Name: トルトリシダ科害虫の大量飼育と分子研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学ぶトルトリシダ科害虫の大量飼育法と核酸抽出技術。人工飼料を用いた飼育、性別判定、次世代シーケンス用の高品質RNA抽出法を確立し、昆虫学と分子生物学の研究に貢献します。

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著者らは、日本学術振興会特別研究員[助成金番号19J13123および21J00895]からの支援に感謝します。

1. 昆虫の収集と大量飼育
<ol><li>以前に出版された参考文献8,12に続く畑からトルトリシッド昆虫を集める。 注:H. magnanima および A. honmai 幼虫は、損傷した茶葉から収集される(図1A)。成虫は、4Wの携帯用UV光(波長365nm、 材料表、 図1B参照)を用いて誘引される。</li>
	<li>採取した幼虫(図1C、D)を1/2オンスカップに入れた人工飼料片上で、成虫の開墾まで2~3週間、個別に飼育する(図1E、F)。形態学的形質により蛹と成虫の性別を確認する(図1G,I)。</li>
	<li>プラスチック製の箱(30 cm x 20 cm x 5 cm)の中の男性と女性をパラフィン紙の卵塊に嵌合させます(図1J-L)。女性1人と男性2人をパラフィン紙と一緒に120mLのプラスチックカップに入れて、マトリリンを確立します。 注:パラフィン紙にしわを作ることが重要です。H. magnanimaの場合、パラフィン紙はケースの底に貼っておく必要があります。一方、A.ホンマイについては、茶葉の上側にH.マグナニマ産卵卵塊が入るので、ケース天井に紙を貼って卵を集める(図1L)が、A.ホンマイは葉8の下側に卵を産む。手順は他のトルトリシッド種でも検証されており、対象種の生態や行動が明らかにならない場合は、両面に論文を貼った方が良いでしょう。</li>
	<li>はさみでパラフィン紙上の卵塊(卵塊12、 図1Mあたり約100〜200個の卵)を切り取ります。卵をダンプされた紙と一緒に1/2オンスのカップに5〜7日間入れます。 注:成熟した胚は黒ずみのカプセルを呈する(図1N)。胚発生の期間は、トルトリシド種に多様に起因しているが、一般に、 H. magnanima では産卵後5日間、 A. honmai では4 dpoが相対湿度60%、16時間明暗/8時間のサイクルで25°Cで7.</li>
	<li>黒い頭部カプセルを示す卵塊を4〜8°Cで7日間保存する。</li>
	<li>大量飼育用のおろし金を使用して〜60gの人工食をスライスする。成熟した胚で満たされた卵塊をプラスチック容器(23 cm x 16 cm x 8 cm)のスライスした人工飼料の上に置きます。スライスした食事と一緒に卵塊にパラフィン紙を置きます(図10)。 注: 相対湿度が 30% 未満は乾燥しすぎていると見なされ、70% を超えると湿度が高すぎます。プラスチック容器の蓋に穴を開けることは、より良い換気を可能にするためにより良いです。小さな幼虫の脱出を防ぐために、穴を綿で満たしてください。</li>
	<li>卵から表面汚染物質を除去するために、卵塊を3%ホルマリンおよび0.2%塩化ベンザルコニウム溶液にそれぞれ5分間浸す12。腸内細菌や細胞内細菌を根絶するには、通常の人工食の代わりに、塩酸テトラサイクリン0.05%(w/w)またはリファンピシン0.06%(w/w)を添加した人工食を利用してください( 資料表参照)。 メモ: この手順はオプションです。一貫性を保つために、シルクメイト2Sと0.05%(w / w)テトラサイクリン塩酸塩または0.06%(w / w)リファンピシンを均等に混練することが重要です。</li>
	<li>プラスチック容器から蛹を収集し、形態学的12 の特徴に基づいて性別を区別する(図1G-I)。 注:一般的に、トルトリシドは蛹化12まで5〜6個のインスターを呈する。 H. magnanima と A. honmai 幼虫は、孵化後蛹化するまでそれぞれ3週間と2週間かかります。</li>
	<li>15人の男性と10人の女性をプラスチック製の箱(30 cm x 20 cm x 5 cm、 図1K)に入れ、25°C、16 L/8 Dで交配します。各世代のために。 注:その後の分析のために新たに産卵した卵塊を収集する必要がある場合は、暗期の開始と終了(例えば、午前9時から午後5時まで)を設定します。この状態では、 H. magnanima と A. honami は通常5時間後(午後2時)に産卵卵します。</li>
