Name: ヒト膵臓組織からのN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析のためのスピンチップ濃縮戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ、チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィー法を用いてヒト膵臓組織からN-糖ペプチドとリンペプチドを同時濃縮する方法。質量分析による翻訳後修飾の検出向上と糖尿病やがんなどの疾患バイオマーカー発見への応用を確認できます。

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この研究は、NIH(R01DK071801、RF1AG052324、P01CA250972、およびR21AG065728)、および若年性糖尿病研究財団(1-PNF-2016-250-S-BおよびSRA-2016-168-S-B)からの助成金によって部分的に支援されました。ここで紹介するデータは、ウィスコンシン大学臨床・トランスレーショナルリサーチ研究所のNIH/NCATS UL1TR002373賞の支援によっても一部取得されました。Orbitrap機器は、NIHの共有機器助成金(NIH-NCRR S10RR029531)とウィスコンシン大学マディソン校の研究・大学院教育担当副学長室の支援を受けて購入されました。また、ヒト膵臓を研究に提供してくれたウィスコンシン大学臓器・組織提供機構の寛大な支援と、サンプルを私たちの研究室に提供してくれたDan Tremmel、Sara D. Sackett博士、Jon Odorico教授の助けにも感謝します。私たちの研究チームは、この研究のために組織を寄付した家族に特別な感謝を捧げたいと思います。L.L.は、ウィスコンシン大学カーボーンがんセンター(233-AAI9632)からの膵臓がんパイロット助成金であるNIH助成金S10OD025084、ならびにウィスコンシン大学同窓会研究財団およびウィスコンシン大学マディソン薬学部が提供する資金によるヴィラス功労教授職およびチャールズメルボルンジョンソン特別議長教授職を認めています。

