Name: 菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶ菌従属栄養植物における真菌コロニー形成と種子の共生発芽の顕微鏡解析法。走査型・透過型電子顕微鏡や蛍光顕微鏡を用いて、植物組織内の菌根共生を可視化し、生態学的知見を得るための詳細プロトコルを解説する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、FAEPEXおよびFAPESP(2015/26479-6)からの資金提供に感謝する。MPPは、修士号奨学金(プロセス88887.600591 / 2021-00)とCNPqに感謝します。 JLSMは、生産性助成金(303664 / 2020-7)に対してCNPqに感謝します。著者らはまた、LME(電子顕微鏡研究所-IB /ユニキャンプ)、INFABiC(細胞生物学に適用されるフォトニクスに関する国立科学技術研究所-ユニキャンプ)、およびLaBiVasc(血管生物学研究所-DBEF / IB /ユニキャンプ)によって提供される機器と支援へのアクセスに感謝します。LAMEB(UFSC)およびエリアナ・デ・メデイロス・オリベイラ(UFSC)は、凍結保護プロトコルへの貢献に対して。TEMプロトコルへの貢献のためのLME。

<ol><li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvert%2C+RF+%22Esau%E2%80%99s+Plant+Anatomy%3A+Meristems%2C+Cells%2C+and+Tissues+of+the+Plant+Body%3A+Their+Structure%2C+Function%2C+and+Development%22">Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).</li>
<li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeung%2C+ECT+%22Plant+Microtechniques+and+Protocols%22">Plant Microtechniques and Protocols</a>. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).</li>
<li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+anatomy%3A+at+the+heart+of+modern+botany%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li>
<li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+myco-heterotrophic+%28%E2%80%98saprophytic%E2%80%99%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li>
<li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li>
<li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aImhof%2C+S+%22Mycoheterotrophy%22">Mycoheterotrophy</a>. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhiza%3A+implications+of+a+mycophagous+life+style%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+and+seedling+establishment+in+orchids%3A+a+complex+of+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li>
<li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination%3A+techniques+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Selbyana%22%5BJournal%5D)">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li>
<li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+%28Orchidaceae%29+and+its+implications+for+species-level+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li>
<li>Zhao, D. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152(2021).</li>
<li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+plants+that+feed+on+fungi%3A+facts+and+questions+about+mixotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li>
<li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerckx%2C+VSFT+%22Mycoheterotrophy%3A+The+Biology+of+Plants+Living+on+Fungi%22">Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi</a>. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).</li>
<li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Cytological+Staining+Techniques%3A+Theoretical+Background+and+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Macmillan+International+Higher+Education%22%5BJournal%5D)">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).</li>
<li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Fixation+for+Electron+Microscopy%22">Fixation for Electron Microscopy</a>. , Academic Press. New York, USA. (1981).</li>
<li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+preparation+and+staining+of+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22%5BJournal%5D)">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675(1991).</li>
<li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy%3A+basic+principles+and+trouble-shooting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li>
<li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+plant+cryosection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li>
<li>BeneŠ, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li>
<li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li>
<li>O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li>
<li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9todos+Histoqu%C3%ADmicos+Aplicados+%C3%A0s+Sementes%5BTitle%5D)+AND+%22Universidade+Federal+de+Vi%C3%A7osa%22%5BJournal%5D)">Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes.</a> Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).</li>
<li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearse%2C+AGE+%22Histochemistry%2C+Theoretical+and+Applied%22">Histochemistry, Theoretical and Applied</a>. , J & A Churchill. London, UK. (1960).</li>
<li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrade-Linares%2C+DR+%22Symbiotic+Endophytes%22">Symbiotic Endophytes</a>. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).</li>
<li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWymer%2C+CL+%22Confocal+Microscopy+Methods+and+Protocols%22">Confocal Microscopy Methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+de+T%C3%A9cnicas+Aplicadas+%C3%A0+Histopatologia+Vegetal%5BTitle%5D)+AND+%22FEALQ%22%5BJournal%5D)">Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698(2018).</li>
<li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22%5BJournal%5D)">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%3A+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).</li>
<li>Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurray%2C+S+%22Introduction+to+electron+Microscopy+for+Biologists%22">Introduction to electron Microscopy for Biologists</a>. , Academic Press. 3-18 (2008).</li>
<li>Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021).</li>
<li>Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeaton%2C+PT+%22Orchid+Propagation%3A+From+Laboratories+to+Greenhouses%E2%80%94Methods+and+Protocols%22">Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).</li>
<li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li>
<li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests%3A+Species+diversity%2C+functional+specificity%2C+and+new+species+from+the+tropics%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li>
<li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Introduction+to+Fungi%22">Introduction to Fungi</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589(2019).</li>
<li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li>
<li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332(2021).</li>
<li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoheterotrophy%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoheterotrophy%3A+The+Biology+of+Plants+Living+on+Fungi%22%5BJournal%5D)">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li>
<li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+JL+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22">Electron Microscopy of Plant Cells</a>. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