</ol>2.固定、透過処理、染色のための卵塊からの卵およびフェレート幼虫の分離
<ol><li>卵塊を1,000 μLの1.2%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間または1,000 μLの5 M水酸化カリウム水溶液に30分間浸して卵を分離します。</li>
	<li>分離した卵を1,000 μLのPBSt(137 mM NaCl、8.1 mM Na2 HPO4、2.68 mM KCl、1.47 mMKH2 PO4、0.05%のポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート[Tween-20] pH 7.4、材料表を参照)で洗浄し、以前に公表された報告7に従ってください。</li>
	<li>卵を500 μLの100%ヘプタンと500 μLの4%パラホルムアルデヒド-PBSt溶液(w / v)の混合物に浸します。ボルテックスミキサーを用いて1,500rpmで10分間混合する。</li>
	<li>卵を500 μLの100%ヘプタンと500 μLの100%メタノールの混合物に浸します。1,500rpmで10分間混合する。</li>
	<li>卵を1,000 μLの100%メタノールで2回洗浄し、さらなる実験まで100%メタノール中で4°Cで保存する(図2A)。 注:卵は4°Cで少なくとも1年間保存することができます。</li>
	<li>卵を99%、70%、50%エタノール、およびPBStにそれぞれ5分間順次浸し、以前に発表された報告7に続いて親水化を行う。</li>
	<li>卵をPBStで洗浄し、卵を1μg/mLのDAPI溶液に5分間浸漬した後、1x PBSで卵を2回洗浄する。卵を20 μLの1.25%(w/w)乳酸 - 酢酸オルセイン溶液( 材料表を参照)11 に浸して、核が鮮やかな赤色を示すまでヘテロクロマチンを視覚化する(これは5〜60分で変化する)(図2B、C)。 注:乳酸 - 酢酸オルセイン染色期間は、温度および湿度に依存する。4x-10倍の倍率の顕微鏡を使用して適切な染色を確認することをお勧めします。</li>
	<li>染色した卵をピペットを用いてスライドガラスに移す。染色した卵を退色防止試薬( 材料表参照)で囲み、カバーガラス7とする。</li>
	<li>鉗子を用いて卵塊からファレート H. magnanima および A. honmai 幼虫(産卵後4〜5日(dpo))を抽出する(図2D)。スライドガラス上の幼虫を二等分する(図2E)。</li>
	<li>任意の組織(例えば、食道下神経節、胸部神経節、マルピギ尿細管など)を1:3(v/v)99.7%酢酸/100%メタノールの混合物で5分間固定する。核が染色されるまで、1.25%(w / w)乳酸 - 酢酸オルセイン溶液11 でそれらを染色する(これは、温度および湿度に応じて5〜60分かかることがある)。</li>
	<li>ヘテロクロマチン(W染色体、 図2F、G)の有無(雌)または非存在(雄)を顕微鏡で観察することにより各検体の性を求めた。 注:性別は、性クロマチンを視覚化することによって決定される。各細胞は、雌11、12において性クロマチンをドットとして表し、一方、相長幼虫組織の残りの部分(固定されていない)は、直ちに細胞溶解緩衝液12(10mM Tris-HCl、100mM EDTA、および1% SDS、pH 8.0)またはDNAまたはRNA抽出のためのフェノール含有RNA抽出試薬に浸漬すべきである。解剖の前に、20 μLの試薬を事前に0.2 mL PCRチューブに分注してください(図3A)。サンプルを浸漬し、さらに抽出するまで-80°Cで保存する。サンプルは少なくとも3ヶ月間保存することができますが、核酸の分解を防ぐために下流の実験を進める方が良いです。</li>
</ol>3. 性決定されたファレート幼虫からのDNAおよびRNA抽出
<ol><li>性決定された雄または雌のファレート幼虫(5dpo胚)を12個プールし、細胞溶解緩衝液またはRNA抽出試薬(ステップ2.11および 材料表を参照)のいずれかを1本の1.5mLチューブに加える。 注: DNA 抽出の場合は手順 3.2 ~ 3.7、RNA 抽出の場合は手順 3.8 ~ 3.11 に従います。</li>
