Name: ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞の単離・培養・特性評価法。酵素処理と細胞培養技術を用いて、創傷治癒や皮膚恒常性における細胞間相互作用を解析する基礎的プロトコルです。

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ファディア・カマル博士とレイアド・エルバーバリ博士に、ラボ機器と技術サポートの使用を許可してくれたことに感謝します。この研究は、ペンシルベニア州立大学ハーシー医療センターからの制度的支援に加えて、NIH(K08 AR060164-01A)およびDOD(W81XWH-16-1-0725)からJ. C. E.への助成金によって支援されました。

研究目的での非同定ヒト包皮組織の取得および使用は、ペンシルベニア州立医科大学治験審査委員会(IRB #17574)によってレビューされ、「ヒト研究ではない」という決定を受けた。
注:以下のプロトコルに従うことによって、2.4 x 106ケラチノサイト、4.4 x 106線維芽細胞および1.1 x106 SCが単一の包皮から得られる。一般に、これらの初代細胞は、実験条件に応じて3継代に用いることができる。
1. 初代細胞の単離と培養条件
<ol><li>表皮と真皮の分離手順<ol>
<li>承認された病院の規制プロトコルの下で医師による標準的なケア手順に従って新生児包皮を取得する。医師は、出生後の割礼のタイミングと除去された皮膚の量を決定します。</li>
		<li>摘出した包皮を、氷冷したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)基礎培地8~10mLを含む微量遠心チューブに入れ、包皮を細胞培養ラボに直ちに輸送して細胞単離する。1x抗生物質/抗真菌薬を含む1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)20〜25mLで皮膚を2回すすいでください。 注:細胞生存率を最大限に高めるには、摘出した包皮を処理まで4°Cに置き、24時間以内に細胞を回収する必要があります。</li>
		<li>DPBS/抗生物質ですすぎた後、包皮を氷冷DMEM基礎培地25〜30mLに10〜15分間浸し、10cmの組織培養皿に入れます。滅菌技術を使用して組織培養フード内のすべての処理ステップを実行します。</li>
		<li>メスを使用して、包皮を慎重にスライスし、真皮および皮下脂肪組織を露出させる。</li>
		<li>必要に応じて、鉗子、メス刃、はさみを用いて皮下脂肪組織を除去します。脂肪組織を捨てる。きれいにした包皮を3〜5個に切る。</li>
		<li>16〜20mLのディスパーゼ-I/DMEM培地(DMEM基礎培地では4mg/mL)を含む滅菌円錐管に皮膚片を移す。</li>
		<li>ディスパーゼ-Iとのインキュベーションの最初の30分間に、断続的に反転させて円錐管内の皮膚片を混合する。その後、円錐形のチューブを4°Cで16〜18時間置き、皮膚片をディスパーゼI/メディアに浸すように注意してください。 注:Dispase-I溶液は、冷たいDMEM基礎培地を使用して添加する直前に調製し、0.22μmのストレーナーで濾過し、4°Cに保温するべきである。</li>
		<li>dispase-Iで一晩消化した後、皮膚片を取り除き、乾燥した滅菌した培養皿の上に置きます。表皮層の外側が培養皿に触れるように各皮膚を転がす。</li>
		<li>2組の鉗子を使用して、表皮を真皮から慎重に分離する。組織の端から始めて、表皮を真皮から剥がします。 注:表皮層が真皮から分離しにくい場合、ディスパーゼ-I消化は十分ではなかった。トラブルシューティングオプション:1)皮膚片をディスパーゼI / DMEM溶液に戻し、4°Cでさらに2〜3時間インキュベートする。2)新鮮なディスパーゼI/DMEMにスキンピースを入れ、4°Cでさらに2〜3時間インキュベートする。</li>
		<li>分離した表皮および真皮を使用して、ケラチノサイト(表皮)および線維芽細胞およびシュワン細胞(真皮)を単離する。 注: 特定の細胞タイプの単離および培養条件については、以下の手順に従ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>表皮からのケラチノサイトの単離<ol>
