Name: エチレンジアミン四酢酸媒介接着消によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速で費用対効果の高い酵素フリー継代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶEDTA媒介酵素フリー継代法によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速かつ費用対効果の高い培養技術。細胞傷害を最小限に抑え、多能性維持を実現する革新的な方法です。

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予備実験中のLars Moen氏のご協力と、オスロ大学病院のNorwegian Center for Stem Cell ResearchのNorwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cellsにご協力いただき、感謝いたします。H9 hESCラインはWiCellから入手し、HS429 hESCラインはカロリンスカ研究所のOuti Hovattaから入手した。どちらも材料移転契約に従って使用されました。NCS001およびNCS002 iPS細胞株は、ノルウェーのヒト多能性幹細胞コアファシリティによって作製されました。この再プログラミングとここで報告されたすべての作業は、ノルウェー南東部地域倫理委員会(承認REK 2017/110)の承認を得て実施されました。

このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. ヒト線維芽細胞の培養とフィーダー細胞層の作製
<ol><li>各T-75培養フラスコ(必要に応じてフラスコの数)あたり0.5×106 個のヒト包皮線維芽細胞(以下、「フィーダー細胞」と呼ぶ)を、20mLのIscoveの修正ダルベッコ培地(IMDM)と10%ウシ胎児血清(FBS)(以下「フィーダー細胞培地」と呼ぶ)で播種する。</li>
	<li>フィーダー細胞が90%のコンフルエントに達したら、培地を取り出し、培地中の因子によるトリプシンの阻害を避けるために、フラスコあたり10 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で3回洗浄します。各フラスコに2 mLのトリプシン-EDTAを加え、フラスコを37°C/5%CO2 インキュベーターに5分間、またはフィーダーセルがフラスコから剥がれるまで入れます。細胞の浮遊凝集体または単一細胞としての細胞の剥離を顕微鏡で観察します。</li>
	<li>予熱した新しいフィーダーセル培地5 mLを各フラスコに加えてトリプシン-EDTAを不活性化し、ピペッティングでフィーダーセルを静かに懸濁させます。</li>
	<li>フィーダーセルを15 mL遠心チューブに移します。チューブにキャップをし、200 × g で5分間遠心分離してフィーダーセルをペレット化します。</li>
	<li>フィーダーセルペレットを乱すことなく、上清を慎重に除去します。次に、ペレットを4 mLの新鮮なフィーダーセル培地に慎重に再懸濁します。細胞計数チャンバーまたは他の細胞計数装置を使用して計数する前に、フィーダー細胞が完全に再懸濁されていることを確認してください。</li>
	<li>0.5 × 10 6フィーダーセル を必要数の新しい T-75 培養フラスコに追加して拡張し、各フラスコに 20 mL の新鮮なフィーダーセル培地を追加します。培養フラスコを37°C/5% CO2 インキュベーターで、フィーダー細胞が90%コンフルエントに達するまでインキュベートします。 注:フィーダーセルは、少なくとも継代25まで使用できます。</li>
	<li>ヒトES細胞/iPS細胞の培養に使用する35 mmの組織培養皿の数に必要なフィーダー細胞の数を計算します。 注:通常、組織培養皿当たり3.0×105 フィーダー細胞は、フィーダー細胞のコンフルエント層を生成するのに十分である。</li>
	<li>フィーダー細胞の増殖を避けるために、フィーダー細胞が2つの方法のいずれかで有糸分裂的に停止していることを確認してください。 注:どちらの方法でも、有糸分裂的に停止したフィーダー細胞を大量に生成し、後で使用するためにアリコートで凍結することができます。<ol><li>必要なすべてのフィーダー細胞を50 mLの遠心チューブに移し、フィーダー細胞培地を合計5 mLに補充することにより、ガンマ線照射による有糸分裂停止を実行します。直ちに室温でガンマ線照射機に移送し、フィーダーセルを有糸分裂停止(300kV、10mA、20分間)照射する。 注:輸送が遅れると、フィーダーセルが50 mL遠心チューブの壁に望ましくない付着する可能性があります。輸送に数分以上かかる場合は、チューブを連続的に攪拌して、輸送中にフィーダーセルが懸濁したままであることを確認してください。</li>
		<li>5 mLのフィーダー細胞培地に必要なすべてのフィーダー細胞を50 mLの遠心チューブに移し、マイトマイシンCを使用して有糸分裂停止を行い、次に20 μg/mLのマイトマイシンCを含む15 mLのフィーダー細胞培地を加え、37°C/5% CO2インキュベーターで3時間インキュベートします。20 mLの37°CのPBSを加え、200 × g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、PBS洗浄をさらに2回繰り返し、フィーダー細胞培地に再懸濁します。</li>
	</ol></li>
	<li>フィーダー細胞を有糸分裂的に停止させた後、組織培養フードに戻り、次のように、35 mm組織培養皿あたり3.0 × 105 細胞でフィーダー細胞をプレートアウトします。フィーダー細胞が完全に再懸濁されていることを確認し、フィーダー細胞の濃度が1.5 × 105 mL/mLになるようにフィーダー細胞培地を添加し、このフィーダー細胞懸濁液を各35 mm組織培養皿に2 mL添加します。</li>