故人の近親者からの研究のための膵臓組織の使用について同意が得られ、ウィスコンシン大学マディソン健康科学施設審査委員会の承認が得られた。IRBの監督は、45 CFR 46.102(f)によって認識されているヒト被験者を関与させないため、必須ではありません。
警告: このプロトコールで使用される試薬(酸(ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸)、塩基(水酸化アンモニウム)、極低温剤(液体窒素)を含む試薬の取り扱いには注意が必要です。関連する危険と必要な予防措置を理解するために使用する試薬の安全データシートをお読みください。パーセンテージを使用して示される濃度は、体積/総体積(v / v)であり、水で希釈される。
1. 組織凍結粉砕、溶解、タンパク質抽出
<ol><li>デュワーを液体窒素で満たします。膵臓組織と接触する組織粉砕機の部分、すなわちチャンバー、粉砕機、および回収スプーンをポリスチレン容器に予め冷やす。</li>
	<li>凍結組織片を予め冷却したサンプルホルダーに移し、スプーン一杯の液体窒素を組織に加える。</li>
	<li>粉砕機をチャンバー内に置き、マレットを使用して5〜10回叩いてサンプルを粉砕する。チャンバーから粉砕機を取り外し、付着組織粉末および片をこすり落とす。</li>
	<li>組織が溶け始めたら、スプーン一杯の液体窒素をチャンバーに加えます。試料が大きな組織塊のない微粉末になるまで粉砕工程を繰り返す。サンプルを約 100 mg のアリコートに分けて、予め冷却したチューブに入れます。</li>
	<li>4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、150 mM NaCl、および25 mM Tris(pH = 7.4)を含む溶解バッファーを調製する。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の各1錠を500μLの水に溶解し、それぞれ20倍のストックを得る。各インヒビターの20xストックの必要量を溶解バッファーに追加して、最終的に1x濃度にします。</li>
	<li>チューブに組織100 mgあたり600 μLの溶解バッファーを加え、加熱ブロック内で95°Cで800 rpmで振とうしながら10分間インキュベートします。加熱ブロックからサンプルを取り出し、室温まで冷却します。</li>
	<li>60 Wエネルギー(20 kHz)でサンプルを超音波処理し、その間に30秒の残りを持つ15秒のパルスを使用して45秒にします。サンプルを3,000 x g で4°Cで15分間ペレット化します。</li>
	<li>上清を5x沈殿溶媒に加え、50%アセトン、49.9%エタノール、および0.1%酢酸を含む1.5mLの沈殿溶媒に300μLの溶解緩衝液を加える。-20°C (78 °F) で一晩冷やす。</li>
	<li>サンプルを再び3,000 x g で4°Cで15分間ペレット化し、上清を除去した。ヘラで分解し、同量の沈殿溶媒と混合してペレットを洗浄する。ペレットを再度、洗浄工程2xを繰り返す。</li>
	<li>サンプルを16,000 x g で4°Cで15分間ペレット状にします。 サンプルペレットをヒュームフードで15分間風乾し、続行できる状態になるまで-80°Cで保存します。</li>
</ol>2. タンパク質の消化と脱塩
<ol><li>タンパク質ペレットを、50 mM トリエチルアンモニウム重炭酸塩 (TEAB) および 8 M 尿素を含む 300 μL の新しく作られた消化バッファーに再懸濁します。</li>
	<li>製造業者のプロトコールに従ったタンパク質アッセイを用いて溶液のタンパク質濃度を推定する。</li>
	<li>溶液中のタンパク質に、ジチオスレイトール(DTT)を終濃度5mMまで添加し、混合し、室温で1時間減少させる。次いで、ヨードアセトアミド(IAA)を終濃度15mMとなるように添加し、混合し、室温で暗所で30分間アルキル化させた。混合して前と同じ体積でDTTの添加を繰り返してアルキル化をクエンチする。</li>
	<li>LysC/トリプシンを1:100の酵素:タンパク質比で加え、37°Cで4時間インキュベートする。次に、50 mM TEABを加えて、1 Mを<するために使用した8 M尿素を希釈し、トリプシンを1:100の酵素:タンパク質比で加え、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>トリフルオロ酢酸(TFA)を0.3% v / vに添加して消化を急冷する。開始タンパク質 1 mg ごとに、脱塩カートリッジ (1 cc、10 mg) を 1 mL のアセトニトリル (ACN) で、3 x を 1 mL の 0.1% TFA でコンディショニングします。</li>
	<li>消化した混合物を脱塩カートリッジにロードします。1mLの0.1%TFAを用いて混合物3xを洗浄する。溶出が遅い場合は、陽圧をかけますが、毎秒1滴>流量は避けてください。</li>
	<li>60%ACNおよび0.1%ギ酸(FA)溶液1mLを用いてペプチドを溶出する。溶出したペプチドを、溶媒が完全に蒸発するまで遠心真空濃縮器を用いて約35°Cで乾燥させた。</li>
	<li>ペプチドを300 μLの水に再懸濁し、メーカーのプロトコールに従ってペプチドアッセイを使用してペプチド濃度を推定します。ペプチドを500μgのアリコートに分け、完全に乾燥させる。</li>
</ol>3. ERLIC N-糖ペプチド濃縮
メモ:正確な遠心分離機の速度と時間はサンプルによって異なる場合があり、最適化する必要があります。一般に、材料のコンディショニングおよび洗浄には2分間300 x g 、溶出には5分間100 x g が適しています。
<ol><li>約3mgのコットンウールを秤量し、空の200μLピペットチップ(スピンチップ; 材料表を参照)に詰めます。</li>
	<li>強陰イオン交換濃縮材料をチューブに移し、10mg材料あたり0.1%TFAを200μL添加する。500 μgのペプチドを濃縮するには、15 mgの材料を使用してください。15分間振盪して材料を活性化する。</li>
