Name: ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶラベル保持拡張顕微鏡（LR-ExM）による超解像イメージング手法。三機能性アンカーを用いて従来法より6倍高い蛍光信号を得られ、クラスリン被覆小胞などの細胞構造を高効率に可視化できます。

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この研究は、米国国立衛生研究所(R00 GM126136からX.S.)、米国国立科学財団(DMS1763272からS.P.)、およびサイモンズ財団(594598からS.P.)の支援を受けました。

1. 細胞培養
<ol><li>マッコイ社製5A培地で培養したU2OS細胞を使用し、10%FBSを添加し、37°Cの5%CO2中。</li>
	<li>取り扱いを容易にするために、16ウェル取り外し可能なチャンバーカバーガラス(培養面積0.4 cm2)上に細胞を培養します。</li>
</ol>2.固定と透過処理
注:固定および透過処理の条件は、最適化された免疫染色プロトコルによって異なります。以下は、微小管およびクラスリンコーティングピット(CCP)の共免疫染色に対する固定および透過処理プロトコルです。
<ol><li>細胞数が~0.04 x 10 6に達したら、100 μLの3.2%パラホルムアルデヒド(PFA)をPEMバッファー(100 mM PIPES、1 mM EGTA、および1 mM MgCl2、pH6.9)で室温で10分間固定します(表1)。 注意: PFAを使用した固定は、認定された安全フードで行われます。</li>
	<li>細胞を200 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ5分間3回洗浄します。</li>
	<li>100 μLの透過処理バッファーで細胞を室温で15分間透過処理します(表1)。 注:標的タンパク質、RNA、またはDNAの分解を回避し、最適な結果を得るために、できるだけ早く標識を進めてください。ただし、必要に応じて、固定サンプルを4°CのPBSバッファーに長期間(最大1か月)保存できます。 蒸発したPBSを交換し、サンプルを光退色から保護します。</li>
</ol>3.内因性ストレプトアビジンおよびビオチンブロッキング
<ol><li>細胞ブロッキングバッファー(100 μL)で希釈したストレプトアビジン溶液で室温で15分間インキュベートします(表1)。</li>
	<li>200 μLの細胞ブロッキングバッファーで短時間すすぎます。</li>
	<li>細胞ブロッキングバッファーで希釈した100 μLのビオチン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートします。 注: SNAP タグや CLIP- タグの使用など、自己ラベル付けタグ付けアプローチを使用する場合は、手順 4 をスキップして、手順 5.1: 自己ラベル付けタグ付けアプローチに進みます。</li>
</ol>4. 一次抗体染色
<ol><li>ラット抗αチューブリン抗体(1:500希釈)およびウサギ抗クラスリン重鎖抗体(1:100希釈)を用いて、100 μLの細胞ブロッキングバッファー中で細胞を4°Cで16時間、または室温で1時間インキュベートします。組織サンプルのインキュベーション時間を2倍にします。</li>
	<li>サンプルを200 μLのPBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。</li>
</ol>5. LR-ExM特異的二次抗体染色
<ol><li>IgG抗体と3官能性リンカー、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)-メタクリルアミド(MA)-ビオチンまたはNHS-MA-ジゴキシゲニン(Dig)とのコンジュゲート(図1B)。三官能性アンカーの合成および二次抗体の結合は、Shiら1で既に導入されている。自己標識タグ付けアプローチ:IgG抗体をMA-ベンジルグアニン(BG)-ビオチンまたはMA-ベンジルシトシン(BC)-Digなどの3官能性リンカーとコンジュゲートします(図1B)。三官能性アンカーの合成および二次抗体の結合は、Shiら1において既に導入されている。</li>
	<li>ロバ抗ウサギDig-MA(1:100希釈)およびロバ抗ラットビオチン-MA(1:100希釈)二次抗体を用いて、100 μLの細胞ブロッキングバッファー中で細胞を室温で1時間インキュベートします。組織サンプルのこのインキュベーション時間を2倍にします。</li>
	<li>サンプルを200 μLのPBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。</li>
</ol>6.追加のアンカー
<ol><li>細胞をPBS(100 μL)中の0.25%グルタルアルデヒド(GA)とともに室温で15分間インキュベートし、タンパク質をヒドロゲルに固定します。または、アンカーリングに25 mMメタクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MA-NHS)を使用します。室温で1時間のインキュベーションが推奨されます。</li>
	<li>サンプルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。</li>
</ol>7.ゲル化
