ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

神経堤細胞は、胚の脳神経襞から、または培養中に配置されると遊走する。これは、細胞解離することなく初代遊走性神経堤細胞を単離するための便利な方法を提供する。神経堤の移動は通常、3次元の胚環境内で発生しますが、2次元の培養により、移動に関連するプロセスの視覚化と調査が可能になります。

脳神経襞培養プロトコルは存在しますが、この方法ではトレーニングと生物固有の手順が必要です。このビデオは、ニワトリ脳神経襞培養の再現性のある調製を容易にする技術を示しています。初心者は、神経襞の解剖とメッキ、および培養結果の評価に苦労することがよくあります。

解剖ガイドラインに従い、ここで説明する形態測定解析を適用することで、一貫性のある定量的な結果を得ることができます。はじめに、受精卵を38°Cの加湿インキュベーター内の直立位置に置きます。インキュベーターから卵を取り除いた後、70%エタノールを徹底的にスプレーしてそれらを乾燥させることによって殻を消毒します。

培養物の固定と染色には、マルチウェル組織培養皿に入れたガラスカバースリップを使用し、ウェルの底を覆うのに十分なフィブロネクチン溶液をピペットで入れます。次に、蓋を元に戻し、プレートをフィブロネクチン溶液とともに、38°Cの加湿インキュベーター内で少なくとも1時間インキュベートしながら神経襞を解剖します。鈍い鉗子を使用して、卵の長さの1/4〜1/3で殻に小さな穴を開けます。

鈍い鉗子を小さな穴に慎重に挿入し、卵黄を乱さないようにします。次に、卵の周りの卵殻を切り取り、卵殻の上部を取り除き、胚を分離のために配置します。閉じた鈍い鉗子の平らな端をそっと使用して、胚を覆う卵黄の表面の余分なアルブミンを拭き取って、胚を準備します。

鉗子を使用して、胚をフレームのウィンドウに入れた状態で、胚の上にろ紙サポートフレームを置きます。ろ紙をそっと押し下げて卵黄に付着させます。ろ紙フレームの外側を解剖ハサミで切ります。

鉗子またははさみの先端を使用してフレームの端をつかみ、胚を卵黄からそっと持ち上げます。紙枠を下にして胚を、ペンストレプトでリンガーで満たされた60または100ミリリットルのペトリ皿に入れます。RNAまたはタンパク質感受性の下流アプリケーションのために胚を収集する場合は、胚の皿を氷の上に置いてください。

リンゲルのペン連鎖球菌溶液を含むきれいな皿に胚を移します。胚をゆっくりと前後に振って、視界を覆い隠す卵黄を取り除き、リンガーのペンストレプト液を交換するか、濁った場合は新鮮な皿に移します。解剖顕微鏡下で胚の背側とフレーム側を上にして配置します。

胚を紙枠の上に残して、胚を引き伸ばして所定の位置に保持します。次に、鉗子を使用して神経襞を露出させながら、卵子膜を取り除きます。拡大する視神経小胞への組織尾側と、菱形の狭窄が現れ始めたばかりの後脳への吻側を含めます。

スプリングハサミを使用して、中脳神経ひだを慎重に切除します。神経管と非神経外胚葉の汚染を最小限に抑えて神経襞の最背側を切除し、P20ピペッターまたは卵黄リンゲルのペンストレップ溶液ですすいだ滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、神経襞をリンゲルのペンストレプト液を含むきれいな皿に移します。追加の折り目を解剖しながら、集めた折り目を氷の上に保管します。

培養皿をインキュベーターから取り出した後、ピペッターまたはパスツールピペットを使用して、カバースリップ、皿、またはウェルからフィブロネクチン溶液を除去します。フィブロネクチンコーティングされた基質をリンゲルのペンストレプト溶液ですすいだ後、適切な量の完全培養培地を皿またはウェルに加えます。プラスチックをブロックし、組織が付着するのを防ぐには、P20またはP200ピペッターを使用し、卵黄リンガーのペンストレプト溶液でピペットチップをすすぎます。

次に、孤立した神経襞をフィブロネクチンでコーティングされたカバースリップの中心に向かって移し、リンゲルのペン連鎖球菌溶液をできるだけ少なくするように注意します。外植体を10〜15分間落ち着かせた後、神経襞をメッキした培養皿をゆっくりと慎重に運び、摂氏38度の加湿チャンバーに入れます。パスツールピペットで培地を取り出し、フィルター滅菌PBSでウェルをすすぎます。

4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間プラットフォームシェーカーに保ちます。インキュベーションの最後に、パラホルムアルデヒドを除去し、ウェルをPBSで3回すすぎ、5%血清を含むPBSTを加えます。次に、30マイクロリットルの200ナノモルのオレゴングリーンコンジュゲートファロイジンを、各カバースリップの滑らかな表面にピペットで貼り付けます。

一対の鉗子を使用して、5%血清を含むPBSTからカバースリップを取り外し、細胞の向きが上を向くようにします。カバースリップの端を繊細なタスクワイパーに短時間触れて、余分な液体を吸い取ります。各カバースリップセル側を下にして希釈ファロイジンの滴の上に静かに置き、室温で30分間インキュベートします。

培養期間が経過したら、カバースリップを染色液から持ち上げて培養皿に戻し、細胞側が上になるように裏返します。カバースリップをPBSTで覆い、プラットフォームシェーカーに10分間置き、カバースリップを覆い、暗闇の中で保ちます。PBSTを取り外し、カバースリップの洗浄を2回繰り返して、合計3回の10分間の洗浄を行います。

封入剤を顕微鏡スライドに1滴入れます。カバースリップセルを下にして、カバースリップをゆっくりと斜めに下ろしてマウントメディアに取り付け、気泡が発生しないようにし、メディアをセットしてからイメージングします。最後に、染色された細胞を画像化し、TIFFファイルとしてエクスポートします。

神経堤細胞は、インキュベーション後3〜4時間以内に接着性神経襞外植片から出現し始め、約20時間後に遊走が完了しました。遊走性神経堤細胞をHNK-1を用いて標識したところ、ほとんどの細胞がHNK-1陽性であるように見えた。遊走した神経堤細胞を、糸状アクチンをファロイジンで染色することによって可視化した。

ファロイジン染色された細胞の画像をImageJを用いて処理し、細胞が白背景に黒く見える閾値画像を生成した。閾値画像を解析し、様々な測定値を対照的な棒グラフまたはバイオリンプロットで表示した。例えば、分析された69個の細胞の平均面積は約802.11平方マイクロメートルであり、60.27から2、664.53平方マイクロメートルの範囲であった。

真円度はセルの突出性を反映し、0.101から0.875の範囲です。低い値は細長い形状を示し、値 1 は完全な円を示します。ほとんどの細胞は細長い形を呈しており、これはバイオリンプロットで最も簡単に見られます。

この分野の遊走性神経堤細胞の平均アスペクト比は約2.13であり、アスペクト比が1は対称的な形状を示す。慎重な切除と外植片のメッキは、培養を成功させるために重要です。神経襞をカット面を下にして10〜15分間落ち着かせてから、ゆっくりとインキュベーターに移して接着を促します。

これらの技術のバリエーションには、培養前の一過性の遺伝子操作やインキュベーション中のタイムラプスイメージングなどがあります。さらに、このプロトコルは、オミクスレベルの分析のために遊走性および遊走性の神経堤細胞集団の収集を可能にします。