	<li>600 μL の細胞溶解バッファー (10 mM Tris-HCl、100 mM EDTA、および 1% SDS、pH 8.0) で組織を均質化し、サンプルを 10,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。</li>
	<li>ピペットを使用して上清(500 μL)を回収し、1.5 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL、 材料表を参照)とともに50°Cでヒートブロック上で5時間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを 1.0 μL の 10 mg/mL の RNase 溶液 ( 材料表を参照) で 37 °C で 30 分間処理します。</li>
	<li>200 μLのタンパク質沈殿溶液( 材料表を参照)をチューブ7に加え、続いて17,000 x g で遠心分離機で4°Cで10分間行った。</li>
	<li>上清(500 μL)を500 μLの100%イソプロパノールと混合し、20,400 x g で4°Cで10分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレット化したDNAを1,000 μLの70%エタノールで2回洗浄する。次いで、風乾(室温で5〜10分間)し、DNAを30 μLの10 mM Tris-Cl緩衝液(pH 8.5)に溶解する。</li>
	<li>600 μLのRNA抽出試薬で組織を均質化し、240 μLの超純粋な蒸留水をチューブに加えます。チューブを 12,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。</li>
	<li>上清(600 μL)を600 μLの100%イソプロパノールと混合し、混合物をシリカスピンカラムに移す( 材料表を参照)。チューブを 17,900 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。</li>
	<li>カラムを750 μLの70%エタノールで洗浄し、カラムを17,900 x g で2回、4°Cでそれぞれ1分間遠心分離した。</li>
	<li>15 μL の超高純度蒸留水をカラムにロードします。チューブを 17,900 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離し、RNA を溶出します。</li>
	<li>UVベースの分光光度計を使用してDNAとRNAの品質と量を計算し、検証します。A260/A280(核酸/タンパク質)およびA260/A230(核酸/塩およびその他の汚染物質)比13を使用して核酸の純度を評価します。 注:RNA抽出については、以前に公表された手順12 に従い、フェノール汚染をもたらした(表1)。単一の胚またはフェレート幼虫から抽出されたDNAおよびRNAは、低量および低品質のサンプルを生成する。典型的には、12個のファレート幼虫からのDNA抽出は100〜600ngを生じるが、現在の方法を用いたRNA抽出は、 表1に示すように900〜1,500ngを生成する。 注: ステップ 3.13 ~ 3.15 は、ハイスループットシーケンシングのさらなるアッセイではオプションです。</li>
	<li>蛍光ベースの分光光度計を使用してDNAおよびRNAの量を計算する。 注:RNA量の比(UVベースの濃度(ng/μL)/蛍光ベースの濃度(ng/μL))を計算し、さらなる実験適用のための品質を評価した。たとえば、UV および蛍光ベースの濃度がそれぞれ 80 ng/uL および 60 ng/uL の場合、その比は 1.5 (80/60) になります。通常、1.5未満の比は、ハイスループットシーケンシング13を使用する下流アプリケーションに対して十分な純度を示します。</li>
	<li>マイクロチップ電気泳動を用いてRNAの品質を分析する14.</li>
	<li>修飾されたRNAを利用して、RNAライブラリー調製キットを使用してRNAライブラリーを調製する( 材料表を参照)。準備されたライブラリに適したプラットフォームを用いてライブラリを配列決定する。</li>
</ol>