植物の解剖学と形態学における画像解析は、地下器官の研究6,40、種子の共生発芽の構造解析39、および空中および生殖構造41によって実証されるように、目的を達成し、マイコ従属栄養植物とその不可欠な真菌内生植物の関係を理解するのに役立つ重要な可能性を秘めています。.構造植物学は、過去10年間で植物科学の他の分野にその名声とスペースを失ったにもかかわらず1、質問に答え、発生、生態学、生理学、および進化に関連する新規性と必須の植物特性を明らかにするのに役立つという点で依然として顕著です。これらの方法は、MHプラント分析の重要な側面を考慮して、植物の構造研究の基礎となります。
MHプラントを注意深く収集するために重要な情報が提供されます, そうでなければ、よく発達した地下器官が損傷し、完全に収集されない可能性があるため.これらの構造物...

植物の形態学と解剖学を網羅する植物学の構造研究は、生物全体を理解する上で基礎であり1,2、植物の生態・生理・発生・進化に関する知識を統合し、貢献するために不可欠な視点を提供します3。植物の形態学と解剖学の方法は、現在、最近および1世紀以上前に開発されたプロトコル、機器、および知識で構成されています2。古典的な方法(光学顕微鏡など)の継続的な実行と適応は、より最近の技術(共焦点顕微鏡、X線マイクロトモグラフィーなど)と同じ本質的な基礎を持っています:方法論の開発を可能にする理論的知識。
植物の解剖学と形態学の主なツールは画像です。このような分析は単純な観察であるという誤解にもかかわらず、主観的な解釈にスペースを与えます2、この領域の画像を分析および理解するには、適用される方法(機器、分析の種類、方法論的手順)、細胞成分、組織化学、および植物体(組織の組織と機能、個体発生、形態学的適応)。さまざまな 方法で得られた画像を 解釈することで、形態と機能の相関、構造の化学組成の解読、分類群の記述の裏付け、植物病原体による感染の理解などにつながります。
菌従属栄養植物(菌根菌から炭素を得る非光合成植物4,5)を研究する場合、その構造適応、真菌による組織コロニー形成のパターン、および地下器官の形態解剖学的構造の顕著な側面は、それらの発生戦略と栄養素の源である菌糸との関係を啓発することができます。MH植物の地下器官は通常、土壌真菌との関連に関連する重要な適応を示すため、これらの解剖学的および形態学的調査を行うことが不可欠です6。MH種の空中器官は、菌根菌でなくても、これらの組織にも内生菌が存在する可能性があるため、無視してはなりません(個人的な観察、まだ公開されていません)。
菌根菌とMH種との関連がライフサイクル全体にわたって確立された必須性に加えて7、すべてのラン種は、独立栄養種でさえ、自然環境において最初の絶対的な菌従属栄養段階を持っています。これは、ランの胚が未分化であり、胚乳や子葉を欠いているため、真菌パートナーの栄養サポートなしに自然環境で発達および確立することができないために発生します4,8。それを考慮すると、共生発芽プロトコルはMH種だけでなく、光合成ランにも適用でき、発芽と原始球の発生におけるラン菌特異性を調査することを目的としており、絶滅危惧種の保全イニシアチブに広く適用されている方法論です9,10,11。
この方法の組み立てでは、解剖学的研究のためのMH植物サンプルの収集、固定、および保管(セクション1)、表面分析とサンプル選択(セクション2)、セクショニング方法(フリーハンド:セクション3、ミクロトミー:セクション4、クライオミクロトミー:セクション5)、染色とマウント(セクション6)、真菌内生植物の蛍光および共焦点顕微鏡(セクション7)、走査型電子顕微鏡(セクション8)、 透過型電子顕微鏡(セクション9)。さらに、ラン種子の共生発芽法(MHと独立栄養、セクション10)について述べ、前述のイメージング法は、発芽過程における種子、原球菌、および苗の真菌コロニー形成の分析にうまく適用できるためです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> 図1:イメージング方法の概略図。回路図は、それらが詳述されているプロトコルステップの指示を提供します。略語:GMA =グリコールメタクリレート、OCT =最適な切断温度化合物、SEM =走査型電子顕微鏡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここで詳細に説明する顕微鏡技術(図1)の前には、サンプルの収集、固定、脱水、埋め込み、および切片作成という重要なステップがあります。手順は選択した技術に応じて可変であるため(図1)、準備して収集サイトに輸送する固定液、固定前のサンプルの準備方法、使用する脱水プロセス(セクション1)、およびさまざまな埋め込みの可能性とセクショニング方法(セクション4、5、 および9)。 図1 は、以下に徹底的に説明する各顕微鏡技術に必要なすべてのステップを順番にまとめたものです。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>(SEMスタブ実装用)</td></tr><tr><td>寒天(AA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>(種子発芽試験用)</td></tr><tr><td>Calcofluor White Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909</td><td>蛍光色素(セルロース検出)</td></tr><tr><td>クエン酸緩衝液、0.09M pH 4.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2488</td><td>(トルイジンブルーO染色用)</td></tr><tr><td>導電性両面カーボンテープ</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-285-81</td><td>(SEM用)</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>(任意のモデル)</td></tr><tr><td>Copper Grids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4776</td><td>(TEM用)</td></tr><tr><td>臨界点乾燥機</td><td>バルザース</td><td></td><td>(任意のモデル)</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカバイオシステム</td><td></td><td>ズ(任意のモデル)</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカバイオシステム</td><td></td><td>ズ(=実体顕微鏡、任意のモデル)</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107960</td><td>顕微鏡用迅速封入剤</td></tr><tr><td>エチルアルコール、純(&ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>(=エタノール、脱水プロセス用)</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液、37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>(NBF溶液調製用)</td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>組織組織固定ゼ</td></tr><tr><td>ラチンカプセル、TEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-248-71</td><td>用(TEM樹脂重合用)</td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td> <td>(スライド調製用に希釈 - OCT 