<li>5 mLのHEPES緩衝液生理食塩水(HBS)を10cm培養皿に加え、分離した表皮断片を加える。室温(RT)で10分間インキュベートする。</li>
		<li>HBSインキュベーション後、HBS溶液を50mL円錐管に集める。50 mL の円錐管に 5 mL のトリプシン中和バッファー (TNB) (材料表) を加え、脇に置いておきます。</li>
		<li>表皮断片に3mLのトリプシン溶液を加える。37°Cで10分間インキュベートする。</li>
		<li>トリプシン溶液が濁るまで鉗子を用いて表皮断片を穏やかに攪拌する。</li>
		<li>ステップ1.2.2でトリプシン溶液/ケラチノサイトをHBSおよびTNB含有チューブに加える。</li>
		<li>最初のトリプシン消化で溶解していない残りの表皮断片については、3mLの0.25%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加える。37°Cで10分間インキュベートし、ステップ1.2.4および1.2.5を繰り返します。</li>
		<li>HBSおよびTNB溶液チューブを含むトリプシン/EDTA溶液に2mLのウシ胎児血清(FBS)を加える。</li>
		<li>HBS/TNB/トリプシンおよびケラチノサイトを含む収集チューブを870 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、細胞ペレットを3mLのケラチノサイト完全増殖培地に再懸濁する(材料表)。</li>
		<li>滅菌 100 μM フィルターで細胞懸濁液を滅菌 50 mL 円錐管にろ過し、破片を除去します。</li>
		<li>細胞数および細胞生存率を定量化する。 注:ここでは、特殊な細胞サンプリングおよび染色装置(材料表)を使用して、製造元の指示に従って細胞数および生存率を定量した。</li>
		<li>実験のために必要に応じて種培養プレート。推奨される播種密度は〜45,000セル/cm2です。</li>
		<li>培養プレートを5%CO2 中で37°Cのインキュベーター内に2日間置き、ケラチノサイトがディッシュに接着するようにした。</li>
		<li>2日後、接着していない細胞を吸引する。ケラチノサイトが継代または下流実験のための所望のコンフルエント(50%〜80%コンフルエント)に達するまで、細胞培養培地を1日おきにリフレッシュする。</li>
	</ol></li>
	<li>真皮からのシュワン細胞(SC)および線維芽細胞の単離<ol><li>T25フラスコをポリL-リジン(PLL、0.01μg/μL)でプレコートし、5mLの1x DPBSを使用します。プレコートフラスコを37°Cで3時間置く。PLLコーティングマトリックスを1x DPBS(5mL)を使用して2回洗浄します。 注:T25フラスコは事前に準備することができます。</li>
		<li>真皮の単離片を5mLのDMEM基礎培地ですすいでください。</li>
		<li>真皮をはさみやメスで小片に刻む。</li>
		<li>ミンチした真皮を5 mLのコラゲナーゼ(DMEM基礎培地では2 mg/mL)で37°Cで2.5時間消化する。真皮が完全に解離するまで、30分ごとにピペットチップでミンチした真皮を静かに粉砕する。</li>
		<li>細胞懸濁液を70μMの細胞ストレーナーでろ過する。懸濁液を完全に濾過するために、1mLシリンジを使用して機械的力を加える必要がある。</li>
		<li>濾過した細胞懸濁液を5mLの完全DMEM培地(DMEM基礎培地+5%FBS+抗生物質1x)で希釈し、コラゲナーゼの酵素活性を停止させた。</li>
		<li>細胞懸濁液をRTで5分間870 x g で遠心分離し、細胞をペレット化する。</li>
		<li>この細胞ペレットから、線維芽細胞およびSCの両方が得られるであろう。細胞ペレットを2 mLのDMEM完全培地に再懸濁して細胞を分割し(1 mL細胞懸濁液/チューブ)、RTで870 x g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>SC培養の場合はステップ1.3.10~1.3.17に従い、線維芽細胞培養の場合はステップ1.3.18~1.3.22に従います。</li>
		<li>ステップ1.3.8から、上清を吸引する。細胞ペレットを5mLの新鮮なDMEM完全培地に再懸濁する。</li>
