Name: ナチュラルキラー細胞と侵害受容器ニューロンの相互作用を解明する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶ侵害受容器ニューロンとNK細胞の共培養法。マウス脾臓と背根神経節から細胞を単離し、相互作用を解析することで、神経免疫応答や抗腫瘍機能の制御メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、研究基金のニューフロンティア(NFRFE201901326)、カナダ健康研究所(162211、461274、461275)、カナダイノベーション財団(37439)、カナダ研究委員長プログラム(950-231859)、カナダ自然科学工学研究評議会(RGPIN-2019-06824)、およびケベック自然と技術財団(253380)によってサポートされました。

モントリオール大学の施設動物管理および使用委員会(#22053、#22054)は、すべての動物の手順を承認しました。溶液とその組成のリストについては表 1 を、このプロトコルで使用される材料、機器、および試薬のリストについては 材料表 を参照してください。
1. NK細胞の単離、培養、刺激
<ol><li>侵害受容器ニューロンを無傷で生成する(同腹仔制御;ロックストップロックス-ジフテリア毒素マウス(DTA fl/fl)とTRPV1cre/wtマウスを交配することにより、TRPV1 wt::D TAfl/wt)およびアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。</li>
	<li>CO2吸入を使用して、ナイーブ同腹仔対照(TRPV1 wt::D TAfl / wt)マウスを安楽死させます。</li>
	<li>500 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む1.5 mLの微量遠心チューブで脾臓を収集します。</li>
	<li>乳棒を使用して脾臓を均質化します。</li>
	<li>細胞を1 mLの滅菌PBSで希釈します。</li>
	<li>混合物を50 μmのセルストレーナーを通して15 mLのコニカルチューブにろ過します。</li>
	<li>容量(10 mL)に滅菌PBSを補充します。</li>
	<li>10μLを収集し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>細胞を遠心分離し(500 × g、5分間)、上清を除去します。</li>
	<li>補充したRPMI 1640培地に108 細胞/mLの濃度で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、マウスNK細胞分離キットを使用して脾臓NK細胞を磁気的に精製します。NK細胞の純度をフローサイトメトリーで確認する 11.</li>
	<li>10μLを収集し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>細胞を遠心分離し(500 × g、5分間)、上清を除去します。</li>
	<li>NK細胞を補充したRPMI 1640培養培地(IL-2およびIL-15を含む)に再懸濁します。</li>
	<li>2 ×10 6 NK細胞/mLを96ウェルUボトムプレートで48時間培養します。</li>
</ol>2. DRGニューロンの単離と培養
<ol><li>NK細胞刺激が終了する24時間前(ステップ1.15)に、96ウェルプレートに100 μL/ウェルのラミニン(1 ng/mL)をコーティングし、45分間インキュベートします(37°C)。</li>
	<li>インキュベーション後、溶液を取り出し、ウェルをバイオセーフティキャビネット内で風乾させます。</li>
	<li>CO2吸入を用いて、侵害受容器ニューロンを無傷で安楽死させる(同腹仔対照;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。 注:CO2 吸入は、DRGに接続された脊髄神経の破壊を回避するため、頸部脱臼よりも好ましい。</li>
	<li>マウスを腹臥位でボードに固定し、皮膚を持ち上げ、背柱に沿って皮膚を切開します。詳細なビデオについては、Pernerらを参照してください12。</li>
	<li>腰仙関節を切り取り、はさみで仙骨を腰椎から分離します。</li>
	<li>頭蓋骨の基部に達するまで、脊椎の両側の筋肉と肋骨を頭蓋方向に切断して、脊椎を分離します。</li>
	<li>ハサミを使用して、大西洋 - 後頭関節で脊椎を切り取ります。</li>
	<li>脊椎から筋肉と脂肪組織を取り除きます。</li>
	<li>脊柱をピン留めして開き、脊髄を取り除き、DRGにアクセスします。背根を介して脊髄に接続されているが髄膜から分離されている椎間孔のDRGを探します。</li>
	<li>DRGを、10 mLの氷冷補給DMEMで満たされた15 mLのコニカルチューブに収穫します。</li>
	<li>調製物を遠心分離し(200 × g、5分間、室温)、上清を除去する。</li>
	<li>コラゲナーゼIV(1 mg/mL)およびディスパーゼII(2.4 U/mL)を含むPBSを250 μL添加します。</li>
	<li>DRGをコラゲナーゼIV/ディスパーゼII(C/D)溶液でインキュベートします(80分、37°C、穏やかな攪拌)。複数のマウスから神経節をプールする場合は、神経節あたり125 μLのC / D溶液の比率を維持します。</li>
