Name: 三次元オルガノイド 培養を用いたヒト 膠芽腫細胞の多様性の維持 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学ぶ三次元オルガノイド培養法によるヒト膠芽腫細胞の多様性維持技術。ラミニン豊富な細胞外マトリックスを用いて腫瘍微小環境を再現し、薬剤効果と耐性機構を研究する有力モデルを構築します。

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ジャスティン・ラティア博士の貴重なアドバイスと継続的なサポートに感謝します。また、カトリーナ・ファイフ、リサ・ウォレス、マヤ・カムヒの優れた技術サポートにも感謝します。

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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
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著者は開示する矛盾はありません。

GBMオルガノイドは、細胞および微小環境の不均一性が大きい従来のスフェアを補完する培養方法です4,22,30。より多くの時間とリソースを大量に消費しますが、オルガノイド培養は、腫瘍内挙動と薬剤耐性のメカニズムに関する貴重な洞察を提供することができます。
GBMはCSCの集団によって推進されています5,31、そしてこれらの方法はこのCSC集団の継続的な成長と自己複製を可能にするために開発されました。上皮成長因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)は、幹細胞の維持および増殖を促進し、活性受容体チロシンキナーゼ(RTK)シグナル伝達を提供することが知られている。GBM腫瘍内の不均一な細胞集団および明確な腫瘍微小環境の形成は、CSC挙動のサポートに依存している。lrECMの選択は、ラミニンが豊富な脳環境を模倣し、オルガノイド培養中の細胞が自己組織化し、浸潤によって移動することをサポートします。一部のグループは、lrECMまたはEGF/FGF濃縮培地を使用せずにオルガノイド培養を確立していますが24,28、これは、この培養方法のより時間効率の良い方法と、増殖を促進する発癌性シグナル伝達のより強力な選択を提供する可能性がありますが、これらの方法は、オルガノイドの細胞不均一性を最もよく確立するためにプロ幹細胞環境を最適化するために選択されました。脳オルガノイドおよびGBMオルガノイドの両方が、以前の文献21、32、33においてlrECMを用いて作製されている。オルガノイド内に見られる腫瘍集団と空間的変動に関するデータは確立されていますが、オルガノイド内の非腫瘍集団と、それらが元の患者標本からどのくらいの期間生存するかについてはあまり知られていません。特定のIHC染色(CD45など)がこのデータを提供する可能性があり、オルガノイドを用いた将来の興味深い研究ポイントになる可能性があります。
オルガノイド培養の用途を知ることは、適切な方法を選択するために重要です。一次標本からオルガノイドを確立する方法と、特定の実験のために均一なオルガノイドを成長させるには、手順がわずかに異なります。オルガノイドがどのように成熟し、lrECM足場を視覚的に満たすかを理解することは、オルガノイド培養に適切な時間とリソースを割り当てることができるようにするために重要です。オルガノイド内の細胞のまばらな領域は、ゆっくりと拡大し、lrECMを満たすために成長し、標本の挙動に応じて2〜8週間かかる場合があります。この成長率は、各標本にいくらか固有のものです。オルガノイドの異なるバッチにわたって保存され、球の成長の相対速度とほぼ一致しています。オルガノイドは1年以上維持でき、マウスへの異種移植片で腫瘍形成能力を保持します。ただし、ラボのリソース(材料と時間の両方)を無駄にしないように、明確な目的でそれらを成長させることをお勧めします4。オルガノイド増殖は、複数のウェルサイズおよびフォーマットで試験されており、最適な細胞生存率を維持するには10cmプレートが理想的な設定であり、続いてウェルあたり3つのオルガノイドを含む6ウェルプレートが続くことが示されています34。オルガノイドは、2次元培養のオルガノイドと比較してより多くの培地を消費し、より小さなウェルフォーマットを使用しても適切なメンテナンスにつながりません。例えば、96ウェルフォーマットプレートの1ウェルには、オルガノイドの成長を維持するのに十分なスペースまたは培地容量がありません。
オルガノイドが確立するにつれて、観察することは成功を高めるために重要です。最初は、オルガノイドはゆっくりと培地を消費しますが、密度が高く成熟するにつれて、培地をより早く消費します。フェノールレッドをメディアに追加すると、メディア消費量の指標として役立ちます。培地が黄色くなると、大量の培地を交換する、プレート内の総培地量を増やす、オルガノイドを複数の細胞培養プレートに分割して成長に追いつく、実験のタイムラインを調整するなど、給餌パターンを調整するように促される場合があります。 
多くの点で、オルガノイドは癌研究を行うための非効率的な方法です。それらは長い時間スケールを含み、GBM球培養と比較して高価で資源が重い。しかし、細胞および微小環境の多様性を再現するための代替方法である患者由来の異種移植片と比較して、それらはより単純で、より安価で、制御可能です。オルガノイドをいつ最適に使用するかの選択は、がん研究者にとって重要です。それらは、伝統的な領域や付着文化を置き換えることを意図したものではなく、異種移植片モデルを置き換えることを意図したものではありません。オルガノイドは、適切な科学的問題に適用すると、これら両方のシステムの利点を組み合わせることができ、そうでなければ隠されたままになる腫瘍細胞生物学を観察することができます。科学界は、オルガノイドがどのような学習機会を提供するかを理解し始めたばかりですが、GBMの複雑な生物学を理解するための将来、オルガノイドが非常に貴重なツールになることは明らかです。