<ol><li>Gaston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+magnitude+of+global+insect+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Biology%22%5BJournal%5D)">The magnitude of global insect species richness.</a> Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).</li>
<li>Pogue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+world+revision+of+the+genus+Spodoptera+Guen%C3%A9e+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+the+American+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).</li>
<li>Matsuura, H., Naito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+cold-hardiness+and+overwintering+of+Spodoptera+litura+F.+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+VI.+Possible+overwintering+areas+predicted+from+meteorological+data+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).</li>
<li>Mita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+an+EST+database+for+Bombyx+mori+and+its+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The construction of an EST database for Bombyx mori and its application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).</li>
<li>Kawamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assembly+of+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).</li>
<li>Fukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+masculinizing+function+of+the+Ostrinia+furnacalis+Masculinizer+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).</li>
<li>Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+disperse+eggs+from+lepidopteran+scale-like+egg+masses+and+to+observe+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomological+Science%22%5BJournal%5D)">A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis.</a> Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).</li>
<li>vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Geest%2C+LP+%22Tortricid+pests%3A+their+biology%2C+natural+enemies+and+control%22">Tortricid pests: their biology, natural enemies and control</a>. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).</li>
<li>Kiuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+female-specific+piRNA+is+the+primary+determiner+of+sex+in+the+silkworm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm.</a> Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Kageyama, D., Traut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+sex-specific+effects+of+Wolbachia+and+interference+with+the+sex+determination+of+its+host+Ostrinia+scapulalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis.</a> Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).</li>
<li>Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+male-killing+and+nonmale-killing+Wolbachia+strains+in+the+oriental+tea+tortrix+Homona+magnanima%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima.</a> Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).</li>
<li>Schalamun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+MinION%3A+An+example+of+how+to+establish+long-read+sequencing+in+a+laboratory+using+challenging+plant+tissue+from+Eucalyptus+pauciflora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora.</a> Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).</li>
<li>Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inbreeding+in+Mimulus+guttatus+on+tolerance+to+herbivory+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments.</a> Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).</li>
<li>Saccheri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+and+extinction+in+a+butterfly+metapopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation.</a> Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).</li>
<li>Crnokrak, P., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+depression+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Inbreeding depression in the wild.</a> Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).</li>
<li>Keller, L. F., Waller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+effects+in+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Inbreeding effects in wild populations.</a> Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li>
<li>Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-killing+Wolbachia+carries+a+feminizing+factor+and+is+associated+with+degradation+of+the+sex-determining+system+of+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host.</a> Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