	<li>培養皿を37°C/5%CO2 インキュベーターに移します。フィーダー細胞が均等に分布するように、培養皿をインキュベーター棚上でゆっくりとしっかりと前後に3回動かし、その後一時停止してから、同じ動作を左から右に3回実行します。皿を再び動かさず、インキュベーターのドアをそっと閉めてください。</li>
	<li>24時間後、フィーダー細胞培地から10%血清置換(SR)を伴うIMDMに切り替えます。その後、3日ごとにこの培地を交換してください。フィーダーセルは、最初の3日後に使用できるようになります。</li>
</ol>2. ヒトES細胞またはiPS細胞コロニーの機械的採取
<ol><li>80% ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、20% SR、1 mM グルタミン代替 100x、1 mM 非必須アミノ酸(NEAA)、1 mM ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、および 10 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)からなる hESC 培地を予温します。ヒトES細胞培地は、フィーダー細胞上でヒトES細胞またはiPS細胞を培養するために使用されます。</li>
	<li>有糸分裂で停止したフィーダー細胞を含む新鮮な35 mm組織培養皿を採取し、ヒトESC/iPS細胞コロニーの移植の少なくとも30分前に、フィーダー細胞培地をbFGFを含む1.2 mLのヒトES細胞培地と交換します。</li>
	<li>ヒトESC/iPS細胞コロニーを含む培養皿を、有糸分裂で停止したフィーダー細胞上に、層流フード内に置かれた倍率10倍の顕微鏡下に置きます。滅菌メスを使用して、各コロニーの円周を慎重に切断し、各コロニーを5〜6個にほぼ等しい部分に切断します。メスの刃の先端でコロニー片を慎重に持ち上げて、フィーダー細胞層から剥がれ、培地中に自由に浮かび上がるようにします。<ol><li>分化細胞を含むコロニーの領域は、コロニー内のヒトES細胞/iPS細胞と比較して、核の区別が少ない小さな細胞の島として現れることは避けてください。</li>
	</ol></li>
	<li>自由に浮遊するコロニーを1 mLピペットでフィーダー細胞を含む新しい培養皿に移します。コロニーが後で互いに成長しないように、コロニーを分離しておくようにしてください。培養皿を細胞インキュベーターに慎重に移動させ、翌日まで皿を乱さないようにします。</li>
	<li>翌日、bFGFを含むヒトES細胞培地600 μLを最終容量1.8 mLになるように慎重に添加します。その後、次の継代まで(通常は1週間後)毎日hESC + bFGF培地を交換します。</li>
</ol>3. EDTAを介した接着除去によるヒトES細胞またはヒトiPS細胞コロニーの採取
<ol><li>有糸分裂で停止したフィーダー細胞を含む新鮮な培養皿を採取し、コロニーの移植の少なくとも30分前に、10%SRを含むIMDMから1.2 mLの予熱したhESC + bFGF培地に切り替えます。</li>
	<li>ヒトES細胞またはヒトiPS細胞コロニーを含む培養皿を一度に1つ取り扱ってください。hESC + bFGF培地を除去し、1 mLの室温DPBSでコロニーを洗浄して、付着していない細胞や細胞の破片を取り除きます。1 mL の 0.5 mM EDTA を加え、37 °C で 1 分間インキュベートします。 層流フードに加温プレートがある場合は、この手順と加温プレートのセクション4の手順を実行して、付着性を高めます。</li>
	<li>1分間のインキュベーション後、EDTA溶液を除去し、1 mLのピペットを使用して1 mLのhESC + bFGF培地を慎重に添加します。同じピペットで静かにトリチュレーションして、フィーダーセル層からコロニーを解放します。フィーダーセル層が緩み、別の塊に折りたたまれるまで、慎重にトリチュレーションを続けます。ピペットチップでフィーダーセル層を引き離します。</li>
	<li>懸濁したヒトESC/iPS細胞コロニーを新しい1 mLピペットでフィーダー細胞とhESC+bFGF培地を含む新しい培養皿に移し、1:5の比率で分割します。コロニーは、新しい培養皿内に均等に分布する傾向がありますが、皿を左右に穏やかに動かすことでこれを容易にします。その後、次の継代まで(通常は1週間後)毎日hESC + bFGF培地を交換します。</li>
</ol>

<ol><li>Skottman, H., Hovet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).</li>
<li>Hovatta, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).</li>
<li>Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell+cultivation%3A+historical+perspective+and+evolution+of+xeno-free+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9(2015).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+polymer+coatings+for+long-term+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).</li>