接着)</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液、25%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>(カルノフスキー用)溶液調製)</td></tr><tr><td>HistoResin</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702231731</td><td>グリコールメタクリレート(GMA)包埋キット</td></tr><tr><td>ヨウ素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207772</td><td>(ルゴール溶液調製用)</td></tr><tr><td>硝酸鉛(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td>Pb(NO3)2(TEMコントラスト染色用)</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td>(任意のモデル)</td></tr><tr><td>LR白色アクリル樹脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9774</td><td>TEM用親水性アクリル樹脂</td></tr><tr><td>Lugol溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62650</td><td>(染色用)</td></tr><tr><td>試料マウント用金属スタブ</td><td>Rave Scientific</td><td></td><td>(SEM用、異なるモデル)</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td></td><td>手動ロータリーミクロトームまたは他のモデル</td></tr><tr><td>オートミール寒天(OMA)</td><td>ミリポア</td><td>O3506</td><td>(種子発芽試験用)</td></tr><tr><td>OCTコンパウンド、Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>凍結組織用包埋培地</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>OsO4(TEM後固定用)</td></tr><tr><td>パラフィルムM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>シーリング熱可塑性フィルム</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>(カルノフスキー用)</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液、0.1% H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>(スライド調製用 - OCT接着用)</td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425</td><td>poly-L-lysine coated glass slides</td></tr><tr><td>ポリエチレン成形カップトレイ</td><td>Polysciences</td><td>17177A-3</td><td>(6x8x5 mm, for embembembing samples in GMA resin)</td></tr><tr><td>ポリエチレンモールディングカップトレイ</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td>(13x19x5 mm、GMA樹脂にサンプルを埋め込むため)</td></tr><tr><td>ヨウ化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td>(ルゴール溶液調製用)</td></tr><tr><td>ジャガイモデキストロース寒天(PDA)</td><td>ミリポア</td><td>70139</td><td>(種子発芽試験用)</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>全円</td><td></td><td>(任意のモデル)</td></tr><tr><td>シラン[(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>(スライド調製用-OCT接着用)</td></tr><tr><td>シラン準備スライド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4651</td><td>ガラススライド</td></tr>、シ<tr><td>ランシリカゲルオレンジ、粒状</td><td>Supelco</td><td>10087</td><td>(乾燥プロセス用)</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>(グルタルアルデヒド-カコジル酸ナトリウム緩衝液用)</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>NaOH (カルノフスキー用)次</td></tr><tr><td>亜塩素酸ナトリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td>NaClO(種子表面消毒用)</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水リン酸ナトリウム</td><td></td><td>71640</td><td>Na2HPO4(NBF溶液およびPB調製用)</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4&middot;H2O(NBF・PB用)</td></tr><tr><td>スパッタコーター</td><td>バルザース</td><td></td><td>(任意の機種)</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>C12H22O11(凍結防護・発芽試験用)</td></tr><tr><td>スーダンIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4131</td><td>(染色用)</td></tr><tr><td>スーダンIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198102</td><td>(染色用)</td></tr><tr><td>スーダンブラック B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>199664(染色用)</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td></td><td></td><td>(3 mL、任意のブランド、TEM造影剤染色用)</td></tr><tr><td>シリンジフィルターユニット、Millex-GV 0.22 &micro;m</td><td>ミリポア</td><td>SLGV033R</td><td>PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌済み(TEMコントラスト染色用)</td></tr><tr><td>Tek Bond Super Glue 793</td><td>Tek Bond Saint-Gobain</td><td>78072720018</td><td>液体シアノアクリレート接着剤、中粘度</td></tr><tr><td>トルイジンブルー O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td>(染色用)</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>全電子</td><td></td>(<td>任意のモデル)</td></tr><tr><td>トリフェニルテトラゾリウム塩化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td>(種子発芽のテトラゾリウム試験用)</td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td>Na3(C6H5O7)&middot;2H2O(TEM造影剤染色用)</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカバイオシステム</td><td></td><td>ズ(機種不問)</td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>18-607-645</td><td>UO2(CH3COO)2(TEM造影剤用)</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td></td><td></td><td>(機種不問)</td></tr><tr><td>コムギ胚芽凝集素、 Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>W11261</td><td>蛍光色素標識レクチン(シアル酸およびN-アセチルグルコサミニル残基を検出)</td></tr></tbody></table>

