1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19のハイスループット多重化スクリーニング
2022年7月5日
1型糖尿病、セリアック病、コロナウイルス病2019のスクリーニングの緊急の必要性に沿って、4つの膵島自己抗体、組織トランスグルタミナーゼ自己抗体、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2の受容体結合ドメインに対する抗体をすべて同時に検出するハイスループット6-Plex電気化学発光アッセイを開発しました。
新しい6-Plex ECLアッセイは、検証され、現在、一般集団スクリーニングの臨床試験に適用されている最初のマルチプレックスアッセイです。1型糖尿病、セリアック病、COVID-19を大規模な集団でスクリーニングするのに適した6つの自己抗体アッセイを同時に組み合わせています。現在の標準的な自己抗体アッセイと比較して、この技術は、複数の自己免疫疾患に対する複数の自己抗体を同時により効率的にスクリーニングすることができる。
この技術の意味は、大規模なスクリーニングをより実行可能で疾患特異的なものにし、予防のための早期疾患予測と治療のためのより正確な診断につながります。まず、4マイクロリットルのビオチン化GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原タンパク質を156マイクロリットルの1%BSAを含むチューブに加え、240マイクロリットルの対応するストレプトアビジン結合リンカー1、2、3、8、9、および10と混合します。次いで、混合物を室温で30分間インキュベートする。
160マイクロリットルの停止液を各チューブに分注し、混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、各チューブから400マイクロリットルの混合溶液を取り出し、それらを混ぜ合わせます。4マイクロリットルのルテニウム標識GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原を混合物に追加します。
次に、1.6ミリリットルのストップ溶液と3.2ミリリットルのPBSを追加します。すべての成分をよく混ぜます。そして今、抗原溶液はアッセイで使用する準備ができています。
96ウェルPCRプレートの場合、ウェルあたり7マイクロリットルの血清を分注し、プレートをシーリングフィルムで覆います。次に、血清をPCRマシンで摂氏56度で30分間予熱し、プレートを100倍Gで1分間短時間遠心分離します。調製した抗原溶液をウェルあたり63マイクロリットル加え、血清と混合し、PCRプレートをシーリングホイルで覆い、光を避けます。
プレートをシェーカー上で450rpmの速度で室温で2時間振とうする。次に、プレートを摂氏4度で18〜24時間インキュベートします。摂氏4度の冷蔵庫から6プレックスプレートを取り出し、プレートを室温に戻します。
次に、150マイクロリットルの3%ブロッカーAを6-Plexプレートの各ウェルに追加します。光を避けるためにプレートをホイルで覆います。プレートを摂氏4度の冷蔵庫に戻し、一晩インキュベートします。
インキュベーションの最後に、プレートが冷蔵庫から取り出されたら、プレートからすべてのバッファーを取り出します。プレートをペーパータオルの上に軽くたたいて乾かし、毎回ウェルあたり150マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。プレートをペーパータオル上で乾燥させ、一晩インキュベートPCRプレートの各ウェルから30マイクロリットルの血清抗原インキュベートを6-Plexプレートの2つのウェルに分注します。
プレートをホイルで覆い、プレートシェーカーに置き、室温で450rpmの速度で1時間振とうします。6-Plexプレートに存在する溶液をダンプし、ウェルあたり150マイクロリットルの0.4 M塩化ナトリウム洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。3回目の洗浄が完了したら、プレートをペーパータオルで乾かし、150マイクロリットルの読み取りバッファーを各ウェルに加えます。
6-Plex ECLアッセイからのGADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA、およびCOVID-19Aに対する6つの自己抗体のレベルは、対応する6つの単一ECLアッセイおよび現在の標準的な放射性結合アッセイとよく相関していました。6つの抗体全てについて各サンプルについての指標値を、対応する陽性および陰性対照に対して計算した。カットオフ値よりも大きい指標値が観察され、これは肯定的な結果を示した。
血清中の自己抗体は、ビオチン化抗原に対するルテニウム標識抗原を破り、特異的リンカーとの複合体を形成してマルチプレックスプラットフォームを構築した。この戦術により、1型糖尿病および付随する疾患の一般集団における大規模なスクリーニングがより実行可能かつ効率的になり、疾患の早期予測と予防につながります。
概要
本研究では、1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19に関連する自己抗体を同時に検出するために設計された、新規の6-Plex電気化学発光アッセイを提示します。このアッセイは、これらの自己免疫疾患の大規模スクリーニング効率を向上させることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 自己免疫
- 臨床診断
- 電気化学発光法
背景
- 1型糖尿病とセリアック病は、早期発見が必要な自己免疫疾患である。
- COVID-19により、自己免疫疾患のスクリーニングにおいて新たな課題が生じている。
- 現在のスクリーニング方法は、効率が悪く時間がかかることが多い。
- マルチプレックスアッセイを用いることで、複数の抗体を同時に検査でき、スクリーニング能力を向上させることができる。
研究目的
- 複数の自己抗体を同時に検出するためのハイスループットアッセイを開発すること。