膠芽腫(GBM)は、最も一般的に発生する原発性脳腫瘍であり、診断1から約15か月の厳しい予後があります。前臨床試験で有効な治療法は、多くの場合、患者にはあまり効果がありません2,3。臨床反応の低下は、GBMの微小環境の不均一性や複雑な腫瘍内相互作用など、多くの要因に起因します。これらは、従来の接着培養法または球培養法では実験室環境で再現するのが難しい場合があります4。GBM内に自己複製癌幹細胞(CSC)のサブセットが存在することも、この複雑さの一因となる可能性があります5,6。CSCは腫瘍の増殖に不可欠であり、活発な血管新生、癌浸潤、および放射線を含む治療に対する耐性を促進することにより、腫瘍の成長を維持します7,8,9。CSCは腫瘍全体に均一に分布しているのではなく、血管周囲ニッチや骨膜壊死領域などの特定の微小環境内で濃縮されており、それぞれが細胞状態の異なる分子調節を提供します10、11、12、13、14。CSCは、微小環境の手がかりの受動的な受信者ではありませんが、代わりに独自の微小環境を改造する能力を持っています7,15,16。CSCの微小環境は、栄養不足、pH、低酸素症などの圧力に応答して幹細胞状態の維持を促進する可能性があり17,18,19,20、モデルシステムにおけるこれらの条件の重要性を示唆しています。したがって、腫瘍内の多様な細胞微小環境の再現は、治療耐性を理解し、新しい治療法を特定するために重要です。
三次元培養は近年人気が高まっている21,22。オルガノイドは他の種類の癌で使用されており、細胞をオルガノイドとして維持する主な目的は、不均一な細胞集団(その多くは通常、より均質な球培養で競合する可能性があります)の成長と、遺伝的特異性を持つ局所腫瘍微小環境と見なされる空間的多様性を可能にすることです4,23,24,25,26.癌細胞の三次元培養には多くの方法があり、それぞれに長所と短所があります27、28、29。オルガノイド培養は、従来の接着性または球体培養に代わるものではない。これは、細胞の微小環境と腫瘍細胞の応答との間の相互作用が重要である特定の質問がある場合に、2次元法の補完的な技術として最適に使用されます。
この記事では、一次患者サンプルまたは患者由来の培養からGBMオルガノイドを生成するための信頼性が高く再現性のある方法について説明します。3次元オルガノイド培養の2つの異なる目的に取り組んでいます:(1)均一性に関係なく最大の生着電位を持つ一次患者組織からのオルガノイドの樹立、または(2)より定量的な実験的使用のための均一なオルガノイドの成長。一次標本をオルガノイドとして樹立する場合、初期培養を確立するために最大細胞数と種類を維持することが優先されるため、単一細胞をフィルタリングしたり、細胞をカウントしたりする必要はありません。しかし、比較実験のためにオルガノイドを増殖させる場合、複製オルガノイドが実験の一貫性と同等であることを保証するために、単一細胞ろ過と細胞カウントが必要です。このプロトコルでは、オルガノイド培養を確立して均一なオルガノイドを作成する方法、オルガノイドを埋め込んで保存するための洗練された方法、および免疫組織化学、免疫蛍光、GBMオルガノイドの全細胞生存率の評価などの標準的な細胞培養実験について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>3,3-ジアミノベンジジン(DAB)錠</td><td>MP Biomedicals 08980681</td><td></td><td>3,3-ジアミノベンジジン(DAB)錠</td></tr><tr><td>96ウェルPCRプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>96ウェルPCRプレート</td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SCR005</td><td>細胞剥離液</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15240062</td><td>抗生物質-抗真菌剤</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント マイナスビタミン A</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>12587001</td><td>B-27 サプリメント マイナス ビタミン A (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain 試薬</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>24590</td><td>ブルーイング試薬</td></tr><tr><td>セル ストレーナー (70 & micro;m)</td><td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>セルストレーナー (70 & micro;m)</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>発光細胞生存率アッセイ</td></tr><tr><td>Clarifier 