		<li>細胞数と生存率を定量化する。 注:ここでは、特殊な細胞サンプリングおよび染色装置(材料表)を使用して、製造元の指示に従って細胞数および生存率を定量した。</li>
		<li>プレコーティングされたT25フラスコに、密度4.0 x103 細胞/mLで5 mLの再懸濁細胞を播種する。フラスコを5%CO2存在下で37°Cで一晩インキュベートする(〜12 〜16時間インキュベーション)。</li>
		<li>16時間後、倍率10倍の顕微鏡(材料表)により細胞接着を確認した。</li>
		<li>非接着細胞を除去し、5mLの1x DPBSで3xフラスコを洗浄する。</li>
		<li>DMEM完全培地に5mLの10μMシトシンアラビノシド(抗有糸分裂剤、線維芽細胞を殺す)を加える。フラスコを37°Cで5%CO2存在下で24時間インキュベートする。</li>
		<li>フラスコからシトシンアラビノシド含有培地を吸引する。フラスコを5mLの1xDPBSで3xすすいでください。</li>
		<li>培養フラスコに5mLのSCs完全培養培地(材料表)を補充し、5%CO2の存在下で37°Cで48時間インキュベートする。SCが80%コンフルエントに達するまで、1日おきにSC完全培養培地をリフレッシュする。</li>
		<li>解離した真皮層から上清を吸引し(ステップ1.3.8)、細胞ペレットを5mLの線維芽細胞完全培地(線維芽細胞基礎培地+ 5%FBS + 1x抗生物質)で再懸濁する。</li>
		<li>細胞数と細胞生存率を定量化する。 注:ここでは、特殊な細胞サンプリングおよび染色装置(材料表)を使用して、製造元の指示に従って細胞数および生存率を定量した。</li>
		<li>5 mLの線維芽細胞完全培地を用いて、T25培養フラスコ(プレコーティングされていない)に4.0 x103 細胞/mLの細胞密度で線維芽細胞をプレートする。5%CO2の存在下で37°Cで一晩インキュベートする(〜12 〜16時間インキュベーション)。</li>
		<li>16~24時間後、倍率10倍の顕微鏡(材料表)により細胞接着を確認した。フラスコから非接着細胞を吸引し、5mLの1x DPBSでフラスコを2回洗浄する。</li>
		<li>5mLの新鮮な線維芽細胞完全培地を加え、5%CO2 の存在下で37°Cで48時間インキュベートする。線維芽細胞が継代または下流アッセイのための所望の合流点(50%〜80%コンフルエント)に達するまで、1日おきに培養培地をリフレッシュする。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 免疫蛍光による表皮角化細胞、真皮SC、線維芽細胞タンパク質マーカーの検証
<ol><li>1日目 - チャンバーガラススライドのコートとセルの剥離<ol>
<li>4ウェルチャンバーガラススライドをケラチノサイト用のコラーゲン-I、SC用のPLLまたは線維芽細胞用のDPBSのみ1x(各ウェル0.5mL)でプレコートする。必ず全面をコーティングしてください。インキュベートチャンバースライドを37°Cで2時間。インキュベーション中に、細胞を調製する。</li>
		<li>培養細胞が50%〜80%コンフルエントに達した後、フラスコを1x DPBS 3x(各ウェルに1mL)で洗浄する。</li>
		<li>5 mL の 0.25% トリプシン-EDTA (TE) 溶液で接着した細胞を剥離し、細胞が丸くなり始めるまで 37 °C で 5%CO2 存在下で 2 分間インキュベートします。顕微鏡(材料表)で細胞剥離を10倍の倍率で視覚化します。</li>
		<li>インキュベーション後、細胞を含むTE溶液を5mLウシ胎児血清(FBS)と共に円錐管に移す。</li>
		<li>5mLのトリプシン中和緩衝液(TNB)を培養フラスコに加え、内容物を上記の遠沈管(TEおよびFBSを有する細胞)に移す。顕微鏡(材料表)で細胞剥離を10倍の倍率で視覚化します。 注:TNBまたはFBSまたはその両方を使用して、トリプシン活性を中和することができます。</li>
		<li>細胞/TE/TNBを含む円錐管を870 x g で5分間遠心分離します。上清を別のチューブに移し、細胞ペレットを対応する完全培養培地に再懸濁する。ステップ1.2.11で述べたように細胞生存率を測定する。</li>