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

構造植物学は、植物の生態、生理、発達、進化を完全に理解するために不可欠な視点です。菌従属栄養植物(菌類から炭素を得る植物)を研究する場合、その構造適応、菌類による組織コロニー形成のパターン、地下器官の形態解剖学的構造などの顕著な側面は、その発生戦略と栄養源である菌糸との関係を解明することができます。共生菌のもう一つの重要な役割は、ランの種子の発芽に関連しています。すべてのラン科種は、発芽および実生段階(初期マイコヘテロトロフィー)の間に菌従属栄養性であり、成虫段階で光合成するものでさえあります。ランの種子には栄養貯蔵が不足しているため、真菌共生生物は基質を提供し、発芽を可能にするために不可欠です。構造的な観点から発芽段階を分析することは、真菌と種子との相互作用に関する重要な質問に答えることもできます。この記事で提案されているように、植物組織中の真菌内生植物を明らかにするために、さまざまなイメージング技術を適用できます。植物器官のフリーハンドおよび薄い切片を染色し、光学顕微鏡を使用して観察することができます。小麦胚芽凝集素に結合した蛍光色素を真菌に適用し、Calcofluor Whiteと共生して、共焦点顕微鏡で植物細胞壁を強調することができます。さらに、菌従属栄養ランの走査型および透過型電子顕微鏡の方法論が詳述されており、そのようなプロトコルを関連植物に適用する可能性が探求されています。ラン種子の共生発芽(すなわち、菌根菌の存在下で)は、光、共焦点、および電子顕微鏡による分析のために発芽の異なる段階から得られた構造を調製する可能性とともに、プロトコルに詳細に記載されている。

植物組織を固定する重要な段階に続いて、細胞成分および組織の形態、体積、および空間的組織を考慮して、生きている状態に可能な限り類似した細胞構造をもたらす16。化学的固定後のサンプルでそのような特性を観察します(図4)。図4C-Fは、光学顕微鏡下で適切に固定されたサンプルを表しています。説明されている固定手順に従い、サンプル構造に精通することは、固視の成功を分析するのに役立ちます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig04.jpg"> 図4:MHランWullschlaege...

このプロトコルは、菌根菌で発芽した植物組織および種子における真菌コロニー形成を研究するために、走査型および透過型電子顕微鏡、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を適用して、マイコ従属栄養植物サンプルを収集、固定、および維持するための詳細な手順を提供することを目的としています。