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>核ヘマトキシリン清澄化試薬</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>キシレン代替品</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 ヘマトキシリン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>ヘマトキシリン</td></tr>グル<tr><td>タミン0.85% NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>0.85% NaCl (200 mM) 中のグルタミン</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>ラミニンが豊富な細胞外マトリックス</td></tr><tr><td>Mini PAP ペン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>疎水性バリアペン</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>神経基礎培地マイナスフェノールレッド</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Neurobasal 培地マイナスフェノールレッド (500 mL)</td></tr><tr><td>正常ロバ血清 (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>正常ロバ血清 (NDS)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 4% PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AAJ19943K2パラ</td><td>ホルムアルデヒド 4% PBS</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>フェノールレッド (0.5%)</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤 with DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P10144</td><td>液体硬化型封入剤</td></tr><tr><td>組換えヒト EGF タンパク質</td><td>R&Dシステム</td><td>236-EG-01M</td><td>組換えヒトEGFタンパク質(250&micro;g/mL)</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF基本</td><td>R&Dシステム</td><td>4144-TC-01</td><td>組換えヒトFGF基本(250&micro;g/mL)</td></tr><tr><td>SignalStain 抗体希釈液</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>8112</td><td>抗体希釈液</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC 検出試薬</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>8114</td><td>免疫組織化学検出試薬</td></tr><tr><td>SignalStain クエン酸アンマスキング溶液</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>14746</td><td>クエン酸剥離液</td></tr><tr><td>シングルエッジカミソリ刃</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>シングルエッジかみそりの刃</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11360070</td><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek クライオモールド</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>使い捨てクライオモールド</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. コンパウンド</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>最適な切断温度コンパウンド</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10282</td><td>細胞不透過性ステイン (0.4%)</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>X3P-1GAL</td><td>キシレン</td></tr></tbody></table>