	<li>チューブアダプターを使用して、スピンチップを2mLチューブの上に置き、先端に15mgの材料用の十分なスラリーを追加します。ベンチトップ遠心分離機で回転させて液体を除去します。</li>
	<li>200 μL の ACN で 3 倍遠心分離して材料を調整します。100 mM 酢酸アンモニウム (NH4Ac)、1% TFA、および 80% ACN/0.1% TFA (ローディングバッファー) を使用して、3 連のコンディショニングを繰り返します。</li>
	<li>500 μg のペプチドサンプルを約 200 μL のローディングバッファーに再懸濁し、スピンチップを流します。フロースルー 2x を再ロードして、完全なバインディングを確保します。</li>
	<li>200 μL の 80% ACN/0.1% TFA を使用して 5 倍、次に 200 μL の 80% ACN/0.1% FA を使用して 2 倍に遠心分離して、材料を洗浄します。</li>
	<li>ペプチドを以下の各々の200μLで遠心分離することによって溶出する:50% ACN/0.1% FA(E1);0.1% FA (E2);0.1% TFA (E3);300 mM KH2PO4、10% ACN (E4)。</li>
	<li>200 μL の 80% ACN/5% NH 4 OH で 2 倍速遠心分離して材料を洗浄します。残りのペプチドを200 μLの10%NH4OH(E5)で溶出します。</li>
	<li>約35°Cの遠心真空濃縮器を使用して、すべての溶出物を完全に乾燥させます。</li>
	<li>塩基性溶出(E5)の脱塩は、メーカーのプロトコールに従って脱塩チップを用いて行う。</li>
	<li>脱塩チップからの溶出液を遠心真空濃縮機を用いて約35°Cで乾燥させて完全にする。</li>
</ol>4. Ti(IV)-IMACリンペプチド濃縮
メモ:正確な遠心分離機の速度と時間はサンプルによって異なる場合があり、最適化する必要があります。一般に、材料のコンディショニングおよび洗浄には2分間300 x g 、溶出には5分間100 x g が適しています。
<ol><li>約3mgのコットンウールを計量し、空の200μLピペットチップ(スピンチップ)に詰めます。</li>
	<li>Ti-IMACリンペプチド濃縮材料をチューブに移し、10mg材料あたり0.1%TFAを200μL添加する。500μgのペプチドを濃縮するには、10mgの材料を使用してください。</li>
	<li>チューブアダプターを使用して、スピンチップを2mLチューブの上に置き、10mg材料用に十分なスラリーをチップに加えます。ベンチトップ遠心分離機で回転させて液体を除去します。</li>
	<li>上記と同じ遠心分離機設定を使用して、200 μL の 40% ACN/3% TFA で材料をコンディショニングします。ペプチドサンプルを200 μLの40% ACN/3% TFAに再懸濁し、スピンチップを流します。フロースルーを 2 回リロードして、より完全なバインディングを確保します。</li>
	<li>200 μL の 50% ACN、6% TFA、および 200 mM NaCl 溶液で遠心分離して材料を洗浄し、続いて 200 μL の 30% ACN および 0.1% TFA 溶液で 2 倍洗浄します。</li>
	<li>200 μL の 10% NH 4 OH でペプチドを溶出します。溶出液を真空下で完全に乾燥させる。脱塩チップを用いて、製造元のプロトコールに従って脱塩を行う。真空下で脱塩チップからの溶出を完全になるまで乾燥させます。</li>
</ol>5. 2機能Ti(IV)同時濃縮
メモ:正確な遠心分離機の速度と時間はサンプルによって異なる場合があり、最適化する必要があります。一般に、材料のコンディショニングおよび洗浄には2分間300 x g 、溶出には5分間100 x g が適しています。
<ol><li>約3mgのコットンウールを量り、空のスピンチップに詰めます。</li>
	<li>約1gのTi(IV)-IMAC材料をチューブに移す。既知の濃度の物質、例えば20mg/200μLに0.1%TFAを加える(物質はこの懸濁液に4°Cで保存することができる)。</li>
	<li>500 μg のペプチドから濃縮するには、スピンチップに十分なスラリーを加えて、20 mg の材料を移します。スピンチップを200 μLの0.1% TFAで遠心分離して洗浄します。</li>
	<li>サンプルを200 μLの負荷/洗浄溶媒(80% ACNおよび3% TFA)に再懸濁し、スピンチップを流します。フロースルー 2x をリロードします。</li>
	<li>スピンチップを200μLの負荷/洗浄溶媒で遠心分離して6x洗浄します。スピンチップを200 μLの80% ACN/0.1% FA溶液で洗浄します。</li>
	<li>ペプチドを、60% ACN/0.1% FA(E1)および40% ACN/0.1% FA(E2)のそれぞれ200 μLで溶出します。各溶出を個別に分析します。</li>
	<li>20% ACN/0.1% FA および 0.1% FA のそれぞれ 200 μL でペプチドを溶出します。2 つの溶出液を組み合わせて 1 つのサンプルとして分析します(E3)。</li>
	<li>ペプチドを以下の各々の200μLで溶出する:40%ACN/3%TFA;50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl;30%のACN / 0.1%のTFAです。これらの溶出液を結合し、パックチップを使用して脱塩後に1つ(E4)として分析します。</li>
	<li>200 μL の 90% ACN/2.5% NH4OH を 3 倍に使用して、材料を塩基性 pH にコンディショニングします。これらの洗浄は破棄してください。</li>
	<li>ペプチドを、60% ACN/10% NH 4 OH (E5) および40% ACN/10% NH 4 OH (E6) のそれぞれ 200 μL で溶出します。これらの溶出は、パックチップを使用して脱塩後に別々に分析します。</li>
	<li>ペプチドを以下の各々の200μLで溶出する:20%ACN/10%NH4OH;10% ACN/10% NH4OH;および10%NH4OH。これらの溶出液を結合し、パックチップを使用して脱塩後に1つ(E7)として分析します。</li>