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

このプロトコルは、サンプルの収集から調製まで、真菌従属栄養植物の真菌コロニー形成を理解するために適用される多様な顕微鏡技術を提示し、重要なステップを含みます。このような技術は、様々な菌従属栄養植物に適用することができ、さらには菌従属栄養植物以外の植物の材料にも適用することができる。この方法は主に構造植物学に関連しており、菌根相互作用、生理学、生殖生物学、進化、および菌従属栄養植物の生態学への洞察も提供する可能性があります。はじめに、地下器官を傷つけないように注意しながら、植物ベースの周りの土壌を探索することによって、菌従属栄養植物を集めます。また、地下の臓器から空中の臓器が外れないように、植物を地面から引っ張ることは避けてください。慎重に、ガーデニングこてを使用して空中構造物を掘り起こし、根、茎、根茎、貯蔵器官などの地下器官を損傷することなく探索します。汚れやすい構造を保存するために土壌粒子を取り除き、サンプルを固定する前に、これらの臓器を水道水で繊細に洗い流して残りの土壌粒子を洗い流します。落葉に関連する菌従属栄養植物は特別な注意を必要とします。したがって、分解材料に接続されている繊細な臓器を、接続された構造から引っ張ることなく、菌糸を通して慎重に収集します。そのような接続を持つ構造を保存し、分析のためにゴミを集めます。透過型電子顕微鏡分析では、厚さ3〜4ミリメートルのサンプルをグルタルアルデヒドカコジル酸ナトリウムバッファーの滴の中に入れて、厚さ1〜2ミリメートルの小さな切片に分割します。ドロップの外側のカットエッジを破棄します。植物の収集直後に収集場所で固定プロセスを実施するようにしてください。添加剤の固定液であるため、サンプルの体積の10倍以上の固定液の量を持つ収集チューブに切片を直ちに移します。臓器、特に地下のものや落葉と接触している臓器の表在菌糸の表面分析用。新鮮な材料または固定された材料を解剖顕微鏡で7.5倍以上の倍率で観察します。表在性菌糸と根茎によって導かれる関心のある領域を検索します。表面根茎の領域を含むサンプルを選択して、根と茎の皮質細胞内のペロトンと菌糸コイルを視覚化することができます。テキスト原稿に記載されているように、小麦胚芽凝集フルオロクロムコンジュゲートのミリリットルあたり0.2ミリグラムと0.1モルのリン酸緩衝液中の1%カルコフルオロア白色溶液を調製します。次に、スライドガラス上の切片を小麦胚芽凝集活性色素コンジュゲート溶液で30分間適切に覆ってインキュベートします。インキュベーション後、切片を0.1モルのリン酸緩衝液で洗浄し、封入媒体としてカルコフルール溶液中でインキュベートします。次に、スライドにカバースリップを置き、指示されたフィルターを使用して共焦点または蛍光光学顕微鏡で観察します。サンプルを固定し、脱水を行い、70

microscopy-techniques-for-interpreting-fungal-colonization

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、成長し、質的に、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡により真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムを分析するための新しい方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

&gt;jove_content&lt;走査型電子顕微鏡観察のための生物学的サンプルの処理における問題には、細胞の崩壊、湿った微小環境からのサンプルの処理、および細胞破壊が含まれます。ここでは、花分裂組織、卵分裂組織、真菌(Agaricales)などの困難なサンプルの調製に適した低コストで比較的迅速なプロトコルをまとめ、詳細に説明しています。...

問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

ここで重要な薬理学的細菌属放線菌の表現型解析を開始する研究者紹介初心者のためのプロトコル。...

放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。...

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。...

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

マイクロCTは、植物の構造を3次元で解析できる非破壊ツールです。本プロトコルは、寄生植物の構造と機能を分析するためにマイクロCTを活用するためのサンプル調製について説明しています。特定の調製物と組み合わせた場合のこの方法の利点を強調するために、異なる種が使用される。...

マイクロCTスキャンを活用して寄生植物と宿主の相互作用を解析

ここでのプロトコルでは、アーバスキュラー菌根のコロニー形成パターンの評価方法と、 Zea mays と Festuca...

フェストゥカルブラとゼアメイズの根におけるコロニー形成パターンと真菌戦略を探索するためのツールとしての菌根マップ

土壌の不透明度のために、その構成微生物間の相互作用は、細胞分解能で容易に視覚化することができない。ここでは、真菌と微生物の相互作用を調査するための新しい機会を提供する2つのマイクロ流体ツールを紹介します。これらのデバイスは汎用性と使いやすさを備えており、細胞レベルでの高時空間制御と高解像度イメージングを可能にします。...

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。...

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

ここでは、高吸水性ポリマーベースの独立栄養系でアーバスキュラー菌根菌を接種および観察するためのシンプルで安価な技術について説明します。...

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

学ぶ菌従属栄養植物における真菌コロニー形成と種子の共生発芽の顕微鏡解析法。走査型・透過型電子顕微鏡や蛍光顕微鏡を用いて、植物組織内の菌根共生を可視化し、生態学的知見を得るための詳細プロトコルを解説する。

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

さらに動画を探す