三次元オルガノイド 培養を用いたヒト 膠芽腫細胞の多様性の維持

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

膠芽腫(GBM)は、予後が非常に悪い、最も一般的に発生する原発性悪性脳腫瘍です。腫瘍内の細胞および分子の多様性、ならびに腫瘍微小環境間の複雑な相互作用は、効果的な治療法を見つけることを困難にする可能性があります。従来の接着培養法や球体培養法はこのような複雑さを隠すことができますが、3次元オルガノイド培養法は地域の微小環境勾配を再現することができます。オルガノイドは、患者の腫瘍構造をよりよく模倣し、表現型的に多様な細胞集団を含み、ミディアムスループット実験に使用できる3次元GBM培養の方法です。三次元オルガノイド培養は、従来の培養に比べて手間と時間がかかりますが、独自の利点を提供し、現在のin vitro システムと in vivo システムの間のギャップを埋めるのに役立ちます。オルガノイドは、腫瘍の挙動と耐性のメカニズムをよりよく理解するための癌生物学者の武器の中で非常に貴重なツールとしての地位を確立しており、その用途は拡大し続けています。ここでは、GBMオルガノイドを生成および維持するための方法について詳細に説明する。凍結およびパラフィン包埋技術の両方を使用してオルガノイドサンプル包埋および切片作成を実行する方法の説明、ならびにオルガノイド切片の免疫組織化学および免疫蛍光プロトコルの推奨事項、ならびにオルガノイド細胞生存率の測定についてもすべて説明します。

図1 は、光学顕微鏡で10倍の倍率で見た初期のオルガノイド成長を示しています。 図1A は、中央図にlrECMを介した単一細胞の遊走および浸潤を示す。細胞は拡大し続け、lrECMに「コロニー形成」し、目視検査ではより密度が高く、最終的には不透明に見えます。 図1B は、ダイムのサイズに対して、倍率なしでいくつかの成熟オルガノイド(7週間)を示しています。
図2 は、活性増殖のマーカーであるホスホヒストンH3に対するGBMオルガノイドの免疫組織化学的染色を示しています。ほとんどの高度に増殖する細胞は、オルガノイドコアと比較してオルガノイド周囲に見られます。陽性染色は茶色/銅の外観になります。
図3 は、3D特異的発光細胞生存率アッセイを用いてGBMオルガノイド中の総細胞数を均質化し測定するプロセスを説明する。GBMオルガノイドには細胞数が多いため、発光アッセイ試薬で粉砕することにより、より大きなオルガノイド構造が最初に均質化されます。次に、オルガノイドライセート全体の画分を個々のウェルにロードし、追加の発光アッセイ試薬で希釈してから、インキュベーションを行い、適切なマルチウェルプレートリーダーで読み取ります。
図4 は、オルガノイドのDMSO(共通ビヒクル)制御データを表しています。プロットされたデータは、オルガノイド内およびオルガノイド間の一貫性を示しています。発光生存率データは通常、実験データを生成する際に各標本の対照に対して正規化されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> 図1:光学顕微鏡による観察(10倍)。 (A)ラミニンリッチ細胞外マトリックス全体でGBM細胞の遊走/浸潤を示す初期のオルガノイド増殖。(B)ダイムのサイズに対する成熟したオルガノイド。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> 図2:GBMオルガノイドの免疫組織化学 。 (A、 B)活性化増殖のためのホスホヒストンH3染色細胞を示すGBMオルガノイド。スケールバーは、AとBでそれぞれ600μmと300μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> 図3:オルガノイドの発光細胞生存率プロトコル 。 (A)個々のオルガノイドを小さな遠沈管に移し、余分な培地を取り除きます。(B)500 μLの1:1 PBSおよび発光細胞生存率アッセイ混合物を各チューブとピペットに積極的に添加して、オルガノイドを分解します。(C)このオルガノイド混合物25 μLと、同じ1:1 PBSおよび発光細胞生存率アッセイ混合物75 μLを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。(D)シェーカーに2分間置き、続いてRTで20分間インキュベートした後、プレートリーダーで発光を読み取ります。BioRender.com を使用して作られた図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> 図4:細胞生存率。 4つの患者検体に対する4つのオルガノイドの6つの技術的複製について、0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)中のオルガノイドの細胞生存率データ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント</td>
			<td>量</td>
		</tr><tr><td>神経基礎培地マイナスフェノールレッド</td>