注:膨張速度は、塩と水のゲル内またはゲルへの拡散時間によって決まります。したがって、薄いゲルをキャストすると、膨張時間が短縮されます。
<ol><li>16ウェルゲルプレートの上部構造を取り外します。40 μLのモノマー溶液を各ウェルに加え、氷上で細胞をコンディショニングします。氷上で5分間インキュベートします。<ol><li>モノマー溶液を調製するには、 表2を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>氷上でゲル化溶液を調製する。二重蒸留水と10%N,N,N',N′テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)促進剤をモノマー溶液に加えます(10%TEMED:モノマー溶液= 1:47)。イニシエータをまだ追加しないでください(表3)。</li>
	<li>面積0.4cm2の細胞培養チャンバーの場合、約40μLの容量のゲル化溶液を使用する。</li>
	<li>ゲル化溶液に10%過硫酸アンモニウム(APS)を加え、氷上でインキュベートし、直ちに40 μLのゲル化溶液を氷上の各シリコーンガスケットウェルにピペットで入れます。氷上で3分間インキュベートします(10%APS:10%TEMED:モノマー溶液= 1:1:47)。</li>
	<li>サンプルを光から保護し、10 cmのペトリ皿のカバーガラスを37°Cのインキュベーターに1.5時間移動してゲル化させます。37°Cのインキュベーション中にゲルの湿度を保つために、ペトリ皿を蓋で覆い、ペトリ皿に数滴の水を入れます。</li>
</ol>8.消化
<ol><li>ゲル化後、ガラスを取り外してゲルを分離し、ゲルを6ウェルプレートに移します。包埋細胞を2 mLの消化バッファー(表1)で室温または37°Cで4時間一晩消化します。 少なくとも10倍過剰量の消化バッファーを使用してください。</li>
	<li>最終ゲル量よりも少なくとも10倍過剰量の水でゲルを洗浄します。毎回20〜30分間、洗浄手順を4回繰り返します。ゲルは各次元で約2倍に膨張します。 注:ゲルサンプルは、4°CのPBSバッファーに最大1か月間保存できます。 乾燥を防ぐために蒸発した水を交換し、保管中にサンプルを光から保護します。三官能アンカーの劣化を避けるために、サンプルは消化と洗浄の後できるだけ早く染色する必要があります。</li>
</ol>9. 消化後の蛍光染色
<ol><li>2 mL容量のストレプトアビジン(STV)/ジゴキシゲニン(DIG)染色バッファー中で、2〜5 μMのSTV色素および/または抗DIG色素を含むゲルを室温で24時間インキュベートします。サンプルは暗所に保管してください。</li>
</ol>10. 拡張
<ol><li>ゲルを過剰な水(2〜3 mL)で30分から1時間4回洗浄して膨張させます。</li>
	<li>蛍光顕微鏡下で細胞を簡単に可視化するために、5回の洗浄のうち3回目にDAPIで細胞を染色します。DAPIストック濃度(5 mg/mL、4°Cで保存)を洗浄水で1:5,000希釈液で希釈します。ゲルをDAPI水溶液(2 mL)で30分から1時間インキュベートします。</li>
	<li>3 mLの水でさらに2回洗浄します。</li>
	<li>サンプルを入れるのに十分な大きさの平らな皿にゲルを広げます。0.4cm2の面積カバーガラス上に調製された膨張ゲルは、ガラス底部6ウェルプレートにうまく収まる。 注:膨張後に染色されたサンプルは、4°CのPBSバッファーに最大4か月間保存できます。 乾燥を防ぎ、サンプルを光退色から保護するのに十分な水を追加します。イメージングの前に拡張およびDAPI染色ステップを繰り返します。蛍光色素の劣化のリスクを回避するには、サンプルをできるだけ早くイメージングする必要があります。</li>
</ol>11. イメージング
<ol><li>6ウェルガラス底部イメージングチャンバーに0.01%ポリ-L-リジン(各3 mL)をコーティングし、ゲルサンプルを固定化します。</li>
	<li>ゲルサンプルをコーティングされたイメージングチャンバーに移します。</li>
	<li>任意の蛍光スコープでサンプルを画像化します。</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retention+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-retention expansion microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+expansion+microscopy+with+structured+illumination+microscopy+for+analyzing+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes.</a> Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super+resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size+adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy.</a> Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, 73775(2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