	<li>酵素を不活性化するには、5 mLの添加DMEM培地を追加します。</li>
	<li>溶液を遠心分離し(200 × g、5分間)、ピペットを使用して上清を静かに除去します。</li>
	<li>不要な細胞損失を避けるために、~100 μLの上清を残してください。</li>
	<li>1 mLの添加DMEM培地を追加します。</li>
	<li>ピペットガンとサイズが小さくなる3つのガラス製パスツールピペットを使用して、DRGを穏やかに粉砕(パスツールピペットサイズあたり~10アップ/ダウン)してシングルセル調製物にします。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネットで、滅菌PBS中のウシ血清アルブミン(BSA)を最終濃度15%に希釈します。1 mL アリコートを -20 °C で保存します。</li>
	<li>2 mLの滅菌PBSを加え、チューブの底に1 mLの15%BSA溶液をゆっくりと分注することにより、15 mLのコニカルチューブにBSAグラジエントを作成します。ピペットをそっと取り外して、勾配を乱さないようにしてください。</li>
	<li>P200ピペットを使用して、粉砕された神経節懸濁液(ニューロンを含む)をチューブの側面にゆっくりとピペットで勾配にします。</li>
	<li>ニューロン含有BSA勾配を遠心分離する(200 × g、12分、室温)。遠心分離機の加速と減速を最低速度に設定します。 注:遠心分離後、ニューロンはチューブの底にあり、細胞破片はBSA勾配に閉じ込められます。</li>
	<li>ピペットを使用してすべての上清を静かに取り除きます。</li>
	<li>細胞を500 μLのニューロバクサルに再懸濁します。</li>
	<li>プレート10 ウェルあたり4 ニューロン(200 μLの神経基盤/ウェル)をラミニンコーティングされた平底96ウェルプレートに入れます。 注:平均して、研究者はマウスあたり~8ウェルを満たすことができます。</li>
	<li>ニューロンを培養(37°C、一晩)して付着させる。</li>
</ol>3. 共培養とフローサイトメトリー
<ol><li>ニューロン培養から神経基盤をゆっくりと取り除きます。</li>
	<li>IL-2およびIL-15による48時間の刺激後(ステップ1.14-1.15を参照)、NK細胞を再懸濁し、10個の5 NK細胞/ウェルをニューロン培養液(96ウェルフラットボトムプレート)に追加します。 注:平均して、研究者はマウスあたり~6ウェルを満たすことができます。</li>
	<li>細胞を補充したニューロバクサルMX(37°C、48時間)で共培養する。</li>
	<li>細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)で洗浄します。</li>
	<li>上清を廃棄し、生存率色素eFlour-780(1:1,000、15分、4°C)で細胞を染色します。</li>
	<li>細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)します。</li>
	<li>細胞上の非特異的部位をCD16/32(1:100、15分、4°C)でブロックします。</li>
	<li>細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)で洗浄します。</li>
	<li>BV421抗NK-1.1(1:100)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)抗NKp46(1:100)、およびフィコエリスリン(PE)抗GM-CSF(1:100)で細胞を染色(15分、4°C)します。</li>
	<li>細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)で洗浄します。</li>
	<li>上清を捨て、細胞をFACS緩衝液(500μL)に再懸濁し、フローサイトメトリー11によりNK細胞を免疫表現型化した。ゲーティング戦略については 、図 1A を参照してください。</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

Daviesら11 は、損傷したニューロンがRAE1をアップレギュレートすることを発見した。その後、細胞間接触 を介して 、NKG2D発現NK細胞はRAE1+ ニューロンを同定して排除することができ、それが慢性疼痛を制限しました11。NK細胞も様々な神経ペプチド受容体を発現しており、その免疫調節能が知られていることから、NK細胞と侵害受容器神経細胞との相互作用を in vitroで研究することがますます重要になっていると考えられます。ここでは、ニューロンがNK細胞の機能をどのように制御し、NK細胞がDRGニューロンの機能をどのように調節できるかを相互に研究できる簡単な共培養プロトコルを考案しました。フローサイトメトリーは、ニューロンがNK細胞の活性化をどのように調節するかを免疫表現型決定するために使用されました。あるいは、研究者はqPCRまたはRNAシーケンシングを使用して、FACS精製細胞の転写産物の変化を測定したり、ELISAを使用してサイトカインや神経ペプチドなどの分泌因子の分泌...