<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+superfamily+signaling+regulates+the+state+of+human+stem+cell+pluripotency+and+capacity+to+create+well-structured+telencephalic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids.</a> Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Inzunza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell+culture+methods+under+cGMP+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117(2020).</li>
<li>Castro-Viñuelas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+successfully+culturing+and+adapting+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).</li>
<li>Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Joel C. Gloverは、Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cellsのディレクターであり、Hege Brincker Fjerdingstadは、デイリーマネージャーです。著者は、競合する金銭的利害関係やその他の利益相反を開示していません。

我々は、EDTAを介した接着除去を用いてフィーダー細胞上で培養したヒトES細胞およびヒトiPS細胞を迅速かつコスト効率よく回収する方法について説明し、これを主にメスを用いた従来の機械的採取方法と比較しました。また、EDTAベースの捕獲と酵素捕球を、方法の速度に関して比較したが、結果として得られるコロニーの品質の側面については比較しなかった。その理由は、酵素採取は本質的に変動が激しく、ゲノム異常の有病率が高いことと関連しており5、方法間の違いが不明瞭になる可能性があるためです。
EDTAベースの収穫は、他の方法のいずれよりも高速かつ効率的であり、機械的捕獲よりも小さく、形態学的により均質なコロニーを生成することを実証しました。この後者の特徴は、機械的採取で得られた大きな塊は中枢壊死を起こしやすく、酵素消化は単離されたヒトES細胞やiPS細胞を生成する傾向があり、アポトーシスを起こしやすく、生き残るためにROCK阻害剤などの追加の処理を必要とするため、細胞の生存に関して有益です。EDTAベースのハーベスティングは、少なくとも20継代に使用できます。コロニー細胞密度、幹細胞遺伝子のmRNAおよびタンパク質発現、胚様体の3つの胚葉層の分化、およびゲノム異常に関しては、EDTAベースのメカニカルハーベスティング法と機械的ハーベスティング法は同等です。ヒトES細胞およびiPS細胞の効率、収量の向上、変動の低減、およびより穏やかな取り扱いが目的であれば、EDTAベースの採取が望ましい。
また、フィーダー細胞で培養したヒトES細胞およびiPS細胞のEDTAベースの採取は、よりナイーブな状態を維持するための安価な方法であり、フィーダーベースの培養からフィーダーフリーの培養へのスムーズな移行が望ましいことにも注目しています。
プロトコル内の重要なステップ EDTAを介した接着除去の最も重要なステップは、プロトコルセクション3(EDTA溶液中でのインキュベーション)とセクション4(トリチュレーション)です。EDTA溶液への曝露が1分を超えると、単一細胞への完全な解離のリスクが高まります。これは、トリチュレーションが長引いたり、過酷すぎたりする場合にも発生する可能性があります。後者はピペットチップのサイズの影響を受けます。ここで説明するように、1 mLの細胞培養ピペットを使用するのが理想的です。チップ径の小さい別のタイプのピペットを使用することは危険です。
トラブルシューティング フィーダー細胞が増殖し続ける場合、有糸分裂停止は効果的ではなく、新しいバッチを採取して手順を再開する必要があります。コロニーがフィーダー細胞層から緩まない場合は、EDTAにCa2+ が含まれていないこと、およびコロニーを含む培養皿をPBSでよくすすぎ、EDTAを添加する前に残っている細胞培養培地を除去する必要があります。解離が多すぎると、孤立した細胞や小さすぎる細胞塊が生成され、過度の粉砕によって生じ、新しいコロニーの形成が損なわれる可能性があります。粉砕の程度は、結果として生じる細胞塊が直径が~60μmであることを確認するために、プロトコルの試運転で経験的に決定されるべきです。特にヒトES細胞/iPS細胞の採取準備が整う前に、フィーダー層が培養皿から自然に剥離する場合は、フィーダー細胞が調製後~7日以内に使用されていないことが原因である可能性があります。したがって、フィーダーセルの使用時間枠は注意深く監視する必要があります。EDTA曝露中にフィーダー層が解離した場合(ここで使用したフィーダー細胞では観察されたことがありません)、フィーダー細胞の種類または培養方法を変更する必要があります。
この手法の限界 この技術の主な制限は、成功した結果を得るために接着除去プロセスを目視検査する必要があることです。つまり、ユーザーは、フィーダーセル層からコロニーが放出され、フィーダーセル層が基質から緩むタイミングを識別する方法を学ぶ必要があります。ただし、これは難しいことではなく、私たちの経験では、この手法の新しいユーザーは、数回の試行で習得できます。
また、採取されたヒトES細胞やiPS細胞が、少数のフィーダー細胞によって汚染されている可能性も内在しています。非フィーダー条件に移したり、アッセイのためにヒトES細胞やiPS細胞を単離したりすることを意図している場合、そのような汚染は純度を損なうことになります。ここで用いるフィーダー細胞(ヒト包皮線維芽細胞)では、酵素消化(図示せず)を用いてもフィーダー細胞層を解離させることは極めて困難であることに留意する。 totoでは未解離のフィーダー細胞層が除去されるため、採取したヒトES細胞やiPS細胞の汚染は無視できる程度です。さらに、フィーダー細胞は有糸分裂的に停止しているため、ヒトES細胞やiPS細胞の継代が進むと、汚染は最終的にゼロに減少します。