		<li>プレコートチャンバースライドガラス(ステップ2.1.1)を1x DPBS(各ウェルに1mL)3xですすいでください。</li>
		<li>組織培養フード内のスライドを半乾燥させ、種子ケラチノサイト、SC、または線維芽細胞を適切な密度(30,000細胞/0.5mL/チャンバー)で適切な完全細胞培養培地で乾燥させる。</li>
		<li>チャンバースライドを37°Cで一晩インキュベートして、細胞が接着できるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目-ウシ血清アルブミン(BSA)および一次抗体インキュベーションでチャンバースライドガラスをブロッキング<ol>
<li>チャンバースライドから細胞培地を吸引し、1mLの1x DPBSで3x洗浄する。</li>
		<li>接着した細胞を1x DPBS(各ウェルに1mL)中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、組織培養フード内のRTで15分間インキュベートする。</li>
		<li>チャンバースライドから4%パラホルムアルデヒドを吸引し、チャンバースライドを1x DPBS(各ウェルに1mL)で3x洗浄します。</li>
		<li>1x DPBS中の1%TritonX-100(各ウェルに1mL)で細胞膜を透過処理し、RTで15分間インキュベートする。</li>
		<li>チャンバースライドからブロッキング溶液を吸引し、1x DPBS(各ウェルに1mL)で30秒間3x洗浄してから、ウェルから1x DPBSを吸引します。</li>
		<li>チャンバースライドを5% BSA(各ウェルに0.5mL)でブロックし、RTで45分間インキュベートします。</li>
		<li>チャンバースライドからブロッキング溶液を吸引し、1x DPBS(各ウェルに1mL)で3xを30秒間洗浄してから、ウェルから1x DPBSを吸引します。</li>
		<li>一次抗体を5%BSA(各ウェルあたり0.2mL)で希釈する(一次抗体希釈液:ケラチノサイト:マウスサイトケラチン14抗体(1:100)および、サイトケラチン10抗体(1:100);シュワン細胞:マウスS100抗体(1:200)、およびウサギ神経成長因子受容体(p75-NTR)抗体(1:500);線維芽細胞:ウサギビメンチン抗体(1:200)、およびマウスα-平滑筋アクチン(α-SMA)抗体(1:200))。</li>
		<li>スライドガラスチャンバー上の対応する細胞に対する一次抗体を加え、加湿チャンバー内で4°Cで約15〜16時間(一晩)インキュベートする。</li>
		<li>チャンバースライドから一次抗体を吸引し、1x DPBS(各ウェルに1mL)で30秒間3回洗浄してから、ウェルから1x DPBSを吸引します。</li>
		<li>二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG二次抗体 - Alexa Fluor 488(1:500)およびヤギ抗マウスIgG二次抗体 - Alexa Fluor 594(1:500))を0.5%BSAで希釈する。適切な二次抗体を各ウェルに加える(各ウェルにつき0.2 mL)。RTで45分間インキュベートする。</li>
		<li>チャンバースライドから二次抗体を吸引し、1x DPBS(ウェルごとに1mL)で3xを30秒間洗浄し、ウェルから1x DBPSを吸引します。</li>
		<li>ガスケットリムーバーを使用して、4ウェルチャンバースライドのガスケットを取り外します。スライドに接着剤を残さないようにしてください。これはカバースリップの塗布を妨げるためです。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むマウント培地を一滴加える。あるいは、DAPIでウェルを対比染色し、非標識含有マウント培地を使用する。</li>
		<li>気泡を避けてスライドガラスの上にカバースリップを慎重に置き、カバースリップの端を接着剤で密封します。免疫蛍光染色パターンを顕微鏡(材料表)により10倍および/または20倍の倍率で観察する。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li>
<li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li>
</ol>

