Name: ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶショウジョウバエ卵子形成期における基底膜タンパク質の分極細胞内輸送と分泌の可視化法。Airyscan超解像顕微鏡を用いて高解像度イメージングを実現し、上皮細胞の動態解析に貢献します。

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著者は、原稿に関する彼女の有益なコメントのためにジュリー・マークルに感謝しています。この研究は、NIHの助成金R15GM137236からO.D.への支援を受けた。共焦点および超解像画像は、NSF MRIグラント2018748で購入したAiryscan 2を搭載したツァイスLSM 900を使用して取得されました。

著者らには開示するものは何もありません。

BMは、胚および器官の形態形成、ならびに成人の生理学的機能にとって重要である。さらに、BMは、上皮極性の確立および維持のためのシグナル伝達プラットフォームとして機能し、組織に支持体2を提供する。しかし、BMタンパク質の適切な配置を調節するメカニズムはほとんど理解されていない。BMタンパク質の細胞内輸送および分極分泌に特化した生物学的経路をよりよく理解するには、これらの経路の構成要素およびBMプロセシングにおけるそれらの役割の慎重な分析が必要である。これを実現する1つの方法は、共焦点イメージングと超解像イメージングを使用することです。ここでは、共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡を用いてFE中のBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を効率的に画像化するための ショウジョウバエ 卵巣の調製および染色または免疫染色の方法について説明した。
野生型および変異型条件下でのBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化するためのタンパク質トラップおよび内因性タグ付きタンパク質の利点 提供されたプロト...

