ハイスループット極低温電子顕微鏡のための厚さ制御されたマイクロパターンチップの作製
April 21st, 2022
酸化グラフェン窓を備えたマイクロパターンチップを新たに開発し、マイクロエレクトロメカニカルシステム技術を適用して製造し、さまざまな生体分子やナノ材料の効率的で高スループットな極低温電子顕微鏡イメージングを可能にします。
このプロトコルは、クライオEMを用いて異なるサイズのタンパク質やナノ材料をうまく観察するために、ナノスケールで画像サイズの厚さを調整するために重要です。Memの製造技術は、マイクロチップの大量生産を可能にします。また、マイクロパターンウェルの深さと設計の選択も可能です。実験目的に応じて。
この技術は、市販の創薬に利用される生体分子のハイスループット3D構造解析の効率向上に貢献する可能性があり、シリコンニトロ膜のリスク傾向のある薄いウェーハやマイクロチップは扱いにくい場合があります。ウェーハを曲げたり、硝酸シリコンウィンドウに垂直な力を加えたりしないことが重要です。窒化シリコン蒸着シリコンウェーハをヘキサメチルジシラザン溶液で覆い、スピンコーダー上で3000 RPMで30秒間スピンコーティングすることにより、フォトレジストまたはPRを開始します。
コーティングされたウェーハを摂氏95度でホットプレートで30秒間焼き、水面を疎水性にし、PRで良好なコーティング性能を確保します。次に、ウェーハにポジティブPRをスピンコートし、摂氏100度で90秒間焼きます。スピンコートPRの厚さは500ナノメートルです。PRコーティングされたウェーハをアライナーを使用してクロムマスクを通して紫外線に5秒間さらします。
現像液を用いて1分間PRを現像し、ウェーハをイオン交換水に浸して2回すすぎます。その後、水面に窒素ガスを吹き付けてPRパターンウェーハを乾燥させます。PRのパターン化に従います。ラボで構築された反応性イオンエッチャーを無線周波数電力50ワットで使用し、六フッ化硫黄ガスを毎分3標準立方センチメートルで使用します。
露出した窒化ケイ素を毎秒6オングストロームの速度でエッチングする。窒化ケイ素パターンウェーハをアセトンに室温で30分間浸漬することにより、PRを排除します。続いて、ウェーハをイオン交換水で2回リンスし、ウェーハを窒素ガスで乾燥させた。
露出したsiをエッチングするには、新たに調製した水酸化カリウム溶液に窒化シリコンパターンウェーハを浸漬する。自立型窒化ケイ素窓まで連続的に攪拌しながら、パターン化されたウェーハの反対側に観察することができる。エッチングされたウェーハを脱イオン水浴に数回浸して洗浄します。
次に、ウェーハを空気中で乾燥させます。エッチング残渣をなくすには、チップアレイの境界をピンセットで軽く押して、マイクロパターニングするチップのアレイを取得します。次に、チップアレイを新しく調製した水酸化カリウム溶液に30秒間浸漬した後、2回すすぎ、チップに窒素ガスを吹き付け、空気中で1時間乾燥させます。
固体支持体については、前に示したように、スピンコーティングを施したブランクの525マイクロメートルシリコンウェーハを準備します。ウェーハを焼成する前にシリコンウェーハ上にチッパー光線を取り付け、前述の手順に従って、マイクロパターンシリコンウェーハを得た。パターンチップセットを1つのメチル2つの純粋なリタノール溶液に摂氏60度で一晩浸漬することによりPRを排除します。
翌日、チップセットを脱イオン水で2回すすぎます。パターンチップセットを窒素乾燥後、反応性イオンエッチャーで150ワットの無線周波数電力で1分間、毎分100標準立方センチメートルの酸素ガスを使用する酸素プラズマプロセスでPR残留物を除去します。その後、マイクロパターンチップを水酸化カリウム溶液に30秒間浸して、PR残留物を完全に除去します。
次に、チップセットをすすぎ、完全に乾かします。1ミリリットルあたり2ミリグラムの酸化グラフェンまたは溶液を脱イオン水で10倍に希釈し、希釈溶液を10分間超音波処理してシートの凝集体を破壊する。その後、希釈液を室温で30秒間Gの300倍で遠心分離する。
1500万アンペアのグローディスチャージャーを使用して、マイクロパターンチップのシリコンエッチング側を1分間グロー放電し、チップの表面を正電荷でレンダリングします。完了したら、3マイクロリットルの溶液をマイクロパターンチップのグロー放電側にドロップします。1分後、チップ上の余分な溶液をろ紙で拭き取ります。
転写したチップをパラフィンフィルム上の脱イオン水滴で洗浄し、余分なチップを濾紙で吸い取ります。ドロップキャスト手順を転送側で2回、反対側で1回繰り返します。移したチップを室温で一晩乾燥させます。
フォトリソグラフィ手順の間、マイクロパターンチップの設計は、クロムマスクの異なる設計を使用して操作された。自立型窒化ケイ素膜の数と寸法が制御されました。作製されたマイクロパターンチップは、最大25, 000個の吊り下げ穴を有することができることが観察された。
窓のラーメンスペクトルは、 さらに、多重配向六方晶屈折パターンは、窓が多層からなることを示し、窓付きマイクロホールの構造と深さを走査型電子顕微鏡と原子間力顕微鏡で調べました。窓付きマイクロホールのウェル型構造を画像に観察し、窓付きマイクロパターンチップの設計の可能性を確認しました。マイクロパターンチップの助けを借りて、いくつかの生物学的標本と無機ナノ粒子をクライオ電子顕微鏡で画像化しました。
パターンの大きさやデザインに応じて、強度を利用した純粋な膜厚やマイクロパターニングの現像時間などの条件を最適化することが重要です。FIBやリソグラフェンなどのナノパターンを適用することにより、いくつかのマイクロメートルパターンを生成することができ、他の分析技術で使用されるこのマイクロデバイスのアプリケーションを拡大する可能性があります。
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概要
グラフェン酸化物ウィンドウを備えた新たに開発されたマイクロパターンチップにより、生体分子やナノ材料の冷凍電子顕微鏡イメージングが向上します。この技術により、ナノスケールでの効率的かつ高スループットの分析が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- ナノテクノロジー
背景
- このプロトコルはナノスケールでの画像の厚さを制御します。
- MEMS製造技術によってマイクロチップの大量生産が可能になります。
- マイクロパターンウェルのデザインは特定の実験目的に合わせて調整できます。
- 生体分子の3D構造分析の効率を向上させます。
研究の目的
- 生体分子の高スループットイメージングを改善すること。
- タンパク質やナノ材料のより良い観察を可能にすること。
- 商業的な創薬研究を支援すること。
使用された方法
- MEMS技術を用いたマイクロパターンチップの製造。
- フォトレジストパターン化のためのヘキサメチルジシラザン溶液の適用。
- 3000 RPMでのシリコンウェーハのスピンコーティング。
- 損傷を避けるためのシリコンナトリドウィンドウの慎重な取り扱い。
主な結果
- グラフェン酸化物を持つマイクロパターンチップの成功的な製造。
