Na⁺ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする

このプロトコルは、セカンドメッセンジャーとしてのナトリウムの役割を強調し、部分的に分化したユビキノールプールの存在も示しています。この技術は、ユビキノールプールの研究のための非常に単純なアプローチを示していますが、そうでなければ非常に特異的な細胞モデルが必要です。このアプローチは、他の膜、特に脂質滴内の酵素における電子移動の研究に使用することができる。

サンプルをそれぞれ 20 マイクログラムの 4 つのサブサンプルに分割し、それらを A から D にラベル付けします。サンプル A と B をそれぞれ 10 マイクログラムの 2 つのサブサンプルに分割し、A1、A2、B1、および B2 としてラベル付けします。テキストプロトコルの説明に従ってC1/C2バッファを準備し、摂氏37度に予熱します。1ミリリットルのキュベットに、各サブサンプルを30マイクロリットルのシトクロムcおよび10マイクロリットルのマロン酸塩に加える。C1/C2 バッファーを追加して、キュベット A1 および B1 では 980 マイクロリットル、A2 および B2 では 979 マイクロリットルにボリュームを上げます。キュベットA1およびA2に1モル塩化カリウム10マイクロリットル、B1およびB2に1モル塩化ナトリウム10マイクロリットルを加える。1マイクロリットルの1ミリモルのロテノンをキュベットA2およびB2に加える。測定の直前に、10マイクロリットルの10ミリモルNADHをすべてのキュベットに加える。

キュベットを3回ひっくり返し、分光光度計に入れます。付属のソフトウェアで、[測定]、[パラメータ]の順にクリックし、[全般]に移動して、波長550ナノメートルで測定パラメータを設定し、4分間の読み取り時間で測定パラメータを設定します。[OK] をクリックして開始し、実験を開始します。

測定の最後に、[ファイル] と [名前を付けて保存] をクリックして、吸光度の線形増加を含む傾きを保存します。サンプル C と D をそれぞれ 10 マイクログラムの 2 つのサブサンプルに分割し、C1、C2、D1、および D2 としてラベル付けします。各サブサンプルを1ミリリットルのキュベットに30マイクロリットルのシトクロムcおよび1マイクロリットルのロテノンと混合する。摂氏 37 度で予熱した C1/C2 バッファーを加えて、キュベット C1 および D1 で 980 マイクロリットル、C2 および D2 で 970 マイクロリットルに体積を上げます。キュベットC1およびC2に10マイクロリットルの1モル塩化カリウムを加え、D1およびD2に1モル塩化ナトリウム10マイクロリットルを加える。測定の直前に1ミリモルのアンチマイシンAをキュベットC2およびD2に1マイクロリットル、すべてのキュベットに1モルのコハク酸塩10マイクロリットルを加える。キュベットを3回ひっくり返し、分光光度計に入れます。

測定を行い、測定終了時の吸光度の直線増加を含む傾きを保存します。このプロトコールは、NADHまたはコハク酸塩添加時のミトコンドリア膜によるシトクロムcの減少に対するナトリウムイオンの効果を研究するために使用された。サンプルAおよびBについて550ナノメートルで生成された吸光度トレースを、それらの対応する阻害について補正した。

これらの痕跡は同様の傾きを示し、同様のNADH−シトクロムc酸化還元酵素活性を示す。しかしながら、サンプルCおよびDについての痕跡は異なっており、サンプルCのコハク酸シトクロムc酸化還元酵素活性がサンプルCのそれよりも高いことを示し D.In、この技術で測定される変化量を正規化するために、単離された複合体I活性、複合体II、または複合体IIIなどの他の方法をさらに行うことができる。この技術を用いて、ナトリウムがセカンドメッセンジャーとして関与する可能性のある生理学的環境を探っています。