基底膜(BM)は、上皮構造および形態形成に重要な層状細胞付着性細胞外マトリックス(ECM)の薄いシートである1。それは〜50のタンパク質を含み、上皮および内皮細胞の根底にある遍在的に見出され、そして骨格、平滑、および心筋細胞および脂肪細胞を包み込む1,2,3。上皮細胞の基底側にあるBMの3つの主要成分は、コラーゲンIV、ペルレカン、およびラミニンである。BMは上皮細胞の根底にあり、組織の分離と障壁、成長と支持、細胞分極2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12を含む多くの機能を担当しています。.シグナル伝達プラットフォームとしてのその役割は、発生中の上皮細胞および組織の形態および分化を調節する3、13、14。さらに、BMの誤った調節および/またはその完全性の侵害は、腫瘍転移を含む多くの病理学的状態の主な原因である2,15,16。組織および器官の形態形成中にBMによって実行される本質的な機能にもかかわらず、BMタンパク質の分極細胞内輸送および分泌に捧げられた生物学的経路の構成要素は漠然と知られている。
BM含有小胞の細胞内輸送および上皮細胞によるBMタンパク質の分泌を研究するために、ショウジョウバエ卵巣の濾胞上皮(FE)は強力なモデル系である(図1)。ショウジョウバエの卵巣は、卵巣と呼ばれる16〜20個の長い管状の構造を含む(図1A、B)17、18、19。各卵巣は卵組立ラインと考えることができ、成熟した卵が卵管を通って出るまで、前端から始まり後方に移動する卵室(それぞれが卵を生じる)の年齢進行を伴う。各卵室は、中央生殖細胞系列細胞(GC)を囲む体細胞卵胞細胞(FC)の単層であるFEによってカプセル化されている。FEは、頂端ドメインが生殖細胞系列に面し、BMタンパク質が基底的に分泌される明確な頂端 - 基底極性で高度に分極している18,19。FCは、コラーゲンIV、ペルレカン、ラミニン20,21を含むBMの主要成分のすべてを積極的に分泌します。FCなどの上皮細胞では、BM成分が産生され、細胞外に沈着するために特殊な分極分泌経路を必要とする。例えば、BMの最も豊富な成分であるコラーゲンIV(Coll IV)の場合、その産生および沈着が多くの研究の焦点であるにもかかわらず、その分極した細胞内輸送および分泌を取り巻く詳細は曖昧である。コルIVは小胞体(ER)に翻訳され、ここでも各線維−3つのポリペプチド(2つのα1鎖および1つのα2鎖)からなる−が三重らせん22に組み立てられる。適切なコルIVの折り畳みおよび機能には、PlodおよびPH4αEFB20、22、23、24、25、26などのリジルおよびプロリルヒドロキシラーゼを含むERシャペロンおよび酵素が必要である。これらの翻訳後酵素は、それぞれの喪失がコルIVを基底ER 20、23、24、25、26に捕捉させるので、コルIVのER選別を調節する。次いで、新たに合成されたコルIVは、COPII被覆小胞においてゴルジ体に対するERを出る。貨物受容体Tango1は、コラーゲンを大きな多量体タンパク質を収容できる大きなゴルジ結合小胞に包装するのに役立ちます20,27。Coll IVが細胞内外膠細胞小胞にパッケージ化されると、上皮細胞から基底的に特異的に分泌される。BM沈着を基底側に向けるために、上皮細胞は、偏光BM分泌に特異的に捧げられた別の因子セットを必要とする。ショウジョウバエ卵巣のFEを用いて、ヌクレオチド交換因子(GEF)CragおよびStratum、GTPaseRab8およびRab10、ならびにホスホイノシチドPI(4,5)P2、ならびにキネシン1および3モータータンパク質20、28、29、30、31のレベルを含む、この新規な細胞プロセスのいくつかの成分が特徴付けられている20、28、29、30、31.これらの成分は、BMタンパク質の偏光分布を確実にする上で重要である。
FEにおけるBMタンパク質の細胞内局在をモニターするために、内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質(タンパク質トラップ)、例えばバイキング−GFP(Vkg−GFPまたはα2コールIV−GFP)およびペルレカン−GFP(Pcan−GFP)32、33を使用することができる。これらのタンパク質トラップラインは、BMタンパク質の内因性分布を正確に反映し、小胞トラフィッキングのより高感度な検出を可能にすることが示されている28,30。FEにおけるBMの偏光沈着に関与する成分は、Vkg−GFPおよびPcan−GFP20、28、29、30についてのタンパク質トラップラインを用いて最初に特徴付けられた。タンパク質トラップは、変異体およびGal4系統34を含む異なる遺伝的背景において使用することができる。さらに、タンパク質トラップを蛍光色素および/または蛍光免疫染色と組み合わせて使用することができ、野生型および変異型条件を比較する際にBMタンパク質の局在の正確な特性評価を可能にする35。
BMタンパク質含有小胞の分布および局在を正確かつ効率的に評価するために、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)および超解像イメージング技術は、他のイメージングアプローチに大きな利点を提示する。これらのアプローチは、高解像度イメージングと比較的使いやすさを兼ね備えています。CLSMは、ガルバノメータを使用してラスタースキャン方式で試料をレーザーでスキャンすることにより、光学分解能を向上させる顕微鏡技術です。ピンホール開口部は、共焦点顕微鏡のコアコンポーネントです。焦点面の上または下から来る焦点ずれ信号を遮断することによって、ピンホール開口部は、z軸36において非常に優れた分解能をもたらす。これはまた、一連の光学セクションに対応するzスタックと呼ばれるz平面内の一連の画像を得ることを可能にする。zスタックはその後、イメージングソフトウェアの助けを借りて、3D再構成を介して標本の3D画像を作成します。従来の落射蛍光(広視野)顕微鏡は、共焦点顕微鏡とは異なり、焦点の合わない光が画質に寄与し、画像の解像度とコントラストを低下させる36,37。これにより、落射蛍光顕微鏡は、タンパク質の局在化または共局在を研究する際の魅力の低い候補になります。
CLSMは、BMタンパク質の細胞内輸送のイメージングや特性評価など、さまざまなアプリケーションに適したアプローチですが、アッベの回折限界(200-250nm)未満のサンプルをイメージングする場合、依然として問題となります。このようなサンプルを画像化する場合、共焦点顕微鏡は、特にオイル対物レンズを使用する場合、高解像度をもたらし得る。しかし、超解像技術は共焦点顕微鏡の限界を超えています。超解像顕微鏡法を実現するにはさまざまなアプローチがあり、それぞれに特定の分解能限界があり、それぞれが異なる分析に適しています。これらのアプローチには、光活性化局在化顕微鏡(PALM)または確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、誘導放出枯渇顕微鏡(STED)、構造化照明顕微鏡(SIM)、およびエアリスキャン(超解像)顕微鏡38、39、40、41、42、43、44、45、46が含まれる。.Airyscanの解像度はPALM/STORM、STED、SIMよりも粗いですが、最大120nm(CLSMの約2倍の解像度)の解像度を達成できます。さらに、この超解像顕微鏡アプローチは、厚いサンプルおよび低い信号対雑音比のサンプルをイメージングする際に、SIMおよび他の超解像技術よりも有利であることが示されている47,48。
Airyscanは、比較的新しい超解像共焦点顕微鏡技術46である。ピンホール検出器とシングルポイント検出器を使用して焦点の合っていない光を除去する従来のCLSMとは異なり、この超解像アプローチは、すべてのスキャン位置45ですべての光を収集する32チャンネルガリウム砒素リン化物(GaAsP)光電子増倍管面積検出器を使用します。32個の検出器のそれぞれは小さなピンホールとして機能し、ピンホールのサイズを従来の1.0エアリーユニット(A.U.)から強化された0.2A.U.に縮小し、直径1.25A.U.の効率を維持しながら、さらに高い分解能と信号対雑音比を可能にします45。さらに、Airyscanで使用される線形デコンボリューションは、分解能45を最大2倍増加させます。これを考慮に入れると、CLSM、特に超解像顕微鏡は、局在化および共局在研究のための非常に高い解像度の画像を生成することができるため、BMタンパク質およびBMタンパク質の基礎沈着を調節するタンパク質の研究に適しており、それによってこれらのプロセスを制御する空間的、時間的、および分子的事象に新しい洞察を提供する。
局在化実験の実行に使用できる共焦点顕微鏡の代替アプローチは、画像デコンボリューションである。広視野顕微鏡は、焦点の合っていない光が検出器に到達することを可能にするので、広視野顕微鏡によって得られた画像から焦点の合っていない光を除去または再割り当てするために、数学的および計算的デコンボリューションアルゴリズムを適用することができ、それによって、画像49の解像度およびコントラストを改善することができる。デコンボリューションアルゴリズムは、共焦点画像にも適用して、解像度およびコントラストをさらに高め、超解像顕微鏡50のそれにほぼ匹敵する最終画像を生成することができる。Airyscanは、シェパードのピクセル再割り当てとともにワイナーフィルタベースのデコンボリューションを利用し、空間分解能と信号対雑音比を大幅に改善します。共焦点顕微鏡と比較して、この超解像顕微鏡技術を使用すると、3つの空間寸法(xおよびyで120nm、zで350nm)すべてで分解能が2倍の増加が観察される45,51。