LR-ExMの主な革新は、三官能アンカーを使用して標的タンパク質を効果的に標識し、画質を向上させることです。この方法は、研究者がそれほど容易に利用できない三機能アンカーによって制限されています。ただし、三機能アンカーはリクエストに応じて他の研究者と共有することができ、ChrometaのExMプローブなどの同様の製品も現在市販されています。
このプロトコルでは、一次抗体および二次抗体染色ステップのために室温で1時間のインキュベーションが行われています。ただし、これらのステップは代わりに4°Cで一晩行うことができ、一晩染色するとバックグラウンドノイズが低下することが観察されます。
ヒドロゲルの異方性膨張に由来する構造歪みを防止するためには、プロテアーゼ3を用いて徹底したタンパク質消化を行うことが重要である。しかし、以前の膨張顕微鏡では、蛍光標識の50%以上が重合およびタンパク質消化ステップ後に失われる可能性があり、その結果、画質が低下することが示されています<sup class="x...

膨張顕微鏡(ExM)は、落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡などの従来の顕微鏡で超解像イメージングを実現するための便利なアプローチとして最初に導入されて以来、研究者によって使用されてきました1,2,3,4,5,6,7 .ExMを使用すると、通常の共焦点顕微鏡でも~70nmの横方向の分解能を達成することができます。ExMを超解像イメージングと組み合わせると、解像度がさらに向上します。例えば、構造化照明顕微鏡(SIM)では約30nmの分解能、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)では約4nmの分解能を達成できます1,5。
ただし、ラベリング効率の低さは、標準的なExMメソッドでは重要な問題です。蛍光損失は、蛍光基の種類および消化時間に基づいて変化し得る。しかし、平均して、蛍光色素の50%以上がExMの重合およびタンパク質消化ステップの後に失われることが報告されており、これはイメージング品質に有害です3,4。
そのため、ラベルを効率的に保持し、シグナル損失を低減できるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました1。LR-ExMの主な革新は、目的のタンパク質を染色するために、標準的なExM手順のように蛍光色素を単に使用するのではなく、三官能性アンカーのセットを使用することです。これらの三官能性リンカーは、(1)抗体に接続するためのコネクター(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS))、(2)タンパク質をポリマーにアンカーするためのアンカー(例えば、メタクリルアミド(MA))、および(3)有機色素に結合するためのレポーター(例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン(DIG))の3つの部分からなる。三官能性アンカーは、重合およびタンパク質消化ステップに耐え、蛍光色素の損失を防ぎます。
さらに、この方法は、SNAPやCLIPなどの自己標識酵素タグと互換性があるため、大きな可能性を秘めています。酵素タグアプローチは、高い特異性と標識効率に関して免疫染色アプローチに比べていくつかの利点があります8、9、10。
この原稿では、LR-ExMの詳細な手順を示しています。LR-ExMは、ラベリング効率を高めて高い空間分解能を実現するための非常に効果的で柔軟な方法です。