他のすべての著者は、競合する金銭的利益はないと宣言しています。

このプロトコルは、包皮の単一片から3つの異なる細胞集団、すなわちケラチノサイト、線維芽細胞、およびシュワン細胞を単離する方法を記載する。ケラチノサイトおよび線維芽細胞2,3,5,6を単離するために利用可能な単離プロトコルはいくつかあるが、SC単離を記載するものはない。皮膚の重要な構造細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞とは別に、皮膚は感覚求心性構造と自律神経遠心性によって高度に神経支配されています。感覚求心性は、軽い接触、振動、痛み、かゆみ、および熱い感覚と冷たい感覚の伝達において重要な役割を果たします。自律神経滓性は汗腺と耳介のピリ筋を神経支配する9.各神経軸索は、末梢神経系のグリア細胞であるSCによって鞘付けされている。SCが軸索再生をサポートするため、SCの研究および臨床的関心が大幅に高まっている1...

生体組織由来の初代細胞を in vitro 条件下で培養すると、生理状態1によく似ており、生理学的・病態生理学的過程を調べるのに理想的なモデルとなっています。皮膚には、ケラチノサイト、線維芽細胞、皮脂細胞、メラノサイト、シュワン細胞(SC)を含む複数の細胞タイプが含まれており、 これらはインビトロ 実験のために単離および培養することができる。ケラチノサイト、線維芽細胞、およびSCを単一の皮膚片から単離および培養する方法は、記載されていない。このプロトコルの目標は、1)真皮SCの単離および培養のための信頼性が高く再現可能な方法を確立すること、および2)単一のヒト包皮からケラチノサイト、線維芽細胞、およびSCを単離するための効率的で堅牢な方法を使用することの2つである。
現在、皮膚ケラチノサイト2、3、4および線維芽細胞5,6を単離するための確立されたプロトコルがある。これらの研究は、皮膚からのケラチノサイト、線維芽細胞、またはその両方の単離を記述しているが、ヒト皮膚から初代SCの培養を確立する方法を扱うプロトコルはない。最近の研究は、ニューロンSCがケラチノサイトおよび線維芽細胞の細胞プロセスを調節し、正常な皮膚生理学的機能を調節することを示唆している7。したがって、SCは皮膚の恒常性に重要であり、隣接する皮膚細胞型の挙動に影響を与える生理機能を調節するのに実質的に寄与する8。したがって、これらの各細胞型の単離を可能にするプロトコルは、細胞間通信または細胞型間のクロストークを含むin vitro実験に理想的である。
このプロトコルは、単一の皮膚片からの初代細胞の個々の細胞培養物の確立を記述する。このプロトコールは、利用可能な組織の量が限られている場合に特に有用である。さらに、単一のドナーから3つの細胞型すべてを単離することで、所望の実験中の遺伝学の影響を軽減しながら、細胞型間の堅牢な比較または共培養実験が可能になります。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上M滅菌フィルター(Millex-GPシリンジフィルターユニット、ポリエーテルスルホン)</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;M細胞ストレーナー</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>100 & micro;M細胞ストレーナー</td><td>CELLTREAT 229485</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 使い捨てシリンジ</td><td>BD Luer-Lok</td><td>BD-309659</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 使い捨てシリンジ (シリンジ滅菌、単回使用)</td><td>BD Luer-Lok</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 使い捨てシリンジ</td><td>BD Luer-Lok</td><td>BD305462</td><td></td></tr><tr><td>1% TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td>使用時に調製</td></tr><tr><td>4%パラホルムアルデヒド溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J19943。K2</td><td>4°ですぐに使用および保管できます。C</td></tr><tr><td>5% BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>使用時に調製</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質</td><td>ScienCell Research</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Chemometec Vial1-Cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1420193</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17018-029</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisherbrand</td><td>12544D 22*50-1.5</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D46693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 基礎培地</td><td>ScienCell Research</td><td>9221</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ および Mg2+ を含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>コーニング</td><td>&nbsp;21-031-CV)</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL 円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 円錐形滅菌ポリプロピレン遠心チューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast complete medium</td><td>ScienCell Research</td><td>2331</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>希釈 (1:500)</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>希釈 (1:500)</td></tr><tr><td>ハンクス緩衝生理食塩水 (HBSS 緩衝液)</td><td>ロンザ</td><td>CC-5022</td><td></td></tr><tr><td>人間の包皮</td><td></td><td></td><td>研究目的で匿名化された人間の包皮組織(治験審査委員会-IRB#17574)。</td></tr><tr><td>KGM-GOLD ケラチノサイト培地 (KGM gold and supplements)</td><td>Lonza</td><td>00192151 and 00192152</td><td></td></tr><tr><td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-9760-82</td><td>希釈 (1:200)</td></tr><tr><td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Dilution (1:100)</td></tr><tr><td>Mouse S100 antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA5-12969</td><td>希釈 (1:200)</td></tr><tr><td>マルチチャンバー (4 ウェルスライドガラス)</td><td>Tab-Tek</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td><td>ScienCell Research</td><td>32503</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit K10 antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>SAB4501656 Dilution(1分100秒)</td></tr><tr><td>ウサギp75-NTR抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB1554</td><td>希釈(1:500)</td></tr><tr><td>ウサギビメンチン</td><td>プロテインテック</td><td>10366-1-AP</td><td>希釈(1:200)</td></tr><tr><td>シュワン細胞培養培地</td><td>サイエンセルリサーチ</td><td>1701</td><td></td></tr>精密<tr><td>ピンセットデュモンストレートエクストラファインチップデュモスター、5</td><td>ロス</td><td>LH75.1</td><td>使用</td></tr><tr><td>前に70%アルコールで滅菌してくださいアイリスハサミ、シャープ/シャープ。長さ4&ndash;3/8インチ(111mm)</td><td>コッドマン</td><td>54-6500</td>使用<td>前に70%アルコールで滅菌滅菌</td></tr><tr><td>滅菌外科用鋭利な刃(デュロエッジエコノミーシングルエッジブレード)</td><td>カミソリブレード会社</td><td>94-0120</td>使用<td>前に70%アルコールで滅菌</td></tr><tr><td>T25培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン中和バッファー(TNS)</td><td>ロンザ</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA</td><td>ロンザ</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer 7-Axiocam 506モノラル&ndash;Apotome.2</td>顕微鏡 <td>染色細胞を含むチャンバースライドの免疫蛍光測定用</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Primovert</td>細胞<td>の接着または剥離の可視化/観察用</td></tr></tbody></table>