トルトリシドは、いくつかの農業および林業害虫を含む。本研究では、何世代にもわたってトルトリックスを飼育し、昆虫の胚発生と性別を観察し、成熟した胚を用いて分子解析を行う方法を提示した。
害虫昆虫研究の障害の一つは、飼育方法を確立することである。特に、近親交配は時々種の適応度に悪影響を及ぼすことがあります。近親交配による適応度低下は、近親交配うつ病と呼ばれ、昆虫15、16、17、18を含む様々な動植物において広く観察されている。前述のように、H. magnanimaとA. honmaiはどちらも100世代以上(10年以上)維持されており、明らかなフィットネスコストはありません。他のトルトリシドも一般的に近親交配に対して高い耐性を有するかどうかを評価するだけでは不十分であるが、2つの種は単調な環境条...

鱗翅目昆虫は、記載されたすべての生物種1の10%以上を占め、特定の分類群種は植物に深刻な被害および深刻な農業損失を引き起こす2,3。カイコBombyx mori4,5などのモデル昆虫を用いて分子的および遺伝的研究が開発されているが、害虫昆虫は、飼育および取り扱いの困難さもあって、未調査のままである6,7。したがって、そのような非モデル害虫昆虫の生物学を理解するためには、基本的な研究および技術が必要である。
一般的にトルトリックスまたはリーフローラーの蛾として知られているトルトリシダ科(鱗翅目)は、多くの農業および林業害虫8を含む。昆虫分類群のうち、オリエンタル・ティー・トルトリックス・ ホモナ・マグナニマ ・ディアコノフとサマーフルーツ・トルトリックス・ アドキソフィエス・ホンマイ・ ヤスダは、東アジアのティーツリーにダメージを与えることが知られている深刻な多食性害虫です7。2つの種は、母親の分泌物で覆われた薄くて柔らかく壊れやすい卵からなる平らで楕円形の鱗片のような卵塊(または卵塊)を産む。胚発生段階は昆虫の発生と性決定9にとって極めて重要であるが、卵の構造は昆虫の生物学を理解するのを妨げるさらなる分析を妨げる。このような複雑な卵塊を産卵させる害虫に関するさらなる研究のための困難を克服することが重要である。
ここでは、トルトリシドの生物学を理解するために、 A. honmai と H. magnanimaを用いて、大量飼育、観察、および分子研究のための方法が開発されている。第一に、大量飼育方法は、近親交配によって100世代にわたって両方のトルトリシッドを維持する。連結された鱗片状の卵塊から卵を分離することは、ハエ10で用いられる技術から以前に開発されたアルカリ性および有機溶媒を用いたトルトリシドの胚発生観察を容易にした。また、本研究は、乳酸酢酸オルセインを用いた鱗翅目雌の性クロマチンの染色法の開発により、小胚の性差別を確立した11。これらの方法を組み合わせることにより、性決定された胚から高品質および量の核酸が抽出されたが、そうでなければ確立することは困難であった6。抽出したRNAを次世代シーケンシングに利用しました。集合的に、ここで提示された方法は、他の鱗翅目昆虫および他の昆虫分類群に適用される。

<table><tbody><tr><td>1/2オンスカップ</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>昆虫飼育; https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr> <tr><td>1/2オンス カップフタ</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>昆虫飼育;</td></tr><tr><td>https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether 99.7% 酢酸</td><td>富士フイルム和光ケミカルズ株式会社, 大阪, 日本</td><td>36289</td><td>固定; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>not shown</td><td>核酸定量; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>塩化ベンザルコニウム溶液</td><td>日本薬品工業株式会社</td><td>No.4987123116046</td><td>滅菌; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>綿</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>昆虫飼育; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>DAPI溶液</td><td>同人堂, 東京, 日本</td><td>340-07971</td><td>染色;https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr> <tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>富士フイルム和光ケミカルズ(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>dsDNA HS 定量キット</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Nucleic acids 定量; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>Econospin RNA II カラム</td><td>エポックライフサイエンス</td><td>EP-11201</td><td>RNA抽出; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>富士フイルム和光化学工業</td><td>4.98748E+12</td><td>固定; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸 四ナトリウム塩四水和物 (4NA)</td><td>富士フイルム和光化成工業</td><td>4.98748E+12</td><td>細胞溶解バッファー (EDTA);</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html グラシン紙</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>昆虫飼育; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp; utm_medium=cpc&utm_source= Adw</td></tr><tr><td>heat block WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokyo, Japan</td><td>4002620</td><td>incubation; https://www.attoeng.site/</td></tr> <tr><td>heptane</td><td>富士フイルム和光化学工業 (大阪)</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>not shown</td><td>人工食;https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>富士フイルム和光化学</td>工業<td>4.98748E+12</td><td>核酸抽出 https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>富士フイルム和光ケミカルズ(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>染色; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>富士フイルム和光化成 (株)</td><td>4.98748E+12</td><td>固定; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500 ボルテック</td><td>ス バイオサン</td><td>BS-010210-TAK</td><td>ボルテックスミキサー; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>ナノフォトメーター NP 80</td><td>インプリメン</td><td>示されていません</td><td>核酸 定量; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr> <tr><td>ナチュラルパックワイド</td><td>イノマタ化学</td><td>1859</td><td>昆虫飼育; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>Library preparation;</td></tr><tr><td>https://www.nebj.jp/products/detail/2039 orcein</td><td>富士フイルム和光化学工業</td><td>4.98748E+12</td><td>染色; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>富士フイルム和光化成(株)</td><td>160-16061</td><td>固定</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html ポリオキシエチレン(20) モノラウリン酸ソルビタン</td><td>富士フイルム和光化成(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan</td><td>非表示</td><td>昆虫コレクション; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>富士フイルム和光化成品</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>富士フイルム和光ケミカルズ(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止封入剤</td><td>Invitrogen, MA, USA</td><td>P36965</td><td>退色防止; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>タンパク質沈殿液</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>DNA 抽出; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238</td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>富士フイルム和光化成工業株式会社, 大阪府, 日本</td><td>4.98748E+12</td><td>滅菌; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html</td></tr><tr><td>RNA HS 定量キット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852</td></tr><tr><td>RNase solution</td><td>Nippon Gene</td><td>313-01461</td><td>RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>not shown</td><td>人工食; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>富士フイルム和光化学工業(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>富士フイルム和光化成(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>細胞溶解緩衝液(SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html 次</td></tr><tr><td>亜塩素酸ナトリウム水溶液</td><td>富士フイルム和光化学工業</td><td>4.98748E+12</td><td>卵子分離;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html テトラサイクリン塩酸塩</td><td>富士フイルム和光化学工業 大阪府</td><td>4.98748E+12</td><td>殺菌;https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>富士フイルム和光化学工業(株)</td><td>4.98748E+12</td><td>Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>ultra-pure distilled water</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td></tr></tbody></table>

