoQプールの存在を支持し、それらがミトコンドリアの変化するNa+ 環境によって調節され得ることを示している。

このプロトコルの一般的な結果を以下に示します(図3)。減少したcytc吸光度が550nmに位置するように、すべての非阻害サブサンプルは550nmにおける吸光度の増加を示さなければならない。阻害されたサブサンプルは、理想的には平坦な線またはわずかに増加する傾きを示す(図3)。阻害サブサンプルからの傾きは、阻害されていないサブサンプルから減算されます。
サンプルAおよびBは、いずれも相関阻害によって補正され、NADH:cyt c酸化還元酵素活性を表し、同様の傾きを有する(図3A)。しかしながら、サブサンプルCおよびDは、いずれもそれらの相関阻害によって補正され、コハク酸:cyt c酸化還元酵素活性を表すが、サブサンプルCの活性がサブサンプルDの活性よりも高いという点で異なっている(図3B)。なお、基礎吸光度はサンプル間で若干異なる場合がある(<str...

このプロトコールは、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を研究するために、Na+の存在または非存在下でのミトコンドリア複合体活性CI+ CIIIおよびCII + CIIIを使用して比較アッセイを記述する。

Na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

このプロトコルは、セカンドメッセンジャーとしてのナトリウムの役割を強調し、部分的に分化したユビキノールプールの存在も示しています。この技術は、ユビキノールプールの研究のための非常に単純なアプローチを示していますが、そうでなければ非常に特異的な細胞モデルが必要です。このアプローチは、他の膜、特に脂質滴内の酵素における電子移動の研究に使用することができる。サンプルをそれぞれ 20 マイクログラムの 4 つのサブサンプルに分割し、それらを A から D にラベル付けします。サンプル A と B をそれぞれ 10 マイクログラムの 2 つのサブサンプルに分割し、A1、A2、B1、および B2 としてラベル付けします。テキストプロトコルの説明に従ってC1/C2バッファを準備し、摂氏37度に予熱します。1ミリリットルのキュベットに、各サブサンプルを30マイクロリットルのシトクロムcおよび10マイクロリットルのマロン酸塩に加える。C1/C2 バッファーを追加して、キュベット A1 および B1 では 980 マイクロリットル、A2 および B2 では 979 マイクロリットルにボリュームを上げます。キュベットA1およびA2に1モル塩化カリウム10マイクロリットル、B1およびB2に1モル塩化ナトリウム10マイクロリットルを加える。1マイクロリットルの1ミリモルのロテノンをキュベットA2およびB2に加える。測定の直前に、10マイクロリットルの10ミリモルNADHをすべてのキュベットに加える。キュベットを3回ひっくり返し、分光光度計に入れます。付属のソフトウェアで、[測定]、[パラメータ]の順にクリックし、[全般]に移動して、波長550ナノメートルで測定パラメータを設定し、4分間の読み取り時間で測定パラメータを設定します。[OK] をクリックして開始し、実験を開始します。測定の最後に、[ファイル] と [名前を付けて保存] をクリックして、吸光度の線形増加を含む傾きを保存します。サンプル C と D をそれぞれ 10 マイクログラムの 2 つのサブサンプルに分割し、C1、C2、D1、および D2 としてラベル付けします。各サブサンプルを1ミリリットルのキュベットに30マイクロリットルのシトクロムcおよび1マイクロリットルのロテノンと混合する。摂氏 37 度で予熱した C1/C2 バッファーを加えて、キュベット C1 および D1 で 980 マイクロリットル、C2 および D2 で 970 マイクロリットルに体積を上げます。キュベットC1およびC2に10マイクロリットルの1モル塩化カリウムを加え、D1およびD2に1モル塩化ナトリウム10マイクロリットルを加える。測定の直前に1ミリモルのアンチマイシンAをキュベットC2およびD2に1マイクロリットル、すべてのキュベットに1モルのコハク酸塩10マイクロリットルを加える。キュベットを3回ひっくり返し、分光光度計に入れます。測定を行い、測定終了時の吸光度の直線増加を含む傾きを保存します。このプロトコールは、NADHまたはコハク酸塩添加時のミトコンドリア膜によるシトクロムcの減少に対するナトリウムイオンの効果を研究するために使用された。サンプルAおよびBについて550ナノメートルで生成された吸光度トレースを、それらの対応する阻害について補正した。これらの痕跡は同様の傾きを示し、同様のNADH−シトクロムc酸化還元酵素活性を示す。しかしながら、サンプルCおよびDについての痕跡は異なっており、サンプルCのコハク酸シトクロムc酸化還元酵素活性がサンプルCのそれよりも高いことを示し D.In、この技術で測定される変化量を正規化するために、単離された複合体I活性、複合体II、または複合体IIIなどの他の方法をさらに行うことができる。この技術を用いて、ナトリウムがセカンドメッセンジャーとして関与する可能性のある生理学的環境を探っています。

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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