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

このプロトコールは、皮膚の迅速な酵素解離を用いた高収率および生存率を有するヒト初代細胞の単離方法、培養条件、および特性評価を記載する。初代ケラチノサイト、線維芽細胞、およびシュワン細胞はすべて、ヒト新生児包皮から採取され、標準的なケア手順に従って入手可能である。除去された皮膚を消毒し、皮下の脂肪と筋肉をメスを用いて除去する。この方法は、表皮層および真皮層の酵素的および機械的分離、続いてこれらの表皮層のそれぞれから単一細胞懸濁液を得るためのさらなる酵素消化からなる。最後に、単一細胞を標準的な細胞培養プロトコルに従って適切な細胞培養培地中で増殖させ、数週間にわたって増殖および生存率を維持する。このシンプルなプロトコルを組み合わせることで、皮膚神経モデルの in vitro 評価のために、単一の皮膚から3つの細胞タイプすべてを単離、培養、および特性評価することができます。さらに、これらの細胞は、創傷治癒に関連する培養においてロボット的に行われる傷の形で、互いに対するそれらの効果および in vitro 外傷に対するそれらの応答を測定するために、共培養において一緒に使用することができる。

正常な新生児包皮は、初代表皮角化細胞ならびに真皮SCおよび線維芽細胞の単離に使用した。単離した初代細胞を、成長因子を含む各細胞培養培地で培養した。SCsおよび線維芽細胞を培養フラスコに播種した後、ほとんどの細胞は2時間以内にフラスコの底に接着した。ケラチノサイトの場合、ほとんどのケラチノサイトは24時間で接着した。単離された表皮初代ケラチノサイトは、7日目までに85%コンフルエントに達し、特徴的な細胞形態(石畳状)を示した(図1A)。SCは5日目までに95%の合流点に達し、双極または三極の形をしたように見えた(図1B)。線維芽細胞培養物は4日目までに95%コンフルエントに達し、ほとんどの細胞は紡錘体形状形態を示した(図1C)。細胞型特異的タンパク質発現は、免疫蛍光染色によりこれらの培養物において確認された。ケラチノサイトは、K10(分化マーカー)およびK14(増殖マーカー)タンパク質に対して陽性であった(図2A</st...