感覚ニューロンの細胞体は、後根神経節(DRG)に由来します。DRGは、脊髄の背角と末梢神経終末の間の末梢神経系(PNS)に位置しています。DRGニューロンの擬似単極性は、標的組織を神経支配する末梢枝から、体性感覚情報を脊髄に運ぶ中心枝への情報の伝達を可能にする1。特殊なイオンチャネル受容体を使用して、一次ニューロンは病原体、アレルゲン、汚染物質2によってもたらされる脅威を感知し、陽イオン(Na+、Ca2+)の流入と活動電位3,4,5の生成につながります。
これらのニューロンはまた、最初の危険感知が起こった末梢に向かってアンチドロミック活動電位を送り、それが神経ペプチドの局所放出をもたらす1,4。したがって、侵害受容器ニューロンは保護メカニズムとして機能し、宿主に環境の危険を警告します4,5,6,7。
侵害受容器は、二次ニューロンと通信するために、様々な神経伝達物質(例えば、グルタミン酸)および神経ペプチド(例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、サブスタンスP(SP)、および血管作動性腸管ペプチド(VIP))を放出する6,7。これらのペプチドは毛細血管に作用し、血漿外漏出、浮腫、および免疫細胞の局所流入および調節を促進する2、4、7。
体性感覚系と免疫系は、サイトカインと神経ペプチド、およびそれぞれの同族受容体で構成される共有コミュニケーションシステムを利用しています4。この双方向通信は、危険からの保護と恒常性の維持に役立ちますが、疾患の病態生理にも貢献する可能性があります4。
NK細胞は自然リンパ系細胞に分類され、ウイルス感染細胞を排除することに特化しています。NK細胞機能は、活性化受容体NKG2D8を含む刺激受容体と抑制受容体のバランスによって支配されています。NKG2Dの内因性リガンドは、レチノイン酸初期誘導性1(RAE1)、腫瘍形成や感染などのストレスを受けている細胞によって発現される8,9。
最近の研究では、末梢神経損傷が感覚ニューロンを駆り立てて、スタスミン2(STMN2)やRAE1などの不適応分子を発現させることが示されています。このように、細胞間接触 を介して 、NKG2D発現NK細胞は、RAE1発現ニューロンとの相互作用によって活性化された。次に、NK細胞は、損傷した侵害受容器ニューロンと、通常は神経損傷に関連する鈍的疼痛過敏症を排除することができました10。NKG2D-RAE1軸に加えて、NK細胞は様々な侵害受容器産生メディエーターの同族受容体を発現する。したがって、これらのメディエーターがNK細胞活性を調節する可能性があります。この論文は、侵害受容器ニューロン-NK細胞相互作用の生物学を調べるための共培養法を提示します。このアプローチは、侵害受容器ニューロンが損傷、感染、または悪性腫瘍に対する自然免疫細胞の応答をどのように調節するかについての理解を深めるのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>抗マウスCD16/32</td>ジャ<td>クソン研究所</td><td>猫番号:017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>ジャクソン研究所</td><td>猫番号:009669</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)培養グレード</td><td>ワールド精密機器</td><td>猫番号:504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 抗マウスNK-1.1</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>カタログ番号:12430112</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー(50 &mu;m)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>猫番号:A3160702</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>猫番号:15140148</td><td></td></tr><tr><td>ジフテリア毒素fl/fl</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>猫番号:SH3057402</td> Dispase <td></td></tr><tr><td>II</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>猫番号:13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>猫番号:07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySepマウスNK細胞単離キット</td><td>シグマ</td><td>猫番号:CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>シグマ</td><td>猫番号:C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>シグマ</td><td>猫番号:04942078001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>シグマ</td><td>猫番号:806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC抗マウスNKp46</td><td>シグマ</td><td>猫番号:L2020</td><td></td></tr><tr><td>平底96ウェルプレート</td><td>シグマ</td><td>猫番号:03690</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>シグマ</td><td>猫番号:470236-274</td><td></td></tr><tr><td>グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)</td><td>VWR</td><td>猫番号:02-0131</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シダーラン</td><td>猫番号:03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>猫番号:A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>マウス組換えIL-15</td><td>Gibco</td><td>カタログ番号:22400-089</td><td></td></tr><tr><td>マウス組換えIL-2</td><td>Gibco</td><td>カタログ番号:21103-049</td><td></td></tr><tr><td>神経成長因子(NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>カタログ番号:13257-019</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培</td>地 <td>PeproTech</td><td>カタログ番号:450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE抗マウスGM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>カタログ番号:212-12</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンとStreptomycin</td><td>PeproTech</td><td>カタログ番号:210-15</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Stem Cell Technology</td><td>カタログ番号:19855</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Biolegend</td><td>カタログ番号:108732</td><td>クローンPK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>バイオレジェンド</td>カタログ<td>番号:137606</td><td>クローン29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>カタログ番号:505406</td><td>クローンMP1-22E9</td></tr><tr><td>ピンセットと解剖ツール。</td><td>バイオレジェンド</td><td>カタログ番号:65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>U字型ボトム96ウェルプレート</td><td>バイオレジェンド</td><td>カタログ番号:101319</td><td></td></tr><tr><td>生存率 染料 eFlour-780</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ナチュラルキラー細胞と侵害受容器ニューロンの相互作用を解明する

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