<table><tbody><tr><td>アクリルアミド&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A9099&nbsp;</td><td>ExMゲル</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 711&ndash;005-152</td><td>抗体</td></tr><tr><td>AffiniPureロバ抗ラットIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>H + L、712&ndash;005-153</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-ストレプトアビジン</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-540-084</td><td>蛍光プローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ストレプトアビジン</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>016-580-084</td><td>蛍光プローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ストレプトアビジン</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-600-084</td><td>蛍光プローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A3678&nbsp;</td><td>ExMゲル</td></tr><tr><td>anti-H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>抗体</td></tr><tr><td>anti-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab176916</td><td>抗体</td></tr><tr><td>DAPI二酢酸</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D3571</td><td>蛍光プローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 488標識抗ジゴキシゲニン/ジゴキシン(DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7488</td>蛍光<td>プローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 594 標識抗ジゴキシゲニン/ジゴキシン (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7594</td><td>蛍光プローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMDミリポア株式会社</td><td>324626-25GM</td><td>固定緩衝液</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>EDTA</td><td>消化緩衝液</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド10%EMグレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>50-262-13</td><td>アンカリング</td></tr><tr><td>グレースバイオラボ培養取り外し可能なチャンバーカバーガラス</td>グレース<td>バイオラボ&nbsp;</td><td>GBL112358-8EA</td><td>細胞培養チャンバー</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell 取り外しツール</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL103259</td><td>除去ツール</td></tr><tr><td>グアニジンHCl&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>G3272&nbsp;</td><td>消化バッファー</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>M8266-1KG</td><td>固定バッファー</td></tr><tr><td>McCoy's 5a</td><td>ATCC</td><td>30&ndash;2007</td><td>セル培地</td></tr><tr><td>メタクリル酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル,98%&nbsp;(マサチューセッツ州-NHS)</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>730300-1G</td><td>アンカリング</td></tr><tr><td>モノクローナル マウス 抗 Nup153 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24700</td><td>抗体</td></tr><tr><td>N,N&prime;メチレンビスアクリルアミド&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>M7279&nbsp;</td><td>ExMゲル</td></tr><tr><td>N,N,N&素数;,N&素数;テトラメチルエチレンジアミン&nbsp;(テメド)</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>T7024&nbsp;</td><td>ExMゲル</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド 水溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>50-980-487</td><td>固定バッファー</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-25G</td><td>固定バッファー</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td>チャンバーコーティング</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850-5ML</td><td>消化バッファー</td></tr><tr><td>ウサギ抗クラスリン重鎖抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21679</td><td></td></tr><tr><td>抗体ラット抗 &ndash;&α;-チューブリン抗体、チロシン化、クローンYL1/2</td><td>ミリポアシグマ</td><td>MAB1864-I</td><td>抗体</td></tr>アクリル<tr><td>酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>408220</td><td>ExM ゲル</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン/ビオチン ブロッキング キット</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2002</td><td>ブロッキング バッファー</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>AM9855&nbsp;</td><td>消化バッファー</td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>6ウェルガラス底板</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>イメージングプレート</td></tr></tbody></table>

ラベル保持拡張顕微鏡(lr-exm)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling

膨張顕微鏡(ExM)は、ほとんどの光学顕微鏡法と組み合わせて分解能を高めることができるサンプル調製技術です。細胞または組織を膨潤性ヒドロゲルに包埋した後、サンプルは元のサイズと比較して物理的に3〜16倍(直線寸法)に拡大することができる。したがって、顕微鏡の有効分解能は膨張係数によって増加します。先に導入されたExMの主な制限は、重合および消化手順後の蛍光の減少である。この制限を克服するために、新しい三官能アンカーのセットを使用して信号損失を防ぎ、標識効率を大幅に向上させるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました。この技術により、蛍光シグナル損失を最小限に抑えながら、ナノメートルスケールで細胞または細胞内構造を調べる際に、より高い分解能を達成することができます。LR-ExMは、免疫蛍光標識だけでなく、SNAPタグやCLIPタグなどの自己標識タンパク質タグにも使用できるため、より高い標識効率を実現します。この研究では、この免疫染色ベースのアプローチの手順とトラブルシューティング、および代替としてのLR-ExMの自己標識タグ付けアプローチについて説明します。