	<li>すべての溶出液を真空下で完全に乾燥させます。</li>
</ol>6. ナノフロー逆相液体クロマトグラフィー質量分析(nRPLC-MS)
メモ: MS データの集録および解析方法は多様であるため、次の手順では、推奨される LC-MS パイプライン (およびそれに関連するパラメータ) を 1 つだけ説明します。前述のサンプル調製および濃縮ステップを使用して生成されたサンプルは、十分なデータ品質があれば、市販のクロマトグラフィーカラムの使用を含む他の機器セットアップを使用して分析できます。
<ol><li>19に記載されているように、C18材料を使用して長さ15cmのキャピラリー(内径75μm)を引っ張って梱包します。移動相A(水中0.1%FA)および移動相B(ACN中0.1%FA)を調製する。</li>
	<li>濃縮ペプチドサンプルを 15 μL の 3% 移動相 B. サンプル 2 μL (約 13% サンプル容量) をカラムに直接負荷します。各サンプルを技術的な複製で分析します。</li>
	<li>3% ~ 30% の勾配を使用して、移動相 B を 0.3 μL/minの流速で 90 分間かけてペプチドを溶出します。75% B を 8 分間使用し、続いて 95% B を 8 分間使用してカラムを洗浄し、3% B で 12 分間平衡化して方法を終了します。</li>
	<li>次のパラメータを持つ上位20個のピークのデータ依存集録を使用して、質量分析計を正イオンモードで操作します:スプレー電圧2kV;120,000解像度で400-2,000 m/zのLC/MSでのMS 1検出、2E5自動ゲイン制御(AGC)ターゲット、100 msの最大注入時間、30%RFレンズ、1.6 m/zウィンドウの四重極絶縁、充電状態2-8および未定、および30秒の動的除外。LC/MSにおけるMS 2検出では、22%、30%、および38%の段階的なHCDフラグメンテーションを使用し、30,000の分解能で第1質量120m/z、5E4 AGCターゲット、および2.5E4の最小強度要件を固定しました。</li>
</ol>7. MSデータ解析
注: ここでは、2 つの異なるソフトウェアを使用して同じデータセットを分析する 1 つのデータ分析パイプラインを示します。リン酸化およびグリコシル化は、ここで説明するように2つの別々のソフトウェアではなく、単一のソフトウェアを使用して同時に検索することができるが、一般に、ソフトウェアの検索時間は、検索空間、すなわち、考慮されるPTMの数に比例する。このため、2つの異なるソフトウェアが糖ペプチドおよびリンペプチドの探索に並行して使用される。
<ol><li>適切なソフトウェアを使用して生データファイルを処理します( 材料表を参照)。<ol>
<li>UniProt ヒト (または適切な種固有の) データベースに対してスペクトルを検索します。Cysのカルバミドメチル化を固定修飾として設定する。欠落した酵素切断の最大数を2つとして設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生データファイルにおいて、市販のソフトウェア( 材料表参照)を用いて、分析対象の糖ペプチドを検索する20。10 ppm の前駆体質量耐性と 0.01 Daフラグメントの質量耐性を使用し、最小ペプチド長は 4 残基です。<ol>
<li>HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2)、HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2)、HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1)HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1)、HexNAc(3-4)Phospho(1)を含む、典型的なマンノース-6-リン酸(M6P)グリカンで拡張されたソフトウェア組み込みN-グリカンデータベースを使用した検索。</li>
		<li>N-グリコシル化を一般的な修飾として設定する。ペプチドスペクトルマッチ(PSM)あたりの最大総修飾数を1つの共通および2つのまれなものとして設定する。</li>
		<li>Met の酸化 (まれ)、Asn および Gln での脱アミド化 (まれ)、Ser、Thr、Tyr でのリン酸化 (共通) の可変変更を設定します。次の識別フィルターを設定します: スコア カットオフ > 150、|対数確率|> 1、デルタ mod スコア> 10 です。</li>
		<li>「タンパク質」タブおよび「ペプチド・グループ」タブで検索結果をエクスポートおよび分析します。</li>
		<li>MS/MSスペクトルにPhosphoHexオキソニウムイオン(243 m/z)が存在するかどうか、M6Pグリカンを含む識別を手動でスクリーニングし、この診断イオンを含まない偽陽性識別を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生データファイルにおいて、オープンソースソフトウェア( 材料表参照)を用いて、分析すべきリンペプチドを検索する21。20 ppm の最初の検索ペプチド耐性と 4.5 ppm のメイン検索ペプチド耐性を使用します。<ol>
<li>ペプチドごとの修飾の最大数を 5 に設定します。PSMおよびタンパク質偽発見率(FDR)を1%に設定し、最小ペプチド長を7残基に設定します。</li>
		<li>可変修飾を、Metでの酸化、N末端タンパク質アセチル化、およびSer、Thr、およびTyrでのリン酸化として設定する。modificationSpecificPeptides ファイルを使用して検索結果を分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タンパク質、ペプチド、および修飾部位レベルでのPTMの同定の数を決定します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する利益を宣言していない。