体性感覚ニューロンは、有害な刺激を検出し、防御反射を活性化するように進化してきました。侵害受容器ニューロンは、コミュニケーション手段を共有することにより、免疫系の活動を制御することによって宿主防御も調整します。これらのシステム間の通信は主に適応的であり、恒常性を保護するのに役立ち、慢性疾患の発症につながるか、または促進する可能性もあります。両方のシステムは、一次および二次リンパ組織および粘膜に見られるような局所相互作用を可能にするために共進化した。最近の研究では、侵害受容器が外来抗原、免疫細胞由来サイトカイン、および微生物を直接検出して応答することが実証されています。
侵害受容器の活性化は、疼痛過敏症およびかゆみをもたらすだけでなく、侵害受容器発火閾値を低下させ、神経ペプチドの局所放出をもたらす。侵害受容器の末梢末端によって産生され、そこから放出されるペプチドは、リンパ球の走化性および分極をブロックし、炎症の局在、持続時間、およびタイプを制御することができる。最近の証拠は、感覚ニューロンが細胞間接触 を介して 自然免疫細胞と相互作用し、例えばナチュラルキラー(NK)細胞上のグループ2D(NKG2D)受容体に関与することを示しています。
NK細胞が様々な侵害受容器産生メディエーターの同族受容体を発現していることを考えると、侵害受容器は神経ペプチドを用いてNK細胞の活性を制御していると考えられます。ここでは、ディッシュ中で侵害受容器ニューロン-NK細胞の相互作用を研究するための共培養法を考案します。このアプローチを用いて、腰椎侵害受容器ニューロンがNK細胞のサイトカイン発現を低下させることを見出しました。全体として、このような還元主義的方法は、腫瘍神経支配ニューロンがNK細胞の抗癌機能をどのように制御するか、およびNK細胞が損傷ニューロンの排除をどのように制御するかを研究するのに役立つ可能性があります。

NK細胞をリターメイトコントロール(TRPV1wt::D TAfl/wt)マウス脾細胞から磁気精製し、IL-2およびIL-15で刺激(48時間)しました。次いで、NK細胞を単独で培養するか、侵害受容器ニューロンから採取したDRGニューロンと無傷で共培養した(同腹仔対照;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。次いで、細胞をTRPV1アゴニストカプサイシン(1μM)またはそのビヒクルに曝露した。共培養の24時間後、NK細胞をFACS精製し、フローサイトメトリーを用いてそれらの活性化レベルを免疫表現型決定した(図1A)。
単独で培養した場合、NK細胞はGM-CSFおよびNKp46の基礎レベルを発現した。侵害受容器から採取したDRGニューロンと共培養した場合(TRPV1wt::D TAfl/wt</s...

侵害受容器ニューロンとNK細胞は、炎症性の状況において活発に相互作用する。共同文化アプローチは、この相互作用を研究することを可能にします。

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

侵害受容器ニューロンが様々な神経ペプチドを分泌し、NK細胞がこれらの神経ペプチドの受容体を発現していることから、NK細胞と侵害受容器ニューロンの相互作用を調べるために共培養法を考案することにしました。このような還元主義的手法は、侵害受容器ニューロンがNK細胞の抗腫瘍機能をどのように制御するかを研究するのに有用であり、NK細胞が損傷ニューロンの排除をどのように制御するかを研究することも興味深いかもしれません。手順を実演するのは、私の研究室の元修士課程の学生であるアリ・アフマディです。ナチュラルキラーまたはNK細胞の単離と培養を開始するには、500マイクロリットルの滅菌PBSを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブにマウスの脾臓を集め、乳棒を使用して脾臓をホモジナイズします。次に、細胞を1ミリリットルの滅菌PBSで希釈し、混合物を50ミクロンのセルストレーナーを通して50ミリリットルのコニカルチューブに濾過する。滅菌PBSを使用して、ろ過したホモジネート容量を10ミリリットルに補充します。血球計算盤を使用して10マイクロリットルの希釈ホモジネート中の細胞をカウントします。残りの細胞を500Gで5分間遠心分離し、上清を除去します。次いで、細胞を補充したRPMI 1640培地に1ミリリットルあたり10〜8番目の細胞で再懸濁する。マウスNK細胞分離キットを用いて脾臓NK細胞を磁気精製し、フローサイトメトリーを用いてNK細胞純度を確認する。血球計算盤を用いて細胞をカウントし、続いて500Gで5分間で遠心分離し、次いで上清を除去する。ペレット化したNK細胞を刺激するために、これらの細胞をIL-2およびIL-15補充RPMI 1640培養培地に再懸濁する。1ミリリットルあたり10〜6番目のNK細胞を96ウェルU底プレートで2回培養し、48時間培養する。