クラスリン被覆ピット(CCP)は、三官能性アンカーを用いて免疫染色され(図1B)、LR-ExMは図1Aに記載されるように行われる。LR-ExM(図2C、E)は、タンパク質保持拡大顕微鏡(proExM、図2A)またはビオチン-ExM(図2B)と比較して、はるかに高い蛍光強度を示します。LR-ExMの信号はproExMの約6倍でした(図2D)。LR-ExMは、回折限界よりもさらに小さいCCPなどの小さな構造を効果的に捕捉することができます(図2F、G)。
LR-ExMの代表的な結果のいくつかを免疫染色アプロ...

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)のプロトコルが実証されています。LR-ExMは、以前に導入された膨張顕微鏡と比較して、より優れたラベリング効率を提供する新しい三官能アンカーのセットを使用しています。

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします

Expansion microscopy (ExM) is a sample preparation technique that can be combined with most light microscopy methods to increase the resolution. After ...

膨張顕微鏡法の大きな制限の1つは、重合および消化後の蛍光が遅くなることです。ラベル保持拡大顕微鏡は、LR-ExMと呼び、重合と消化のためにある三官能アンカーを使用します。トライファンクションアンカーを使用した後、膨張ステップの後に蛍光を導入します。そのため、高解像度でありながら良好な信号対雑音比を維持します。ラベル保持拡張顕微鏡は、以前に導入された他の拡張顕微鏡、および蛍光顕微鏡と組み合わせることができます。汎用性の高い方法で非常に堅牢です。また、高レギュレーションイメージングでは、信号を強化することが非常に重要です。まず、摂氏37度と5%の二酸化炭素で完全な培地を含む16ウェルの取り外し可能なチャンバー付きカバーガラス上で細胞を培養します。細胞数が約40, 000に達したら、100マイクロリットルの3.2%PFAをPEMバッファーに室温で10分間固定します。次いで、100マイクロリットルの透過処理バッファーを用いて細胞を室温で15分間透過処理する。細胞ブロッキングバッファーで希釈したストレプトアビジン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートした後、200マイクロリットルのセルブロッキングバッファーで短時間すすぎます。次に、細胞ブロッキングバッファーで希釈した100マイクロリットルのビオチン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートします。その後、ラット抗アルファチューブリン抗体とウサギ抗クラスリン重鎖抗体を含む100マイクロリットルの一次抗体溶液で、摂氏4度で16時間または室温で1時間細胞をインキュベートします。次に、三官能アンカー、ロバ抗ウサギ掘り出し物MA、およびロバ抗ラットビオチンMAを含む100マイクロリットルの二次抗体溶液で細胞を室温で1時間インキュベートします。タンパク質をヒドロゲルに固定するために、100マイクロリットルの0.25%グルタルアルデヒドで室温で15分間細胞をインキュベートします。かみそりの刃または任意の取り外しツールを使用して16ウェルプレートの上部構造を取り外し、下部カバーガラスを保持します。カバーガラスをペトリ皿に入れ、氷の上に置きます。モノマー溶液を45マイクロリットルずつ各ウェルに加え、細胞をコンディショニングします。氷上で5分間インキュベートします。ゲル化溶液を作るには、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを準備します。モノマー、二重蒸留水、および10%T薬を混合します。硫酸塩あたりアンモニウムをまだ添加しないでください。その間、ゲル化溶液チューブを氷の上に置いておきます。ゲル化溶液に10%過硫酸アンモニウムを加える。ゲル化溶液チューブを氷上に保存しながら、直ちに40マイクロリットルのゲル化溶液を各ウェルにピペットで入れます。