この原稿は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEを共焦点および超解像顕微鏡と組み合わせたモデルシステムとして使用して、BMタンパク質の細胞内輸送および沈着を染色、取得、および視覚化するための詳細かつ最適化されたプロトコルを提供する。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質、例えばVkg−GFPおよびPcan−GFPを発現する ショウジョウバエ 系統は、BMタンパク質の輸送および分泌を視覚化するための効率的かつ正確なツールである。さらに、それらは、突然変異体および Gal4/UAS 系統34を含む異なる遺伝的背景において容易に使用することができる。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質が推奨されるが、特定のBMタンパク質に対する抗体の使用もまた、記載されたプロトコールと適合性がある。これらのプロトコルは、共焦点および超解像イメージングを使用して、細胞内輸送および無傷の上皮組織におけるBMタンパク質の分泌を研究することに関心のある科学者にとって特に有用である。さらに、上皮組織分析と ショウジョウバエ 遺伝学の広範なツールを組み合わせる能力は、このアプローチを特に強力にします。最後に、これらのプロトコルは、水疱輸送および関心のある他のタンパク質の選別を研究するために容易に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 ファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>F-アクチン染色剤 (1/500 of 66&micro;M)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>F-Actin Stain (1/100 of 66&micro;M))</td></tr><tr><td>抗GM130</td>抗体<td>abcam</td><td>ab30637</td><td>ゴルジ染色用(共局在化);7μの濃度として使用。g/uL</td></tr><tr><td>アクアポリマウント</td><td>・ポリサイエンス</td><td>1860620</td><td>マウンティング ミディア</td></tr>ム <tr><td>パン酵母 (活性ドライイースト)</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>62-103</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (30% 溶液)</td> シ<td>グマ アルドリッチ</td><td>A7284</td><td>ブロッキング溶液用</td></tr><tr><td>うつ病井戸</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>7156101</td><td>解剖用 (ガラス凹面スライドを代わりに使用できます)</td></tr><tr><td>解剖針</td><td>Fisher scientifc</td><td>13-820-024</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubator</td><td>Genesee Scientific/Invictus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td><td></td><td></td><td>Morin et al., 2001</td></tr><tr><td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line of the HMS00241)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>33594</td><td>RNAi against Crag</td></tr><tr><td>フライストック:Viking-GFP ショウジョウバエ系統 (CC00791)</td><td></td><td></td><td>Buszczak et al., 2007</td></tr><tr><td>フライストック: Vkg-GFP, tj-Gal4</td><td></td><td></td><td>Devergne et al., 2017.FE</td></tr><tr><td>鉗子(Dumont 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>For dissection</td></tr><tr><td>Glass Concavity Slide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7187804</td><td>For dissection(代わりにうつ病ウェルを使用することができます)</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG、Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td>二次<td>抗体(GM130抗体)(5 &micro;g/mL)</td></tr><tr><td>Hoechst (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>DNA Stain (1 ug/mL)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>Fisher Scientific: 06-666</td><td>デリケートタスクワイパー</td></tr><tr><td>ライカ蛍光体顕微鏡&nbsp;M165 FC</td><td>ライカ</td><td></td><td>卵巣イメージング</td></tr><tr><td>用 顕微鏡スライド</td><td>コーニング</td><td>294875X25</td><td>顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>ニューティングプラットフォームロッカー</td><td>コーニングライフサイエンス</td><td>6720</td><td>卵巣固定および染色用</td></tr><tr><td>ニュートリフライBF</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>66-121</td><td>フライフード</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 20% 溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>フィッシャーサイエンティフィック:15713</td><td>PFA 4%</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水錠</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP2944100</td><td>PBS溶液</td></tr><tr><td>用 ProLong ガラス 退色防止封入剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td>マウンティング ミディアム</td></tr><tr><td>スクエアカバーガラス</td><td>コーニング</td><td>285022</td><td>顕微鏡スライド用カバーガラス</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>PBST用</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900 と Airyscan 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共焦点および超解像顕微鏡</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 305 実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>Zeiss Zen ソフトウェアバージョン 3.3 (ブルーエディション)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>画像の取得と処理</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

