液体-ソフトマター相互作用観察のための光誘起 In situ 透過型電子顕微鏡

このプロトコルは、液体細胞TEMと光照明の組み合わせを使用して、光照射時に光増感剤でカプセル化された細菌の構造変化を観察する方法を示しています。この手法の主な利点は、その単純さです。このプロトコルは、困難なサンプル調製を必要とせず、光増感剤溶液で細菌を十分にカプセル化します。

まず、対物レンズ上部の顕微鏡カラムに光ファイバーを接続して、透過型電子顕微鏡を変更します。対物レンズとコンデンサーレンズの間に数センチのスペースを確保し、さらにアクセサリー用の空きスロットを確保します。アモルファスカーボンで覆われた2つの未処理のTEMグリッドを2つの交差したピンセットの間に置き、カーボンコーティングされた側を上に向けて配置します。

グリッドをできるだけ端に近づけます。グリッドの1つに4マイクロリットルのバクテリア溶液を置きます。サンプルの光学密度は5〜10の範囲でなければなりません。

60秒待ってから、ろ紙を使用して液体を慎重に吸い取ります。プロセス中は、グリッド表面全体に液体を広げてみてください。同じグリッドに4マイクロリットルの光増感剤を置きます。

5秒後、液体を吸い取ります。基板上に非常に薄い液体の層を残します。乾いたグリッドを液体で覆われたものの上にすばやく置きます。

上のグリッドを2番目のグリッドの端にそっと移動し、ピンセットを使用して端の基板を絞ります。慎重に絞りを繰り返します。ピンセットの間に液体セルを1分間放置します。

試料作製が終了した直後にサンプルをTEMホルダーに挿入します。サンプルを顕微鏡に挿入した後、低倍率モードで観察を開始し、適切な観察領域を見つけます。観測中は、電子線量をできるだけ低く保ってください。

露光時間を拡大します。液体に囲まれた細胞を適切な倍率で長時間露光して見つけ、最初の画像をすぐにキャプチャします。電子線量を一定に保ち、30秒ごとに画像を収集して変化を観察します。

画像を注意深く調べ、細胞内の最初の目に見える変化に対応する総電子線量を計算します。実験を開始する前に、電流値を調整してレーザー光の強度を設定してください。サンプルを顕微鏡に挿入し、観察領域を見つけます。

サンプルの照射を開始する前に細胞の最初の画像をキャプチャし、ビームブランカーを使用して電子ビームをオフにして、電子照射の影響を回避します。レーザーをオンにします。レーザー光は比較的強度が高いため、短い照明時間から始めます。

その後、光源をオフにします。ビームブランカーをオフにして、すぐに画像をキャプチャします。可能であれば、自動アルゴリズムを使用して、画像の撮影に必要な時間だけサンプルを公開します。

電子照射時間を慎重に測定して、イメージングに使用する電子線量を算出します。1分後の光増感剤の軽い放射線によって発生する活性酸素種によって引き起こされる細胞の外層の顕著な劣化が観察される。さらに光の照明により、変化がより見やすくなりました。

十分な液体を含む適切な観察スポットは、これらの領域が暗くぼやけて見えるため、低倍率で簡単に見つけることができます。液体で覆われたバクテリアは乾燥したバクテリアよりも見えにくいですが、それでも区別することができます。イメージング中に液体の境界を確認すると便利であり、その動きを簡単に検出できるため、選択した領域が不適切で不安定である可能性があることを意味します。

観察中の別の問題は、細菌の周囲の領域を含むサンプルのランダムな領域で発生する可能性のある水の蒸発と溶液の沈殿です。細菌の封入は、グラフェンおよび硝酸ケイ素膜を用いて行うこともできる。サンプル調製はより困難ですが、液体セルの安定性は向上します。

本手法は、液体上での光誘起反応の観察に用いることができる。例えば、金属材料、光誘起触媒、光化学反応に対する光の影響。