			<td>500ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>B-27サプリメントマイナスビタミンA(50倍)</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌薬(100x)</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>0.85%NaCl(200 mM)中のグルタミン</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>組換えヒトFGF塩基性(250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>組換えヒトEFGタンパク質(250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>フェノールレッド</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>表1:神経基礎培地完全(NBMc)製剤
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>時間</td>
		</tr><tr><td>50%エタノール</td>
			<td>3 ミン</td>
		</tr><tr><td>75%エタノール</td>
			<td>3 ミン</td>
		</tr><tr><td>95%エタノール</td>
			<td>3 ミン</td>
		</tr><tr><td>95%エタノール</td>
			<td>4 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>3 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>4 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>3 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>4 ミン</td>
		</tr><tr><td>パラフィンワックス</td>
			<td>15分</td>
		</tr><tr><td>パラフィンワックス</td>
			<td>15分</td>
		</tr></tbody></table>表2:小型オルガノイド(直径3 mm未満)の処理スケジュール
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>時間</td>
		</tr><tr><td>50%エタノール</td>
			<td>6 ミン</td>
		</tr><tr><td>75%エタノール</td>
			<td>6 ミン</td>
		</tr><tr><td>95%エタノール</td>
			<td>5 ミン</td>
		</tr><tr><td>95%エタノール</td>
			<td>8 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>5 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>5 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>8 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>5 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>5 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>8 ミン</td>
		</tr><tr><td>パラフィンワックス</td>
			<td>30分</td>
		</tr><tr><td>パラフィンワックス</td>
			<td>30分</td>
		</tr></tbody></table>表3:大型オルガノイド(直径3mm以上)の処理スケジュール
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>時間</td>
		</tr><tr><td>ヘマトキシリン</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr><tr><td>ランニング diH2O</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr><tr><td>核ヘマトキシリン清澄化試薬</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>ランニング diH2O</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>ブルーイング試薬</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>ランニング diH2O</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr><tr><td>70%エタノール</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>100%エタノール</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr><tr><td>キシレン代替物</td>
			<td>2 ミン</td>
		</tr></tbody></table>表4:ヘマトキシリン対比染色