- 臨床試験での使用に向けてアッセイを検証すること。
- 疾患の早期予測および予防を促進すること。
使用された手法
- ビオチン化およびルテニウム標識タンパク質を用いた抗原溶液の調製。
- 調製した抗原溶液と血清サンプルのインキュベーション。
- サンプル処理への96ウェルPCRプレートの使用。
- マルチプレックスアプローチを検証するための、標準アッセイ結果との相関性の確認。
主な結果
- 6-Plex ECLアッセイは、従来のシングルアッセイと強い相関を示しました。
- インデックス値により、血清サンプル中の自己抗体が陽性であることが示されました。
- 本アッセイにより、複数の自己免疫疾患を効率的にスクリーニングすることが可能です。
- 結果から、大規模な集団スクリーニングの実現可能性が支持されました。
結論
- 6-Plex ECLアッセイは、自己免疫疾患の早期発見に向けた有望なツールです。
- この手法により、スクリーニングプロセスの効率が向上します。
- 早期介入を通じて、患者の予後を改善できる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
検証済みの6-Plex ECLアッセイにより、1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19に対する自己抗体のハイスループットなマルチプレックス検出が可能となり、効率的な疾患特異的集団スクリーニングへのニーズに応えます。本プラットフォームは、発見から診断に至る連続的な過程における極めて初期の転換点での予測信頼性を向上させ、自己免疫疾患および感染症研究におけるリスク調整後のポートフォリオ決定を支援します。主要なスクリーニングツールとしての導入は、トランスレーショナル研究および前臨床ワークフローにおける企業レベルの影響力を実証しています。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 単一のアッセイ形式で、複数の自己免疫およびウイルス標的の同時検出を可能にします。
- 疾患特異的な自己抗体プロファイルを区別することで、生物学的なリスク低減を向上させます。
- 早期疾患予測および予防戦略のための予測信頼性をサポートします。
- 標的バリデーションのためのマルチプレックス化された定量的リードアウトを提供し、ポートフォリオの優先順位付けを容易にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流のスクリーニングおよびバイオマーカーワークフロー向けに、検証済みのマルチプレックスシステムを調製します。
- アッセイ条件を標準化し、サンプル間の再現性と定量的比較可能性を確保します。
- 最小限の血清量で、拡張可能なハイスループットスクリーニングを可能にします。
- 複数の疾患関連バイオマーカーに対する化合物または介入の効果を、信頼性高く評価することを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 発見から臨床検証までのトランスレーショナルな連続性を確保するため、疾患に関連するバイオマーカー戦略と整合させます。
- 前臨床パイプラインにおいて、リスク調整後の進展判断の根拠となる定量的アウトプットを提供します。
- マルチプレックス自己抗体プロファイルと疾患の発症および進行を相関させることで、予測的なリスク低減を強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
6-Plex ECLアッセイは、初期探索、リード化合物同定、およびトランスレーショナル研究のインターフェースとして統合されており、仮説検証から前臨床バリデーションへのシームレスな移行を可能にします。
- 探索生物学：マルチプレックス自己抗体検出により、堅牢な仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：ハイスループットスクリーニング環境に適した、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：条件間の比較および統計解析のためのインデックス値とカットオフに基づく判定基準を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカー検出を疾患関連エンドポイントと整合させることで、探索研究と臨床検証を橋渡しします。
- エンタープライズ再利用：将来的なマルチプレックススクリーニングへの取り組みに向けた、再利用可能で拡張性のあるプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 早期段階の自己免疫疾患および感染症研究における予測精度を向上させ、メカニズムに関する不確実性を低減します。
- 運用上の価値： 標準化、再現性、およびハイスループットな拡張性により、ワークフローを効率化します。
- 戦略的価値： マルチプレックス化された実用的なデータを提供することで、根拠に基づいた Go/No-go 判断と資本効率の高いポートフォリオ管理を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： 強固なマルチプレックス・バイオマーカーのエビデンスに基づき、リスク調整後の優先順位付けと候補物質の推進を支援します。
実施上の留意点
- マルチプレックス免疫測定法の開発および電気化学発光（ECL）検出に関する専門知識が必要である。
- ECL読み取り用の専用機器およびハイスループットプレートハンドリングシステムへのアクセスが不可欠である。
- アッセイプロトコルおよびデータ解析パイプラインについて、チームを横断した標準化が必要となる。
- ポートフォリオのニーズの変化に応じて、異なるサンプルタイプや疾患モデルへの適応が必要となる場合がある。
- 実用上の制限として、確立されたシングルプレックスアッセイおよび放射結合アッセイに対する厳格なバリデーションが必要である。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