ウェルプレートを氷の上にさらに3分間置きます。摂氏37度のインキュベーション中にゲルの湿度を保つために、ペトリ皿を蓋で覆い、ペトリ皿に数滴の水を入れた。サンプルを光から保護しながら、カバーガラスと10センチのペトリ皿を摂氏37度のインキュベーターに1.5時間移動してゲル化させます。ゲル化後、カバーガラスを切断して各ゲルを分離する。ゲルを6つのウェルプレートに移します。各ウェルに2ミリリットルの消化バッファーを追加します。サンプルを室温で一晩放置するか、摂氏37度で4時間放置します。次いで、洗浄工程を毎回20〜30分間4回繰り返しながら、最終ゲル体積よりも少なくとも10倍過剰量の水でゲルを洗浄し、ゲルは各次元で約4倍膨張する。サンプルを暗所に保ちながら、2〜5マイクロモルのストレプトアビジン色素および/または抗ジゴキシゲニン色素を含む2ミリリットル容量のストレプトアビジンジゴキシゲニン染色バッファーでゲルを室温で24時間インキュベートします。次に、ゲルを過剰な水で2〜4回洗浄して膨張させます。各洗浄には約30分から1時間かかります。蛍光顕微鏡下で細胞を簡単に可視化するには、3回目の洗浄時にDAPIで細胞を染色します。DAPIストックを洗浄水で1〜5, 000の妄想に希釈します。ゲルをDAPI溶液で30分から1時間インキュベートします。その後、3ミリリットルの水でさらに2回洗います。6ウェルガラス底部イメージングチャンバーに3ミリリットルの0.01%ポリリジンをコーティングして、ゲルサンプルを固定化します。次に、ゲルサンプルをコード化されたイメージングチャンバーに移し、任意の蛍光スコープでサンプルをイメージングします。標識保持拡大顕微鏡は、タンパク質保持拡大顕微鏡またはビオチン拡大顕微鏡サンプルと比較して強化された蛍光標識を示します。標識保持拡大顕微鏡は、タンパク質保持拡大顕微鏡と比較して約6倍高い蛍光シグナルを示します。LR-ExMは、クラスリンコーティングされたピットなどの小さな構造を、サブデフラクション限界分解能で効果的にキャプチャできます。微小管およびクラスリンコーティングピットは、機能性アンカー、NHS MAディグ、およびNHS MAビオチンを用いた共免疫染色であった。同様に、クラスリンでコーティングされたピットとミトコンドリアは、BG MAビオチンやBC MAディグなどの三官能アンカーを用いた酵素タンパク質タグアプローチを用いて標識されました。さらに、免疫染色ベースのアプローチと酵素タンパク質タグアプローチを組み合わせて、ラミンA/Cとヌクレオポア複合体の構造を示します。標識保持拡大顕微鏡は、シナプス前マーカーであるファゴットとシナプス後マーカーであるホーマー1を共免疫染色することにより、マウス脳組織に対して実施しました。2つのラベルは透明で十分に分離されており、高解像度とラベリング効率をサポートしています。労働保持拡張顕微鏡は、汎用性が高く堅牢な方法であり、以前に導入された他の拡張顕微鏡と組み合わせることができます。高解像度イメージングのためには、分子スケール構造をよりよく捉えるために良好な標識効率を達成することが重要である。労働保持拡大顕微鏡は、シグナルを増強するための効果的で堅牢な方法です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

柵末端の機械的刺激による求心性分泌を記録するためのシンプルで新しい技術が提示されています。これは、マウスの耳の皮膚の毛包を神経支配するものです。...

マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

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我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

学ぶラベル保持拡張顕微鏡（LR-ExM）による超解像イメージング手法。三機能性アンカーを用いて従来法より6倍高い蛍光信号を得られ、クラスリン被覆小胞などの細胞構造を高効率に可視化できます。

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします

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