筋骨格損傷に関連する創傷治癒の研究は、しばしば、シュワン細胞(SC)、ケラチノサイト、および線維芽細胞間の インビトロ 相互作用の評価を必要とする。このプロトコルは、ヒト包皮からのこれらの初代細胞の単離、培養、および特性評価を記述している。

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

皮膚には、ケラチノサイト、線維芽細胞、および神経シュワン細胞を含む複数の細胞型が含まれる。このプロトコールは、インビトロ実験のためのこれらの細胞型の各々の単離を可能にする。単一のドナーからの個々の初代細胞培養物の単離および確立は、遺伝的変異の影響を軽減しながら、堅牢な比較および共培養実験を可能にする。このプロトコルでは、個々の細胞とその相互作用の分析により、皮膚の恒常性および病態生理学におけるシュワン細胞の役割の分析が可能になります。これらの別個の細胞集団は、シュワン細胞、線維芽細胞、またはケラチノサイトを、正常な皮膚生理学、創傷治癒または皮膚疾患状態において、個々にまたは組み合わせて研究するために使用することができる。私の研究室のポスドク研究員であるJagadeeshaprasad M Gは、手順の実演を手伝ってくれます。標準的なケア手順に従って新生児包皮を取得した後、切除した包皮を8〜10ミリリットルの氷冷DMEM基礎培地を含むマイクロ遠心チューブに入れ、包皮を細胞培養実験室に輸送して細胞単離する。抗生物質と抗真菌薬を含む20〜25ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSで包皮を2回すすいでください。次いで、洗浄した皮膚を25〜30ミリリットルの氷冷DMEM基礎培地に10センチメートルの組織培養皿に浸す。15分後、包皮をメスを用いてスライスし開き、真皮及び皮下脂肪組織を露出させた。鉗子、メス刃、はさみを使用して皮下脂肪組織を除去し、廃棄する。次いで、きれいな包皮を3〜5個の小片に切断し、滅菌円錐管内の16〜20ミリリットルのDispace1DMEM培地中で皮膚片をインキュベートする。Dispaceとのインキュベーションの最初の30分間の間に、1つは断続的に反転によって円錐形チューブ内の皮膚片を混合する。その後、円錐形のチューブを摂氏4度に16〜18時間置きます。翌日、皮膚片を取り出し、乾燥した滅菌培養皿の上に置き、外表皮層が培養皿に触れるように各皮膚片を展開させる。組織の縁から始めて、2組の鉗子を使用して表皮を真皮から離す。分離した表皮断片を10センチメートルの培養皿中のHBSの5ミリリットルに加え、室温で10分間インキュベートする。次いで、HBS溶液を50ミリリットルの円錐管に集め、5ミリリットルのトリプシン中和緩衝液またはTおよびBを円錐管に加える。チューブを脇に置きます。培養皿中の表皮断片に3ミリリットルのトリプシン溶液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、トリプシンケラチノサイト溶液が濁るまで表皮断片を鉗子で穏やかに攪拌する。次にトリプシンケラチノサイト溶液をHBS TおよびBチューブに加える。未消化表皮断片をトリプシンEDTA溶液で溶解した後、トリプシンEDTA溶液を入れたHBS T及びBチューブに2ミリリットルのFBSを加え、2本を約870倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離した。次いで、上清を吸引し、細胞ペレットを3ミリリットルのケラチノサイト完全増殖培地に再懸濁し、続いて滅菌100マイクロメートルフィルターで細胞懸濁液を滅菌50ミリリットルの円錐管に濾過した。細胞数と細胞生存率が定量化されたら、培養プレートに細胞を播種し、5%の二酸化炭素中摂氏37度のインキュベーターに入れます。2日後、非接着細胞を吸引し、継代または下流実験のためにケラチノサイトが50〜80%コンフルエントに達するまで1日おきに細胞培養培地をリフレッシュする。5ミリリットルのDPBSを用いて、T25フラスコをポリ-l-リジンまたはPLLでプレコートし、プレコートフラスコを摂氏37度で3時間置く。その後、PLLコーティングマトリックスをDPBSで2回洗浄します。真皮の単離片を5ミリリットルのDMEM基礎培地で洗浄した後、真皮をはさみで小片に刻む。ミンチした真皮を摂氏37度で5ミリリットルのコラゲナーゼで2時間半消化し、真皮が完全に解離するまで30分ごとにピペットチップを使用して穏やかな滴定を行います。