既存の手法に対する意義 ヒトES細胞やiPS細胞の培養は、現在、フィーダーフリーの培養が主流であり、継代にEDTAを使用することが広く行われています。フィーダーフリー培養は、接着性を保証する特別に調合された培地と培養基質の使用に依存します。これらの試薬には、ラボの予算を超える可能性のある追加費用が伴います。さらに、フィーダーフリー条件下での培養は、フィーダーフリー培地に特定の因子がないこと、およびその結果としてナイーブ状態からプライミング状態への移行により、分化能が乱れることと関連しています。有糸分裂的に停止したフィーダー細胞での増殖は、この移行を回避し、全体的なコストを管理可能なレベルまで下げることができるため、実験室研究における多能性幹細胞のより広範な使用が促進されます。

ヒトES細胞およびヒトiPS細胞の in vitro での適切な維持は、ヒト細胞および発生生物学におけるいくつかの研究分野にとって基本的で便利な方法論です。ヒトES細胞やヒトiPS細胞には本来備わっている分化の原動力となるため、 in vitroで 未分化状態を維持することには、特別な注意と注意が必要です。したがって、方法論のばらつきをできるだけ少なくして、ヒトES細胞およびiPS細胞の維持と継代のための費用対効果の高いプロトコルを開発することは、一般的に非常に有用です。
もともと、ヒトES細胞とiPS細胞は、未分化状態の長期培養と維持を助けるために、異なる種類のフィーダー細胞で培養されていました1,2,3。最近では、フィーダーフリー条件下での培養が標準となり、フィーダー細胞の取り扱いを完全に回避しています4。しかし、一部の研究室や中核施設では、いまだにフィーダー細胞でヒトES細胞やiPS細胞を培養しています。フィーダーフリー培養は、特殊な組成の培地の使用と、コロニーの接着を確実にするために培養表面の何らかの形態のコーティング(主要な細胞外マトリックス[ECM]成分または市販のECM化合物、または市販のコーティングされたプレートの使用)を必要とするため、より高価です。この費用は些細なことではなく、ヒトES細胞やiPS細胞を用いた研究開発に関心のある一部の研究室にとっては、財政的な障害となる可能性があります。さらに、フィーダーフリー条件下での培養は、ヒトES細胞やヒトiPS細胞をフィーダー細胞よりもナイーブでない状態に追いやる傾向があり5、これがその後の分化を損ない、遺伝的変異につながる可能性がある6。
歴史的に、フィーダー細胞で培養されたヒトES細胞およびiPS細胞の継代には、メスを使用して顕微鏡下でコロニーを切除する機械的採取が含まれていましたが7、これは後に、コロニーまたは解離細胞を分離するための穏やかな掻き取りの有無にかかわらず、酵素消化に大きく取って代わられました。機械的な採取は面倒で、精密なマイクロサージェリーが必要です。酵素収穫は、バッチ間の酵素の違いにより効率が異なり、完全な解離を好む傾向があり、ROCK阻害剤によって打ち消されない限り細胞死を促進し8,9、異常な核型の発生率を増加させます9。
ヒトES細胞やヒトiPS細胞をフィーダー細胞で培養するコストの低さと分化の可能性を活かし、機械的・酵素的採取のデメリットを回避しつつ、EDTAを介した接着除去法を用いて、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー層上に維持されたヒトES細胞およびiPS細胞コロニーを、迅速、効果的、低コスト、高収率で採取する方法を確立しました。収量、ばらつき、幹細胞の品質を、機械的採取で得られたものと比較しました(このアプローチにはばらつきが伴うため、酵素消化とは比較しませんでした)。EDTAを介した接着除去は、下流での使用や分析に必要な場合、フィーダーベースの培養からフィーダーフリーの状態にコロニーを移すのにも適していることに留意します。この方法は、EDTAによる接着除去がフィーダーフリー培養に採用されている一般的なアプローチであるため、一貫した継代法によるトランジションを提供します。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-18B-250UG</td><td></td></tr><tr><td>ブランド B&uuml;rker Chamber</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific の10628431</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels no.15</td><td>Susann-Morton</td><td>505</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) without Ca/mg</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette 200 &mu;L</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ 1,000 &mu;L</td><td>Sarstedt</td><td>70.1186.210</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ 200 &mu;L</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td>ガンマセル 3000 ELAN 照射機 (または、マイトマイシン C を使用して増殖を阻止します)</td><td>Best Theratronics</td><td>BT/MTS 8007 GC3000E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrixgel</td><td>Corning</td><td>734-0269</td><td></td></tr><tr><td>H9 