基底膜(BM)は、上皮細胞の基底側に存在する細胞外マトリックスの特殊なシートであり、上皮組織の形態および器官形態形成の確立および維持に重要である。さらに、BMは組織モデリングに不可欠であり、シグナル伝達プラットフォームとして機能し、組織および器官を形成するための外力を提供する。正常な発達および病理学的状態においてBMが果たす多くの重要な役割にもかかわらず、BM含有小胞の細胞内輸送を制御する生物学的経路および基礎分泌がBMタンパク質の分極沈着にどのようにつながるかはほとんど理解されていない。 ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮は、BMのすべての主要成分を産生および分泌するため、BM膜タンパク質の基礎沈着を研究するための優れたモデルシステムです。この記事では、 ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮に内因的にタグ付けされたタンパク質を使用して、BM含有小胞および沈着BMを染色およびイメージングするための詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルは、定性的および定量的問題の両方に対処するために適用することができ、ハイスループットスクリーニングに対応するために開発され、上皮組織発達中の分極細胞内輸送および小胞の分泌に関与する因子の迅速かつ効率的な同定を可能にする。

本明細書に記載の方法は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEなどの分極上皮細胞におけるBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を効率的かつ正確に画像化し、特徴付けるために使用することができる。次に、上記の方法を使用して得られた予想される結果と、有用なアドバイスと潜在的な落とし穴を提供します。そうするために、内因的にタグ付けされたVkg(ショウジョウバエ ・コルIV)であるVkg−GFPが使用される。しかしながら、Pcan−GFPのような他の内因的にタグ付けされたBMタンパク質でも同じ結果を達成することができる。
最適な集録パラメータの設定(図2) 上皮細胞におけるVkgおよびPcanなどのBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を正確に特徴付けるためには、提供された方法に記載されているように共焦点顕微鏡の取得パラメータを適切に設定することが極めて重要である。
共焦点顕微鏡法...