トルトリシダ科害虫の大量飼育と分子研究

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

一般的にトルトリックスまたはリーフローラーの蛾として知られているトルトリシダ科(鱗翅目)は、深刻な農業損失を引き起こす多くの農業および林業害虫を含む。このような害虫の蛾の生物学を理解するために、基本的な技術が強く求められている。ここでは、2つの茶癇翅目、 ホモナ・マグナニマ と アドキソフィエス・ホンマイ (鱗翅目:トルトリシダ科)を用いて、大量飼育、観察、および分子研究のための方法が開発されている。昆虫はスライスした人工食で大量飼育され、その生物学的特性を考慮して100世代以上にわたって近親交配によって維持された。昆虫には様々な性二型性があります。したがって、その後のアッセイを妨げている発達段階における性別を区別することは困難である。今回の研究は、トルトリシッド幼虫の性別は、精巣を観察するか、または乳酸酢酸オルセイン染色を観察することによって決定し、女性特異的W染色体を視覚化することによって決定できることを強調した。さらに、本研究では、性決定法を用いて、性決定胚からの核酸抽出とハイスループットシーケンシングへの応用を可能にした。これらのヒントは、他の害虫の昆虫にも適用可能であり、さらなる形態学的および遺伝的研究を容易にする。

ホスト回線の整備と維持管理 野外で採集された幼虫の生存率は、圃場の場所、季節、および飼育条件(例えば、台湾、桃園における生存率の90%、新井ら12に示されているように)に異なる原因がある。ペアの約30%〜50%が、通常どおり次世代を生み出します。 H. magnanima と A. honmaiにとって、母系は100世代以上にわたって近親交配によって維持されてきました。
形態学的観察と性決定 水酸化カリウム(3または5M KOH)または次亜塩素酸ナトリウム(1.2%Cl2 またはNaClO)のいずれかによる処理により、連結された卵塊から卵が分離されます(図2A)。試薬の濃度が低いと分離を達成できなかった。すべての固定、透過処理、および染色ステップにより、DAPI溶液による核の可視化が可能になりました。KOHまたはNaClOのみで処理(分離)...

本議定書は、実験室におけるトルトリシッド害虫昆虫の飼育方法を記載する。昆虫の性別を区別し、ハイスループットシーケンシングのために核酸を抽出する手順は、2つのトルトリシッド害虫を使用して確立されています。