hESC line</td><td>WiCell</td><td>WAe009-A</td><td></td></tr><tr><td>hPSC Genetic Analysis Kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#07550</td><td></td></tr><tr><td>HS429 hESCシリーズ&nbsp;</td><td>ECACC</td><td>KIe024-A</td><td></td></tr><tr><td>ヒト包皮線維芽細胞 -CRL2429 line</td><td>ATTC</td><td>CRL2429</td><td></td></tr><tr><td>IMDM (1x)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>iPSC lines</td><td>Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells</td><td>NCS001 &NCS002</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡または同等品 (ZeissのLSM 700を使用)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>CETI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140.035</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、プラスチック 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、プラスチック、5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>血清補充 (SR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルター 0.22 um</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.102</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培養フラスコ</td><td>ThermoScientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA、500 mL</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

エチレンジアミン四酢酸媒介接着消によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速で費用対効果の高い酵素フリー継代

Rapid, Cost-Efficient, Enzyme-Free Passaging of Human Pluripotent Stem Cells on Feeder Cells by Ethylenediaminetetraacetic Acid-Mediated Dis-Adhesion

ヒト多能性幹細胞(ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞、ヒト人工多能性幹細胞、iPS細胞)は、もともと異なる種類のフィーダー細胞で培養し、長期培養で未分化な状態を維持していました。このアプローチは、フィーダーフリーの培養プロトコルに大きく取って代わられていますが、これらはより高価な試薬を必要とし、細胞の分化能力を制限するプライミング状態への移行を促進する可能性があります。フィーダーおよびフィーダーフリーのいずれの条件においても、継代のためのヒトES細胞またはヒトiPS細胞コロニーの採取は、培養を拡大するために必要な手順です。
フィーダー細胞で培養したヒトES細胞/iPS細胞を簡便かつ高収率で継代するために、カルシウムキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸(EDTA)による接着除去を利用した回収法を確立しました。このアプローチを、顕微鏡下でメスでコロニーを単離する元の機械的採取アプローチと比較することにより、得られた継代細胞の収量と品質を評価しました(酵素回収に関連する試薬のばらつきを避けるために、比較対象として機械的採取を選択しました)。
1組の実験では、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層上に2つの異なるhESC株が維持されました。各系統は、EDTAベースまたは機械的収穫を使用して複数の継代にかけられ、コロニーのサイズと形態、細胞密度、幹細胞マーカーの発現、胚様体の3つの胚葉への分化、およびゲノム異常について評価されました。別の実験では、2つの異なるiPS細胞株でEDTAベースの採取を行い、同様の結果が得られました。EDTAによる接着除去は、機械的収穫と比較して、時間を節約し、より好ましいサイズとより均一な形態のコロニーのより高い収率をもたらしました。また、酵素による回収よりも迅速で、酵素バッチのばらつきが生じにくい。また、EDTAによる接着除去法は、ヒトESC/iPS細胞株をフィーダー細胞ベースの培養物からフィーダーフリー状態に移行し、下流での使用や分析に役立てることができます。

以下に記載するアッセイおよび比較では、2つのヒトES細胞株(それぞれWiCellおよびKarolinska InstituteのH9およびHS429)および2つのiPS細胞株(いずれもノルウェーのヒト多能性幹細胞コアファシリティによって作製されたNCS001およびNCS002)を使用しました。図と表のデータはヒトES細胞株のものですが、iPS細胞株でも全く同様の結果が得られました。