二重機能Ti(IV)-IMAC戦略は、単一のサンプル調製ワークフローで同じサンプルからのN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析に役立ちます。ERLICベースの方法は、PTMの同時濃縮を実行することも示されている。どちらの戦略も、PTM分析14,18の深いカバレッジのために以前に使用されてきました。スピンチップを使用してサンプルのインキュベーション時間を短縮するためにデュアルTi法を適応させるにあたり、このプロトコルがリソース集約的ではなく、より広くアクセス可能になることを願っています。
複数のPTMの同時分析は、分析種と濃縮材料の表面上の官能基との間の相乗的相互作用によって達成される。綿によるスピンチップの最初のパッキングでは、セルロース24上のヒドロキシル基の有病率のために、HILICモードでの糖ペプチドの保持が増加する。水とアセトニトリル(水混和性溶媒)を使用することにより、糖ペプチドは水と有機層の形成により保持お...

タンパク質の翻訳後修飾(PTM)は、タンパク質の構造、ひいてはそれらの機能および下流の生物学的プロセスの調節において主要な役割を果たす。ヒトプロテオームの多様性は、さまざまなPTMによってもたらされる組み合わせ変動性のために指数関数的に増加します。ゲノムによって予測される正準配列からのタンパク質の異なるバリアントはプロテオフォームとして知られており、多くのプロテオフォームはPTMから生じます1。健康と疾患におけるプロテオフォームの多様性を研究することは、近年大きな関心を集めている研究分野となっています2,3.
プロテオフォーム、より具体的にはPTMの研究は、質量分析(MS)ベースのプロテオミクス法の開発を通じて、より容易になりました。MSを使用して、分析種はイオン化され、断片化され、断片の m / z に基づいて同定される。濃縮法は、非修飾形態のタンパク質と比較してPTMの相対的存在量が低いためにしばしば必要である。トップダウン分析と呼ばれるインタクトなタンパク質とそのPTMの分析はより日常的になっていますが、ボトムアップ分析におけるタンパク質の酵素消化とその成分ペプチドの分析は、依然としてPTM分析で最も広く使用されているルートです。最も広く研究されている2つのPTMと、 生体内で最も一般的な2つのPTMは、グリコシル化とリン酸化4です。これら2つのPTMは、細胞のシグナル伝達と認識において主要な役割を果たすため、疾患研究において特徴付けるための重要な修正である。
さまざまなPTMの化学的特性は、多くの場合、分析前のタンパク質およびペプチドレベルでこれらのPTMの濃縮への経路を提供します。グリコシル化は、各単糖上のヒドロキシル基の存在量に起因する親水性PTMである。この特性は、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)において糖ペプチドを富化するために使用することができ、これは疎水性非修飾ペプチド5からより多くの親水性糖ペプチドを分離することができる。リン酸化はリン酸部分を付加し、これは酸性pHを除いて負に荷電している。この電荷のために、チタンを含む様々な金属カチオンを使用して、リンペプチドを引き付けて結合させ、非リン酸化種を洗い流すことができる。これが固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)の原理である。グリコシル化およびリン酸化のためのこれらおよび他の濃縮戦略のさらなる議論は、最近のレビュー6,7で見出すことができる。
ペプチド上のPTMの化学量論が低いため、濃縮プロトコルには比較的大量の出発ペプチド物質(0.5mg以上)がしばしば必要です。腫瘍コア生検や脳脊髄液分析など、この量のサンプルが容易に得られないシナリオでは、最大の生体分子情報をもたらす簡単なワークフローを使用することが有益です。私たちの研究室などによって開発された最近の戦略は、同じPTM濃縮ワークフロー8、9、10、11、12を用いたグリコシル化とリン酸化の同時および並列分析を強調しています。これら2つのPTMの化学的特性は異なる場合がありますが、これらのPTMは、使用される革新的な分離技術および材料のために、複数のステップで分析される可能性がある。例えば、静電反発−親水性相互作用クロマトグラフィー(ERLIC)は、分析物と移動相との間の親水性相互作用に基づく分離を、分析物と固定相物質との間の電荷−電荷相互作用と重ね合わせる13、14、15、16。酸性pHでは、固定相へのリン酸化ペプチドの誘引は、それらの保持および非修飾ペプチドからの分離を改善することができる。親水性ミクロスフェアに固定化されたTi(IV)からなる材料は、HILICおよびIMACベースの溶出に使用して、リンペプチドおよび中性、酸性、およびマンノース-6-リン酸化糖ペプチドを分離することができる17、18。この戦略は、デュアルファンクショナルTi(IV)-IMACとして知られています。これらの戦略を使用して、単一のワークフローで複数の PTM を充実させることで、潜在的な PTM クロストークインタラクションの分析をよりアクセスしやすくすることができます。さらに、サンプルの総量と時間要件は、並行して実行した場合(つまり、HILICとIMACを別々のサンプルアリコートで行う場合)従来の濃縮方法よりも少なくなります。
タンパク質のグリコシル化とリン酸化の同時解析のための二重機能Ti(IV)-IMAC戦略を実証するために、我々はそれを死後ヒト膵臓組織の分析に適用した。膵臓は、消化酵素とインスリンやグルカゴンなどの調節ホルモンの両方を産生します。膵臓機能は、膵臓疾患で障害されます.糖尿病では、血糖値の調節が影響を受け、血液中のグルコースレベルが高くなります。膵炎では、炎症は臓器3の自動消化から生じる。グリコシル化およびリン酸化を含むPTMプロファイルの変化は、しばしばそうであるように、他の疾患において起こり得る。
ここでは、膵臓組織から抽出されたタンパク質に由来するN-糖ペプチドおよびリンペプチドについて、二重機能Ti(IV)-IMAC戦略に基づくスピンチップベースの同時濃縮法のプロトコルについて説明します。このプロトコルには、 図1に示すように、タンパク質の抽出と消化、濃縮、MSデータ収集、およびデータ処理が含まれます。この研究の代表的なデータは、識別子PXD033065のProteomeXchangeコンソーシアム を通じて 入手できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63735/63735fig01.jpg"> 図1:ヒト膵臓組織由来のN-糖ペプチドとリンペプチドの同時解析ワークフロー 組織は、洗剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いてタンパク質抽出の前に、まず微粉末に凍結粉砕される。次いで、タンパク質は酵素消化を受ける。得られたペプチドは、二重機能性Ti(IV)-IMACを用いた濃縮の前に小分けされる。生データは、ナノスケール逆相液体クロマトグラフィー質量分析(nRPLC-MS)を使用して収集され、データベース検索ソフトウェアを使用して分析されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63735/63735fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルは、PTM 分析をよりアクセスしやすくし、同じワークフロー内の複数の PTM のより広範な分析を可能にすることを目的としています。このプロトコルは、細胞および生体液を含む他の複雑な生物学的マトリックスに適用することができる。