- 高スループットイメージングの能力の実証。
- ナノスケールでの生体分子の観察の向上。
- 創薬および生体分子分析における潜在的な応用。
結論
- 開発されたマイクロパターンチップはイメージングの効率を大幅に向上させます。
- MEMS技術により、先進的なイメージングツールのスケーラブルな生産が可能になります。
- この技術は神経科学およびバイオテクノロジー研究に広範な影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is increasingly critical for structural biology and early-stage drug discovery, yet sample preparation bottlenecks limit its predictive value and scalability. The described micro-patterned chip with controlled ice thickness and graphene oxide windows directly addresses these challenges by enabling reproducible, nanoscale sample environments for diverse biomolecules and nanomaterials. This innovation enhances structural data quality and throughput, supporting more confident target validation and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise structural interrogation of biomolecular targets under controlled conditions.
- Reduces ambiguity in target conformation and complex assembly for mechanistic de-risking.
- Supports predictive confidence in structure-based drug design and target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized, reproducible cryo-EM samples for downstream analysis.
- Improves assay reliability by controlling ice thickness and biomolecule localization.
- Enables scalable, high-throughput imaging workflows for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling imaging of both biological and inorganic nanomaterials.
- Aligns structural data with translational biomarker development when relevant.
- Provides risk-adjusted advancement by improving data quality for candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This chip fabrication method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust platform for structural analysis, from early target validation through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution structural data.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of biomolecular states.
- Analytics: Supports statistical comparison of sample conditions through controlled micro-patterning and ice thickness.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical imaging needs for both biological and inorganic targets.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, mass-producible chip platform adaptable to evolving R&D requirements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in MEMS fabrication, photolithography, and cryo-EM sample handling.
- Demands access to specialized instrumentation for etching, coating, and imaging.
- Necessitates cross-team standardization of chip design and sample preparation protocols.
- Adaptable to various biomolecule sizes and experimental designs through mask customization.
- Careful handling is essential to avoid wafer damage and ensure membrane integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
Pattern the Photoresist and Silicon Nitride‐Deposited Si Wafer (SixNy)
2:31
Etching the Si and Eliminating the KOH Etching Residues
3:21
Prepare the Micro‐Patterned SixNy and Eliminate the PR
4:25
Transfer Graphene Oxide (GO) by the Drop‐Casting Method
5:30
Results: Analysis of the Micro‐Patterned Chip with GO Windows
6:35
Conclusion