私たちの手では、機械的収穫により、コロニーは直径200~250μmの約5〜6個の塊に分割されましたが、EDTAによる接着解除とそれに続くトリチュレーションでは、各コロニーは直径~60μmの~10〜20個の塊に分割されました。EDTAで採取された各凝集塊の細胞数は~20と推定されます。メスでコロニーをこの大きさの塊に分割することは現実的ではないため、この点では、コロニー細胞の生存に有利なサイズの塊を生成するため、EDTAによる接着解除が優れています10,11。
また、EDTAを用いて採取したヒトES細胞/iPS細胞コロニーは、機械的に採取したコロニーと比較して、サイズと形状がより均一でした(図1A-F)。これは、機械的な収穫に必要な切断により、不均一なエッジとさまざまな塊のサイズが生成されるためです。これを定量的に評価するために、継代から5日後のコロニーの円形度(コロニーの縁がどれだけ丸みを帯びているかの尺度として、値1は真円を示す)をImageJ-win64プロトコル12を用いて評価した。コロニーの循環性は、機械的に収穫されたコロニーで有意に低かった(機械的収穫:0.61±0.10;EDTAベースの収穫:0.84±0.01;n = 10、p &lt; 0.001、Mann-Whitney U検定、U = 10)。
コロニー形成中の収穫後の細胞間相互作用の尺度である、回収および再プレーティングされたコロニーの細胞密度は、EDTAベースの捕球および機械的捕球と同様でした(表1 および 図1G、H)。機械的に採取されたコロニーは、その中央領域で壊死を発症する傾向が大きかった(図1J)。これは、形状のばらつき、特に機械的に単離された細胞塊のサイズによるものと考えられますが、これらの塊が大きすぎると、新しい培養皿に移すときに簡単に折りたたまれてしまう可能性があります。これは、EDTAを使用して採取されたコロニーには当てはまらず、均一に半透明の外観を示し、エッジがはっきりとしていました(図1I)。
EDTAベースの収穫により、井戸に確立されたほぼすべてのコロニーを2〜3分以内に収集することができました。機械収穫では、すべてのコロニーを井戸に集めるのは面倒で時間がかかります。通常、機械収穫を使用して、~30%、または~20-25個のコロニーしか収集できず、これには~20分かかりました。同様に、コラゲナーゼ消化とそれに続く穏やかな掻き取りでは、すべてのコロニーを採取することは通常困難でしたが、全体の手順は数分しかかかりませんでした。したがって、EDTAベースの収穫は、酵素捕獲と同等または高速であり、機械的または酵素的収穫よりも効率的です。
異なる採取方法が幹細胞性および多能性に及ぼす影響を評価するために、まず、EDTAベースまたは機械的捕捉を用いて20継代後に得られたコロニーをqPCR分析(図2)および免疫細胞化学染色(図3 および 図4)にかけ、幹細胞マーカーについて調査しました。いずれの方法でも得られたコロニーは、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方でステムネスマーカーの安定した発現を示しました。次に、胚様体の3つの胚葉層への分化により多能性を評価しました(図5 および 図6)。いずれかの方法で20回継代した後に得られたヒトES細胞またはiPS細胞から作製された胚様体には、外胚葉、中胚葉、および内胚葉について一般的に評価されるマーカーを発現する細胞の混合物が含まれていました。
最後に、qPCRベースの遺伝子解析を用いて、それぞれの方法で継代されたヒトES細胞およびヒトiPS細胞におけるゲノム異常の発生率を評価しました( 資料表参照)。いずれの採取法を用いても20継代後に得られたコロニーは、参照二倍体染色体パターンからわずかに逸脱した例がいくつか見られました(評価された異常は、ヒトiPS細胞のリプログラミングに一般的に関連する異常でしたが、ヒトES細胞でも得られます)(図7)。しかし、これらの偏差のパターンは、どちらの収穫方法の後に得られたコロニーでも本質的に同じであり、収穫方法に関連していないことを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig01.jpg"> 図1:EDTAベースまたは機械的ハーベスティング後のコロニーの形態と細胞密度。 (A-F)(A-C)EDTAベースまたは(D-F)メカニカルハーベスティングを用いて、フィーダーフリー培養で20継代後5日間確立したH9 hESCコロニーの代表的な明視野画像。(G,H)(G)EDTAベースまたは(H)メカニカルハーベスティングを使用して20継代後に確立されたH9 hESCコロニーの細胞密度の代表的な蛍光画像。細胞核をDAPIで染色します。(I,J)(I)EDTAベースまたは(J)メカニカルハーベスティングを使用して20継代後に確立されたH9 hESCコロニーの代表的な明視野画像。機械的に採取されたコロニーの壊死した中央領域に注目してください(Jの矢印)。すべての画像は、20回目の通過から5日後に取得されました。スケールバー = 100 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig02.jpg"> 図2:EDTAベースまたはメカニカルハーベスティング後に生成された2つのヒトES細胞株(H9およびHS429)における幹細胞マーカーmRNAの発現。 H9(上段)およびHS429(下段)のhESCにおいて、機械的ハーベスティングを使用した1回の継代後、メカニカルハーベスティングを使用した20継代後、およびEDTAベースのハーベスティング(1:5希釈)を使用した20継代後の、示されたマーカーの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子 ACTB (β-アクチン)の発現レベルに相対的です。エラーバーは標準偏差を示します。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA = エチレンジアミン四酢酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig03.jpg"> 図3:異なる採取条件後のH9 hESC株におけるステムネスマーカータンパク質の発現。 