<table><tbody><tr><td>酢酸、氷(認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>アセトン(認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、オプティマLC / MSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム(結晶/認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A637-500</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化アンモニウム(認定ACSプラス)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A669-212</td><td></td></tr><tr><td>Byonicソフトウェア</td><td>タンパク質メトリクス</td><td>n/a</td><td>グリコプロテオミクス分析に使用される商用ソフトウェア (https://proteinmetrics.com/byos/)</td></tr><tr><td>C18 BEH材料</td><td>ウォーターズ</td><td>186002353</td><td>カラムから取り外され、ナノキャピラリーを充填するために使用される材料(プルドインテグレートチップを機器入口と直接一直線に使用)</td></tr><tr><td>CAE-Ti-IMAC、100%</td><td>J&K Scientific</td><td>2749380-1G</td><td>二重官能性Ti(IV)-IMACに使用される材料;従来のIMAC/従来のリン酸化ペプチド濃縮にも使用可能</td></tr><tr><td>セルクラッシャーキット</td><td>セルクラッシャー</td><td>n/a</td><td>抽出前に組織サンプルを粉末に粉砕するために使用</td></tr><tr><td>エッペンドルフ5424R マイクロ遠心分離機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-401-205</td><td>温度制御された遠心分離用</td></tr><tr><td>cOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td>シ<td>グマ</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>DTT、分子グレード(DL-ジチオスレイトール)</td><td>プロメガ</td><td>V3151</td><td>タンパク質還元剤</td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ(100%)、USP</td><td>フィッシャー22-032-601</td><td></td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドアナログボルテックスミキサー</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック02-215-414</td><td></td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランド低保持マイクロ遠心チューブ(1.5mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド低保持マイクロ遠心チューブ(2 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-321</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドモデル120ソニックディスクレメンブレーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB120110</td>超音波ギ<td></td></tr><tr><td>酸、99.0 +%、オプティマLC / MSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>を使用したサンプル溶解用溶融シリカキャピラリー(75 &mu;m内径、360&mu;m 外径)</td><td>Polymicro Technologies LLC</td><td>100 m TSP075375</td><td>エミッターを内蔵した社内プルドパックカラム用</td></tr><tr><td>フッ化水素酸 (48 wt. % in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339261-100ML</td><td>プルドキャピラリーカラム</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド、BioUltra</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td>タンパク質還元試薬</td></tr><tr><td>MaxQuant software</td><td>n/a</td><td>n / a</td><td>リン酸化プロテオミクス分析に使用されるフリーソフトウェア(https://www.maxquant.org/)</td></tr><tr><td>加熱および冷却を備えたマルチサームシェーカー</td><td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>H5000-HC</td><td>加熱ブロック</td></tr><tr><td>オアシスHLB 1 cc Vacカートリッジ、カートリッジあたり10 mg吸着剤、30 & マイクロ;m、100/pk</td><td>ウォーターズ</td><td>186000383</td><td>トリプシン消化物用の大型カートリッジ脱塩 (各約 1 mg までの負荷容量)</td></tr><tr><td>OMIX C18 ピペットチップ、100 &micro;Lチップ、10 - 100 &mu;L 溶出量 1 x 96チップ</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>濃縮溶出のための脱塩用小型パックピペットチップ</td></tr><tr><td>P-2000 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000/F</td> LC-MS PhosSTOPホスファターゼ阻害剤錠剤<td>用ナノキャピラリーカラムの引き抜き用</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>PolySAX LP (12 &mu;m、細孔サイズ300&Aring;)</td><td>PolyLC</td><td>BMSX1203</td><td>ERLIC/従来の糖ペプチド濃縮に使用される強陰イオン交換クロマトグラフィー用材料</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (結晶性/認定ACS)</td> <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>磁気攪拌板内蔵圧力注入セル</td><td>Next Advance</td><td>PC77-MAG</td><td>最大2500psi</td></tr><tr><td>の固定相を持つナノキャピラリーカラムの充填用Proteome Discovererソフトウェア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>n/a</td><td>プロテオミクス分析用商用ソフトウェア(統合データベース検索ソフトウェアノード付き)およびデータ可視化(https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)</td></tr><tr><td>SpeedVac SC110 真空濃縮器 モデルSC110-120</td><td>Savant</td><td>n/a</td><td>サンプル乾燥用遠心真空濃縮器(熱中)</td></tr><tr><td>SDS溶液、10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液、分子生物学/電気泳動</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2436200</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシンググレード修飾トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V5111</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム(結晶性/認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>トップチップ、空、10-200 & マイクロ;L、96個入りパック</td><td>Glygen Corporation</td><td>TT2EMT.96</td><td>ミクロンサイズの穴が開いた空のピペットチップで、濃縮のためのクロマトグラフィー材料のパックに使用できる、チューブアダプターにバンドルされています</td></tr><tr><td>重曹トリエチルアンモニウム緩衝液(TEAB、1 M、pH 8.5(揮発性))</td><td>シグマ</td><td>90360-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸、試薬グレード、99%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>60-017-61</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース(白色結晶または結晶性粉末/分子生物学)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/Lys-Cミックス、質量分析グレード</td><td>プロメガ</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>尿素(認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>U15-500</td><td></td></tr><tr><td>水、オプティマLC/MSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W64</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト膵臓組織からのn-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析のためのスピンチップ濃縮戦略