消化後、細胞懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーで濾過し、続いて濾過した細胞懸濁液を5ミリリットルの完全DMEM培地で希釈して、コラゲナーゼの酵素活性を停止した。次に細胞懸濁液を室温で5分間870倍Gで遠心分離し、細胞投票用紙を2ミリリットルのDMEM完全培地に再懸濁し、細胞を分裂させた。記載したように遠心分離プロセスを繰り返した後、上清を吸引し、細胞ペレットを使用してシュワン細胞または線維芽細胞を単離する。シュワン細胞を単離するには、細胞ペレットを5ミリリットルの新鮮なDMEM完全培地に再懸濁し、細胞数および生存率を定量してから、5ミリリットルの再懸濁細胞を予めコード化されたT25フラスコに4.0倍の密度で10ミリメートル当たり3つの細胞に播種する。フラスコを摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。16時間後、倍率10倍の顕微鏡観察により細胞接着を確認した。その後、非接着細胞を除去し、フラスコを5ミリリットルのDPBSで3回洗浄する。次に、DMEM完全培地中で5ミリリットルの10マイクロモルシトシンアラビノシドと共に細胞をインキュベートする。24時間後、前に実証したようにフラスコをすすぐ前にシトシンアラビノシド含有培地を吸引する。培養フラスコに5ミリリットルのシュワン細胞を補充し、培養培地を完成させ、シュワン細胞が80%のコンフルエントに達するまで1日おきに培地をリフレッシュしながら48時間培養する。線維芽細胞を単離するために、収集したペレットを5ミリリットルの線維芽細胞完全培地に再懸濁する。細胞を非コード化T25培養フラスコ中で、シュワン細胞について実証したように24時間培養した。非接着細胞を吸引し、フラスコを洗浄した後、細胞を5ミリリットルの新鮮な線維芽細胞完全培地と共に摂氏37度および5%二酸化炭素で48時間インキュベートする。単離された初代細胞をそれぞれの細胞培養培地で培養したところ、初代ケラチノサイトは7日目までに85%コンフルエントに達し、石畳形状で特徴的な細胞形態を示した。シュワン細胞は5日目までに95%の合流点に達し、双極性または三極の形をしたように見えた。線維芽細胞培養物は4日目までに95%コンフルエントに達し、ほとんどの細胞は紡錘体形状形態を示した。免疫蛍光染色により、細胞培養物中の細胞型特異的タンパク質発現を確認した。ケラチノサイトはK10およびK14タンパク質に対して陽性であった。ケラチン免疫蛍光とDAPI核染色のマージ画像は、細胞培養物の純度97.8%を示した。同様に、Schwann細胞はS100およびP75 NTRに対して陽性であり、培養において95.2%の純度を有していた。この線維芽細胞はビメンチンを陽性に発現したが、筋線維芽細胞マーカーであるα平滑筋アクチンを発現しなかった。培養物の純度は約97.2%であった Shanseの証拠を高めるために、プレコートされたポリ-l-リジン皿を使用することができる。そしてさらに繊維汚染を緩和するために、シトシンアラビノシドおよび抗真菌剤は、細胞が短時間添加した後に添加した。これは、単一のヒトの包皮から、シュワン細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞などの3つの初代細胞を確立するための簡単な安価な実験手順である。このプロトコルは、細胞細胞通信または細胞型間のクロストークを含むインビトロ実験に最適です。

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JoVE Journal

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神経科学

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学ぶヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞の単離・培養・特性評価法。酵素処理と細胞培養技術を用いて、創傷治癒や皮膚恒常性における細胞間相互作用を解析する基礎的プロトコルです。

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

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