基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

このプロトコルは、ショウジョウバエアレイをモデル系として用いて基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌の特性評価を可能にする。我々の技術の主な利点は、内因性にタグ付けされたタンパク質およびAiryscan超解像顕微鏡法を用いて、基底膜タンパク質の細胞内輸送の高解像度イメージングを可能にすることである。このプロトコルは基底膜タンパク質の細胞内輸送を画像化するために開発されているが、関心のある他のタンパク質および細胞培養およびオルガノイドを含む他の生物学的系の輸送を研究するために拡張することができる。まず、解剖スコープでPBS中のショウジョウバエ卵巣を解剖した後、1ミリリットルの固定溶液を加え、卵巣をナットプラットフォームに15分間固定する。固定溶液を取り出し、それぞれ1ミリリットルのPBSTで2回のクイック洗浄を行う。微量遠心チューブを5〜6回静かに反転させてから、ナットプラットフォームロッカー上で1ミリリットルのPBSTでそれぞれ10分間の長い洗浄を4回行います。固定と洗浄を行った後、PBSTを除去し、1ミリリットルのブロッキング溶液を加え、栄養プラットフォームロッカーで卵巣を最低1時間ブロックします。次に、ブロッキング溶液を取り出し、ブロッキング溶液中に適切な濃度で希釈された一次抗体を含む一次抗体溶液を300マイクロリットル加える。摂氏4度のナットプラットフォームロッカーで一晩インキュベートします。一次抗体溶液を除去した後、前述のように、2回のクイック洗浄と4回の長時間洗浄を行い、PBSTを除去し、使用した一次抗体を検出する蛍光二次抗体を含む500マイクロリットルの二次抗体溶液を加える。二次抗体溶液中の卵巣をナットリングプラットフォームロッカー上で室温で2時間インキュベートし、その後、ナットプラットフォームロッカーで以前に実証したように、PBSTで2回のクイックウォッシュと4回のロングウォッシュを実行します。最後の洗浄後、P-1000ピペットを使用して卵巣をチューブ内で上下に静かにピペットでピペットし、卵室を分離します。チューブを5〜10分間直立姿勢に保ち、卵室を底に沈ませます。次に、パスツールピペットを使用してPBSTを除去し、約50マイクロリットルを残します。その後、P-200ピペットを使用して残りのPBSTをできるだけ多く取り除き、カバースリップ上に均等に広がるのに十分な2滴のマウント媒体を追加します。粘性マウント媒体を微量遠心チューブからスライドに簡単に移送できるようにするには、P-200ピペットチップの端を切り取ります。次に、取り付け媒体内のすべての卵室をスライドガラスにゆっくりと移し、気泡を発生させないようにします。解剖顕微鏡下で、新しいP-200ピペットチップまたは鉗子を使用して、カバースリップのほぼサイズの領域をカバーするために、取り付け媒体

confocal-super-resolution-imaging-polarized-intracellular-trafficking

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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