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

質量分析は、翻訳後修飾(PTM)を深くカバーすることができますが、非修飾分析物と比較して化学量論が低いため、複雑な生物学的マトリックスからのこれらの修飾の濃縮がしばしば必要になります。ボトムアッププロテオミクスワークフローでは、得られたペプチドが分析される前にタンパク質を酵素的に消化するボトムアッププロテオミクスワークフローにおけるペプチドに対するPTMのほとんどの濃縮ワークフローは、1種類の修飾のみを濃縮します。しかし、生物学的機能につながるのはPTMの補完物全体であり、単一のタイプのPTMの濃縮は、PTMのそのようなクロストークを見逃す可能性があります。 PTMクロストークは、タンパク質グリコシル化とリン酸化の間で観察されています。 PTMクロストークは、ヒトタンパク質において最も一般的な2つのPTMであり、質量分析ワークフローを使用して最も研究された2つのPTMも観察されています。本明細書に記載される同時濃縮戦略を用いて、両方のPTMは、複雑な生物学的マトリックスである死後ヒト膵臓組織から富化される。二機能性Ti(IV)固定化金属アフィニティークロマトグラフィーは、便利なスピンチップベースの方法で複数のフラクションで同時に様々な形態のグリコシル化とリン酸化を分離するために使用され、潜在的なPTMクロストーク相互作用の下流分析を可能にします。糖ペプチドおよびリンペプチドのこの濃縮ワークフローは、さまざまなサンプルタイプに適用して、複数のPTMの詳細なプロファイリングを達成し、将来の研究のために潜在的な標的分子を同定することができます。

生ファイルや検索結果を含む代表的な質量分析データは、データセット識別子PXD03306522のPRIDEパートナーリポジトリを介してProteomeXchangeコンソーシアムに寄託されています。
この作業では、重複注入反復を、各濃縮溶出について分析した。両方の技術的反復から作られた同定は、最終分析で照合された。MS/MS断片化のためのペプチド前駆体の選択におけるデータ依存的取得の半確率的性質のために、技術的重複間で約70%〜80%の同定重複が予想される。これらの方法を使用するアプリケーションでは、少なくとも2つの技術的反復が推奨されます。下流の統計解析では、異なる実験条件に対する生物学的複製を考慮する必要があります。データ報告のための所望のストリンジェンシーに応じて、識別のためのフィルタを設定することが有用であり得る、例えば、報告される少なくとも x 個の技術的または生物学的複製における同定。
各濃縮物からの各溶出のトータルイオンクロマトグラ...

翻訳後修飾(PTM)は、タンパク質の構造と機能を変化させます。複数のPTMタイプを同時に強化する方法は、分析のカバレッジを最大化することができます。我々は、膵臓組織におけるタンパク質N-グリコシル化およびリン酸化の同時濃縮および分析のための質量分析に続く二重機能Ti(IV)固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。