H9 hESCコロニーの代表的な免疫蛍光染色は、さらなる継代前(A-E)、機械的捕捉を使用した20継代後(F-J)、およびEDTAベースの捕捉を使用した20継代後(K-O)のものです。スケールバー = 100 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig04.jpg"> 図4:HS429 hESC株における異なる採取条件後の幹細胞マーカータンパク質の発現。 HS429 ヒトES細胞コロニーの代表的な免疫蛍光染色は、さらなる継代前(A-E)、機械的捕捉(F-J)機械的捕捉(20 継代後)、および(K-O)EDTA ベースの捕獲(20 継代後)です。スケールバー = 100 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig05.jpg"> 図5:機械的またはEDTAベースの採取後にH9 hESC系統から生成された胚様体中の3つの胚葉のマーカーの発現。 (A列およびD列)外胚葉(ECTO、TUJI)、(B列およびE列)内胚葉(ENDO、AFP)、および(C列およびF列)中胚葉(MESO、SMA)の代表的な免疫蛍光染色。(A-C)は20回の機械的捕獲後に、または(D-F)は20回のEDTAベースの捕集後に生成されました。スケールバー = 40 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;EBs = 胚様体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig06.jpg"> 図6:機械的またはEDTAベースの採取後にHS429 hESC株から生成された胚様体の3つの胚葉のマーカーの発現。 (A列およびD列)外胚葉(ECTO、TUJI)、(B列およびE列)内胚葉(ENDO、AFP)、および(C列およびF列)中胚葉(MESO、SMA)の代表的な免疫蛍光染色。20 回の機械的ハーベスティング (A-C) 後に生成された EB (A-C) または 20 回の EDTA ベースのハーベスティングの後に生成された EB (D-F)。スケールバー = 40 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;EBs = 胚様体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig07.jpg"> 図7:HS9およびHS429 ESC株およびNCS002 iPS細胞株における一般的なゲノム異常のqPCRベースの遺伝子解析を、機械的またはEDTAベースのハーベスティングを用いて20継代後に 実施しました。値 2 のベースラインは、すべての染色体マーカーで正常な二倍体を表します。値 1 または 3 は、すべての細胞で示された染色体マーカーの損失または増加をそれぞれ表します。1 と 2 の間または 2 と 3 の間の中間値は、セルの一部に示されたマーカーの損失または増加が存在することを示します。収差のパターンは、2つの収穫条件で類似していることに注意してください。略語:ESC =胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;iPS細胞=人工多能性幹細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>細胞密度(cells/mm2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>H9の</td>
			<td>意味する</td>
			<td>標準偏差</td>
		</tr><tr><td>さらなる継代前の機械的収穫</td>
			<td>3918</td>
			<td>263.3</td>
		</tr><tr><td>機械収穫20回</td>
			<td>3868</td>
			<td>197.7</td>
		</tr><tr><td>EDTA収穫20回</td>
			<td>4080</td>
			<td>127.8</td>
		</tr><tr><td>HS429の</td>
			<td>意味する</td>
			<td>標準偏差</td>
		</tr><tr><td>さらなる継代前の機械的収穫</td>
			<td>5249</td>
			<td>565.4</td>
		</tr><tr><td>機械収穫20回</td>
			<td>5247</td>
			<td>726.3</td>
		</tr><tr><td>EDTA収穫20回</td>
			<td>4963</td>
			<td>448.8</td>
		</tr></tbody></table>表1:EDTAベースまたは機械的採取後に生成された2つのヒトES細胞株(H9およびHS429)からのコロニーの細胞密度の比較。 細胞密度は、機械的捕捉を使用した1回の継代後、機械的捕捉を使用した20継代後、またはEDTAベースの捕球を使用した20継代後(1:5希釈)のいずれかで評価しました。いずれの場合も、n = 5コロニーである。

フィーダー細胞で培養したヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の酵素的または機械的継代に伴う制限を回避するため、EDTAを介した接着除去を使用して、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層上に維持されたヒトES細胞またはiPS細胞コロニーを採取するための迅速、効果的、費用対効果の高い、高収率の方法を確立しました。

Human pluripotent stem cells (human embryonic stem cells, hESCs, and human induced pluripotent stem cells, hiPSCs) were originally cultured on different ...