ここでは、患者一次検体または患者由来の細胞培養から膠芽腫(GBM)オルガノイドを作製し、成熟度まで維持する方法について述べる。これらのGBMオルガノイドは、表現型的に多様な細胞集団を含み、腫瘍微小環境を ex vivoで再現します。

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

膠芽腫の治療法を見つけることは、腫瘍に存在する細胞の多様性と多様な微小環境間の相互作用のために困難です。オルガノイドは、その空間的多様性の一部を再現するのに役立ち、これを使用して腫瘍の生物学をよりよく理解することができます。従来の細胞培養法は均質な腫瘍細胞集団を生成する傾向がありますが、オルガノイドは膠芽腫の分子および細胞の多様性をよりよく模倣し、腫瘍内相互作用をより適切にモデル化できます。オルガノイドは、薬効や耐性のメカニズムを調べるために使用できます。臨床療法に対する耐性は、オルガノイドにのみ現れ、伝統的な領域培養には現れず、この病気の臨床的現実を反映しています。オルガノイドは、化学療法の局所的効果を実証するのに役立ちます。それらは、新しいニッチな特定の治療法を発見するために使用でき、将来の個別化医療の予測ツールとしても機能します。オルガノイドの作成に使用される一部の材料は温度に敏感であり、これらの材料を適切な温度に保つことを怠ると、オルガノイドの作成または維持が困難になる可能性があります。パラフィルムシートからパラフィン紙を取り出し、2つの滅菌96ウェルポリメラーゼ連鎖反応またはPCRプレートの間に置いて、培養フードの下でオルガノイドモールドの準備を開始します。パラフィルムの内側がきれいであることを確認してください。天板に均等な圧力を加えて、穴を開けずにパラフィルムに深さ2ミリメートルの小さなディンプルを形成します。プレートを分離します。くぼみのあるパラフィルムは天板にくっつきます。次に、トッププレートをドライアイスの上に30秒間置きます。滅菌鉗子を使用して、パラフィルムをトッププレートから素早く引き抜きます。冷凍パラフィルムは取り外しが簡単です。完成したパラフィルム型を、蓋をした滅菌済みの10センチメートルの細胞培養皿に入れます。膠芽腫またはGBM付着培養物から単一細胞懸濁液を調製するには、使用済みの培地をプレートから取り出します。次に、室温で2ミリリットルの細胞剥離溶液をプレートに加え、プレートを37度で3分間インキュベートします。顕微鏡下でプレートからの細胞剥離を確認した後、8ミリリットルのニューロバクサル培地(NBMc培地)を加えて細胞剥離液を中和します。単一の70ミクロンセルストレーナーを通して懸濁液を濾します。セルを120倍Gで5分間スピンダウンします。次に上清を除去し、細胞を1ミリリットルのNBMcに再懸濁します。 細胞不透過性染色剤を使用して単一細胞懸濁液から細胞をカウントします。シングルセル懸濁液からオルガノイドを作製するには、適量のラミニンリッチ細胞外マトリックス(lrECM)をアイスバケットまたはコールドブロックの小さな遠心チューブに加えます。オルガノイドあたり20, 000個の細胞を含む細胞混合物を調製します。lrECM細胞懸濁液混合物を十分に混合して、細胞が沈降しないようにし、その結果、オルガノイドが不均一に形成されます。次に、20マイクロリットルの混合物をパラフィルム型上に注意深くピペットで入れ、真珠様の液滴を形成した。lrECM重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。必要な数のオルガノイドを10cmの培養プレートのパラフィルム型にピペットで移したら、細胞培養インキュベーター内で37°Cで1〜2時間インキュベートします。オルガノイドが固まったら、P1000チップを使用してNBMc培地でパラフィルムモールドからオルガノイドを静かに洗い流し、20ミリリットルのNBMcを含む新しい10センチメートルの培養プレートに回収します。 培養プレートを4日間振とうせずにインキュベーターに入れます。4日後、プレート内のメディアを交換します。これを行うには、細胞培養プレートの下に暗い紙を置きます。プレートを傾けて20秒待ちます。オルガノイドが皿の底に完全に落ち着いたら、大きな開口部のガラスピペットでゆっくりと培地を取り除きます。新しい培地を追加した後、プレートを80RPMのオービタルシェーカーのインキュベーターに入れ、その後2〜3日ごとに培地を交換します。オルガノイドの成長は、光学顕微鏡を用いて観察した。中央図では、初期のオルガノイド増殖は、lrECMを介した遊走と単一細胞浸潤を示した。7週目の成熟オルガノイドは、10セント硬貨の大きさに対して相対的であった。GBMオルガノイドをホスホヒストンH3で免疫組織化学的に染色したところ、コアと比較してオルガノイドの周囲に茶色または紫色の外観を持つ高増殖細胞が明らかになりました。0.1%DMSO中のオルガノイドの細胞生存率データは、オルガノイド内およびオルガノイド間の一貫性を示しました。オルガノイドバイオマスと培地の酸性化に注意してください。オルガノイドの培地通過が速すぎる場合は、培地をより頻繁に交換するか、追加のプレート間でオルガノイドを分割してください。成熟オルガノイドは、治療法の実験に使用したり、免疫組織化学または免疫蛍光で使用するために埋め込まれて切断することができます。解離したオルガノイドは、FACS分析に使用できます。これらのオルガノイドは最近、空間的に異なる癌幹細胞ニッチに不可欠な標的を発見するための3次元機能スクリーニングに使用されました。また、これらのモデルを使用して、in vivoテストの前にさまざまな薬剤や治療法に優先順位を付けています。

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三次元オルガノイド培養を用いたヒト膠芽腫細胞の多様性の維持

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