ヒト膵臓組織からのN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析のためのスピンチップ濃縮戦略

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

2機能チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィー戦略は、同じワークフローでN-糖ペプチドとリンペプチドの両方を濃縮し、同じ分析から生体分子情報を増やすことができます。この濃縮の主な利点は、下流の質量分析分析のために別々の画分中のN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分離を可能にする2つの分離メカニズムです。この濃縮法を用いると、糖尿病や癌などの疾患バイオマーカー発見に向けて、膵臓組織などの複雑な生体試料におけるグリコシル化やリン酸化の検出を向上させることができます。この方法はスピンチップと遠心分離に依存するため、遠心分離速度を制御し、目詰まりを防ぐためにサンプルに微粒子がないことを確認することが重要です。まず、膵臓組織と接触する組織粉砕機の部分、すなわちチャンバー、粉砕機、および回収スプーンを、ヘラとともにポリスチレン容器に予め冷やす。次に、組織片を予め冷却されたサンプルホルダーに移し、凍結されるまで組織に液体窒素を加える。チャンバー内に粉砕機を入れた後、マレットを用いて5~10回叩いて試料を粉砕し、次いで粉砕機をチャンバーから取り出し、付着組織粉末及び片を掻き取る。次に、組織が溶け始めたらスプーン一杯の液体窒素をチャンバーに加え、微粉末が得られるまで粉砕プロセスを繰り返し、サンプルを約100ミリグラムのアリコートに予め冷却されたチューブに分割する。溶解緩衝液を調製した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の各1錠を500マイクロリットルの水に溶解し、所望の最終濃度の20倍のストックに対して、各インヒビターの必要量のストックを溶解バッファーに添加して、最終インヒビター濃度を達成する。チューブに600マイクロリットルの溶解バッファーを加えた後、加熱ブロック内で摂氏95度で800RPMで振とうしながら10分間インキュベートし、次いでサンプルを加熱ブロックから取り出して室温まで冷却する。次に、30秒の休息を挟んだ15秒パルスを使用して、60ワットのエネルギーでサンプルを45秒間超音波処理し、摂氏4度で15分間、3000倍のGでサンプルをペレット化します。上清を沈殿溶媒の5倍の体積に加える。例えば、50%アセトン、49.9%エタノール、および0.1%酢酸を含む1.5ミリリットルの沈殿溶媒に300マイクロリットルの溶解緩衝液を、摂氏80度で一晩冷やす。試料を摂氏4度で15分間、3000倍Gで再度ペレット化し、上清を除去した後、ヘラで割ってペレットを洗浄し、同量の沈殿溶媒と混合する。遠心分離後、試料ペレットをヒュームフード内で15分間風乾し、進行の準備ができるまで摂氏80度で保存する。まず、タンパク質ペレットを、50ミリモルのトリエチルアンモニウム重炭酸緩衝液および8モルの尿素を含む300マイクロリットルの新しく作られた消化緩衝液に再懸濁する。溶液中のタンパク質に、ジチオスレイトールを終濃度5ミリモルに添加し、混合し、室温で1時間減少させた後、ヨードアセトアミドを終濃度15ミリモルで添加する。混合し、暗所で室温で30分間アルキル化した。次に、Lys-C/Trypsin を 1 ~ 100 の酵素対タンパク質比で加え、インキュベーター内で摂氏 37 度で 4 時間インキュベートした後、50 ミリモルのトリエチルアンモニウム重炭酸緩衝液を加えて、使用した 8 モルの尿素を 1 モル未満に希釈します。トリプシンを1〜100の酵素対タンパク質比で添加した後、インキュベーター内で摂氏37度で一晩インキュベートし、続いてトリフルオロ酢酸を添加して消化をクエンチする。開始タンパク質1ミリグラムごとに、1ミリリットルのアセトニトリルで脱塩カートリッジをコンディショニングし、1ミリリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で3回状態にしてから、消化した混合物を脱塩カートリッジにロードし、1ミリリットルの0.1%トリフルオロ酢酸を使用して混合物を3回洗浄する。次に、1ミリリットルの60%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸溶液を用いてペプチドを溶出し、次いで、溶媒が完全に蒸発するまで遠心真空濃縮器を用いて約35°Cでペプチドを乾燥させた。ペプチドを水に再懸濁した後、製造業者のプロトコールに従ってペプチドアッセイを使用してペプチド濃度を推定し、次いでペプチドを500マイクログラムのアリコートに分割し、完全に乾燥させる。約3ミリグラムのコットンウールの重さを量り、空のスピンチップに詰めます。チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィー材料1グラムをチューブに移した後、既知の濃度の材料に0.1%トリフルオロ酢酸を加える。スピンチップに20ミリグラムの材料を移すのに十分なスラリーを加えた後、200マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で遠心分離してスピンチップを洗浄する。サンプルを200マイクロリットルの装填/洗浄溶媒に再懸濁し、スピンチップを流します。ロード/洗浄溶媒で遠心分離によりスピンチップを洗浄した後、200マイクロリットルの80%アセトニトリル0.1ギ酸溶液でスピンチップを洗浄し、次いで200マイクロリットルのE1およびE2でペプチドを溶出し、各溶出を別々に分析する。E3 および E4 溶媒を使用して溶出プロセスを繰り返し、下流分析の前に適切な溶出画分を結合します。塩基性pHで溶出を行う前に、2.5%水酸化アンモニウム中に200マイクロリットルの90%アセトニトリルを使用して材料を3回条件付けし、次いで200マイクロリットルのE5およびE6溶媒でペプチドを溶出し、これらの溶出物を脱水した後、充填チップを使用して別々に分析する。次に、200マイクロリットルの異なる濃度のアセトニトリルおよび水酸化アンモニウムでペプチドを溶出する。その後、これらの溶出液を合わせ、1つのサンプルとして分析し、E7、充填チップを用いて脱塩後。N-グリコシル化ペプチドおよびリン酸化ペプチドから注釈付きの高信頼性MS/MSスペクトルが得られ、前駆体の豊富な断片化により、データベース検索ソフトウェアによって割り当てられた同定の信頼性が向上しました。ペプチド同定は、各溶出画分にわたって二機能チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィースピンチップ法を使用して濃縮されたサンプルから見出された。糖ペプチドの大部分は最初の4つのフラクションで溶出し、リンペプチドの大部分は最後の3つのフラクションで溶出するため、イオン化における潜在的な干渉が軽減されます。デュアルチタン法からのグリコプロテオミクスの結果をエールリッヒ - 糖ペプチドのみの濃縮と比較し、ビニング後の各タイプのグリカンの組成に基づいて6つのカテゴリーに分けた割合が、両方の方法間で類似していることを実証した。デュアルチタン法からのホスホプロテオミクスの結果は、リンペプチドのみの富化または両方の方法を用いた従来の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーと比較した。リン酸化アミノ酸の大部分は、セリンおよびスレオニンとして同定され、約1%のリン酸化チロシンが同定された。スピンチップを適切に構築することは、スムーズな溶出を確実にするために重要です。コットンを先端にしっかりと差し込み、濃縮素材をコットンの上に詰め込むことができます。我々は、ほとんどの組織およびSARS-CoV-2スパイクタンパク質におけるグリコシル化およびリン酸化の同時特性評価に、二重機能チタンIMAC法を使用した。

a-spin-tip-enrichment-strategy-for-simultaneous-analysis-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。...

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本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。...

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。...

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。...

選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

学ぶ、チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィー法を用いてヒト膵臓組織からN-糖ペプチドとリンペプチドを同時濃縮する方法。質量分析による翻訳後修飾の検出向上と糖尿病やがんなどの疾患バイオマーカー発見への応用を確認できます。

ヒト膵臓組織からのN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析のためのスピンチップ濃縮戦略

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