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

我々は、彼らの生物学を研究するために、深刻な害虫Tortrix塊を用いた大量飼育、観察および分子研究のための基本的、しかし非常に需要の高い大衆を提示する。これまでのところ、昆虫の卵の構造はさらなる分析を妨げている。特に、母体分泌物で覆われた薄くて柔らかく壊れやすい卵の研究を可能にしました。トートリックスのさらなる研究、他の昆虫や他の分類群の試みに応用できると予想される簡単な技術があります。まず、女性1人と男性2人をパラフィン紙と一緒に120ミリリットルのプラスチックカップに入れて、マトララインを確立します。大量飼育用のおろし金を使って約60グラムの人工食をスライスします。成熟した胚で満たされた卵塊をプラスチック容器内のスライスされた人工飼料の上に置く。スライスした食事と一緒に卵塊にパラフィン紙を置きます。15人の男性と10人の女性を25°Cで交配するためのプラスチック製の箱に入れます。5〜7日ごとに卵を集め、世代ごとに大量飼育ステップを繰り返します。卵塊を1000マイクロリットルの1.2%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間または1000マイクロリットルの5モル水酸化カリウム水溶液に30分間浸して卵を分離する。分離した卵を1000マイクロリットルのPBStで洗浄する。500マイクロリットルの100%ヘプタンおよび500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドPBSt溶液の重量混合物に卵を浸す。ボルテックスミキサーを用いて毎分1500回転で10分間混合する。卵を500マイクロリットルの100%ヘプタンと500マイクロリットルの100%メタノールの混合物に浸す。毎分1500回転で10分間混合する。卵を1000マイクロリットルの100%メタノールで2回洗い、100%メタノールで摂氏4度で保存します。卵を99%70%および50%エタノールおよびPBStにそれぞれ5分間順次浸して親水化させる。卵をPBStで洗う.卵を1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPI溶液に5分間浸してから、PBSで卵を2回洗う。卵を20マイクロリットルの1.25%乳酸、酢酸またはCN溶液に浸し、核が鮮やかな赤色を示すまでヘテロクロマチンを視覚化する。染色した卵をピペットでスライドガラスに移し、退色防止試薬とカバーガラスで封入した。鉗子を使用して卵塊からフェラーテ、アモマグネタマおよびアドキソフィエスホンマイ幼虫を抽出する。スライドガラス上の幼虫を解剖する。100%メタノール中の1〜3個の99.7%禁欲酸の混合物で5分間組織を固定する。核が染色されるまで、1.25重量%重量%の乳酸溶液、禁欲溶液、またはCN溶液で染色する。顕微鏡下で女性のヘテロクロマチンの存在または男性の不在を観察することによって、各標本の性別を決定する。性決定されたフェレート幼虫からDNAおよびRNAを抽出するには、性別

mass-rearing-and-molecular-studies-in-tortricidae-pest-insects

Research

JoVE Journal

Environment

環境

RIDL®(優勢致死性を持つ昆虫の放出)システムを用いてAedes...

ブラジルにおけるフィールドリリースのための遺伝子組み換え Aedes aegypti の大量生産

植物害虫の相互作用の研究のために必要とされる効率的なハダニの均質な試料の調製、実験的な植物の侵入、および植物の損傷の評価のためのプロトコルが、開発された。...

ナミハダニダニの適用<em&gt;ナミハダニ</em&gt;植物の害虫相互作用研究のための

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。...

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

生命表、昆虫の個体数のソースの定量化と死亡率との理解、予測、生態系の動態を操作します。導電性付着の未熟なライフ...

フィールドを使用してでコナジラミ、タバココナジラミ、モデル システムとして綿の付着の昆虫のための生命表の開発のための方法論

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CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

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昆虫農業と無脊椎動物の生理学のための汎用性の高いオルソプテランモデルである Gryllus bimaculatusの実験室培養の維持

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野生型雌性昆虫における卵巣発生の解剖と等級分け

ここでは、森林のウッドボーラーから昆虫病原性真菌を取得するためのプロトコルと、鞘翅目モデル昆虫を使用してそれらの昆虫病原性活性を評価するための代替方法を示します。この方法は、自然林の木材を退屈する害虫から昆虫病原性真菌資源を探索するのに効率的で便利です。...

森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

学ぶトルトリシダ科害虫の大量飼育法と核酸抽出技術。人工飼料を用いた飼育、性別判定、次世代シーケンス用の高品質RNA抽出法を確立し、昆虫学と分子生物学の研究に貢献します。

トルトリシダ科害虫の大量飼育と分子研究

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