このプロトコルは送り装置のセルで培養される人間の多能性幹細胞の酵素の自由なpassagingに速く、費用有効な方法を提供する。このプロトコルの利点は、高価なフィーダーフリーの培養培地や成長基質を必要とせず、酵素による完全な解離のリスクを回避し、幹細胞がプライミング状態に移行するリスクを減少させることです。この手順を実演するのは、ノルウェーのヒト多能性幹細胞コア施設のデイリーマネージャーであるHege Brincker Fjerdingstad氏です。0.5×10の播種を開始するために、6つのヒト線維芽細胞(以下、フィーダー細胞と呼ぶ)をT75培養フラスコに10%FBSを含有する20ミリリットルのIMDMを入れたT75培養フラスコに入れ、以下、フィーダー細胞培地と呼ぶ。フィーダー細胞が90%コンフルエンスに達したら、培地を除去し、培地中の因子によるトリプシンの阻害を避けるために、10ミリリットルのDPBSで細胞を3回洗浄します。フラスコに2ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、フィーダー細胞の剥離を肉眼で観察しながら、摂氏37度、二酸化炭素5%で約5分間インキュベートします。剥離が始まったら、顕微鏡で細胞の解離を観察し続け、すべての凝集体が単一細胞に解離していることを確認します。次に、予熱した新鮮なフィーダーセル培地5ミリリットルをフラスコに加え、トリプシン-EDTAを不活性化し、ピペッティングでフィーダーセルを静かに懸濁させます。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、チューブに蓋をして200 Gで5分間遠心分離します。ペレットを乱すことなくサテを慎重に除去し、4ミリリットルの新鮮なフィーダーセル培地に再懸濁します。フィーダー細胞が完全に再懸濁されていることを確認した後、細胞計数チャンバーを使用してそれらをカウントし、35 mmの組織培養皿で造血幹細胞とHI PSCを培養するために必要な細胞数を計算します。次に、ガンマ線照射による有糸分裂停止を行うには、適切な数のフィーダー細胞を50ミリリットルの遠心チューブに移し、フィーダー細胞培地を合計5ミリリットルまで添加します。直ちに室温でガンマ線照射機に輸送し、細胞を有糸分裂的に停止するように照射する。フィーダー細胞が組織培養フードの下で有糸分裂的に停止したら、フィーダー細胞培地に細胞を再懸濁して、1.5 x 10の細胞濃度を1ミリリットルあたり5の累乗にします。フィーダー細胞懸濁液2ミリリットルを35ミリメートルのディッシュに加え、ディッシュを摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに移します。細胞を均等に分布させるには、インキュベーターの棚でディッシュをゆっくりと、しかししっかりと前後に動かします。次に、インキュベーターのドアを閉じる前に、一時停止して同じアクションを左から右に実行します。24時間後、フィーダー細胞培地を10%血清置換を含むIMDMと交換します。有糸分裂的に停止したフィーダー細胞を含む培養皿から、コロニーの移植の30分前に、10%血清置換培地を含むIMDMを、塩基性ファイバーブラスト成長因子またはBFGFを含む1.2ミリリットルの予熱HESC培地と交換します。次に、造血幹細胞またはHI PSCを含む培養皿から培地を取り出し、1ミリリットルのDPBSでコロニーを洗浄して、付着していない細胞と細胞破片を除去します。1ミリリットルの0.5ミリモルEDTAを加え、摂氏37度で1分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、EDTA溶液をBFGFを含む1ミリリットルのHESC培地と交換します。同じピペットで静かにトリチュレーションし、フィーダー細胞層が緩んで別の塊に折りたたまれるまで、フィーダー細胞層からコロニーを解放します。フィーダー細胞層をピペットチップで培養ウェルの端に押し込みます。新しい1ミリリットルのピペットを使用して、懸濁したコロニーをフィーダー細胞とBFGFを含むHESC培地を含む新しい培養皿に移し、1対5の比率で分割します。皿をインキュベーターに移し、コロニーの均等な分布を容易にするために左右に静かに動かします。EDTAを用いて採取したHESCコロニーは、機械的に採取したものよりもサイズと形状が均質であった。採取したコロニーと再播種したコロニーの細胞密度は、EDTAベースの採取と機械的採取で類似していました。機械的に採取されたコロニーは、その中央領域で壊死を発症する傾向が大きかったのに対し、EDTAを使用して採取されたコロニーは、明瞭なエッジを持つ半透明の外観を示しました。QPCR解析では、機械的またはEDTAベースのハーベスティングを使用して20継代後に得られたコロニーのmRNAでステムネスマーカーが安定して発現していることが示されました。同様の観察は、機械的またはEDTAベースのハーベスティングを使用して20継代後に得られたコロニーのタンパク質レベルでの免疫化学的染色で行われました。いずれかの方法を用いて20回継代した後に得られた造血幹細胞から作製された胚様体には、外胚葉、中胚葉、および内胚葉について一般的に評価されるマーカーを発現する細胞の混合物が含まれていました。さらに、一般的なゲノム異常のQPCRベースの遺伝子解析では、参照二倍体染色体パターンからのわずかな逸脱が示されました。EDTA への曝露を 1 分に制限することが重要です。長時間の曝露は、解離を過度に引き起こす可能性があります。また、ヒト胚性幹細胞やヒト人工多能性幹細胞を新しい培養皿に移す際に邪魔にならないように、フィーダー細胞層を脇に十分に引っ張ることも重要です。EDTAが病原体に一般的に使用される培養および無飼料条件への移行は簡単で、細胞の処理方法に変更はありません。

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