NK細胞刺激の24時間前に、96ウェルプレートに1ウェルあたり100マイクロリットルのラミニンをコーティングし、摂氏37度で45分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を取り出し、ウェルをバイオセーフティキャビネット内で風乾させます。次に、安楽死させたマウスをボード上の腹臥位で固定します。皮膚を持ち上げ、背柱に沿って皮膚を切開します。腰仙関節を切り取り、はさみで仙骨を腰椎から分離します。次に、頭蓋骨の付け根に達するまで、両側の筋肉と肋骨を頭蓋方向に切断して脊椎を分離します。はさみを使用して、大西洋後頭関節の脊椎を切り落とします。次に、背骨から筋肉と脂肪組織を取り除きます。脊柱をピン留めして開き、脊髄を除去してから、後根を介して脊髄に接続された椎間孔の背根神経節またはDRGにアクセスします。次に、DRGを10ミリリットルの氷冷補給DMEMで満たされた15ミリリットルの円錐管に収穫します。次いで、調製物を室温で200Gで5分間遠心分離し、上清を除去する。1ミリリットルあたり1ミリグラムのコラゲナーゼIVと2.4単位/ミリリットルのディスパーゼIIを含む250マイクロリットルのPBSを加え、このDRGをコラゲナーゼ-ディスパーゼ溶液で80分間、穏やかな攪拌でインキュベートします。酵素を不活性化するには、5ミリリットルの添加DMEM培地を加え、200 Gで溶液を遠心分離します.5分後、ピペットを使用して上清を静かに取り除き、不要な細胞の損失を避けるために約100マイクロリットルの上清を残します。次に、1ミリリットルの添加DMEM培地を細胞に加え、ピペットガンと3つのガラス製パスツールピペットを使用して、DRGを1つの細胞調製物に穏やかに粉砕します。バイオセーフティキャビネットでの作業中に、ウシ血清アルブミンまたはBSAを滅菌PBSで最終濃度15%に希釈し、摂氏マイナス20度で1ミリリットルのアリコートを保存します。15ミリリットルの円錐形チューブにBSAグラジエントを作成するには、2ミリリットルの滅菌PBSを加え、チューブの底に1ミリリットルの15%BSA溶液をゆっくりと分注します。ピペットをそっと取り外して、勾配を乱さないようにしてください。P200ピペットを使用して、ニューロンを含む粉砕された神経節懸濁液をチューブの側面に勾配に追加します。次に、加速と減速を最小に設定して、BSA勾配を含むニューロンを200 Gで12分間遠心分離し、遠心分離に続いて、ピペットを使用してすべての上清を取り除き、細胞を500マイクロリットルのNeurobasalに再懸濁します。プレートは1ウェルあたり10,000ニューロンをラミニンコーティング平底96ウェルプレートに。ニューロンの付着を可能にするために、96ウェルプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。共培養を開始するには、ニューロン培養からニューロベースをゆっくりと取り除きます。IL-2およびIL-15で48時間刺激した後、NK細胞を再懸濁し、ニューロン培養液に1ウェルあたり10〜5番目のNK細胞を追加します。補充したニューロバクサルMXで細胞を摂氏37度で共培養します。48時間後、細胞を集めてPBSで3回洗浄し、摂氏4度で500Gで5分間遠心分離します。細胞を1〜1,000希釈生存率色素eFluor 780で摂氏4度で15分間染色する前に、上清を廃棄します。実証されたように細胞を洗浄および遠心分離し、続いてCD 1632で摂氏4度で15分間処理して細胞上の非特異的部位をブロックし、続いて細胞を回収してPBSで3回洗浄する。洗浄と遠心分離の次のサイクルの後、細胞をBV421、抗NK-1.1、フルオレセインイソチオシアネート抗NKp46、およびフィコエリスリン抗GM-CSFで15分間染色します。もう一度、細胞を集めてPBSで3回洗浄し、遠心分離して上清を捨ててから、細胞を500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーを使用してNK細胞の免疫表現型を決定します。単独で培養した場合、NK細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子またはGM-CSFおよびNKp46の基礎レベルを発現した。侵害受容器インタクトマウスから採取したDRGニューロンと共培養した場合、カプサイシン刺激はNK細胞のGM-CSFの発現を低下させた。カプサイシンは、侵害受容器切除マウスから採取したDRGニューロンと共培養した場合、NK細胞の活性化に影響を与えませんでした。NKp46のレベルは影響を受けませんでした。このプロトコルの重要なステップは、DRGの解離と分離です。アイデアは、気泡の発生を避け、適切なサイズのピペットを使用することにより、ニューロンの生存率を最大限に高めることです。プロトコル後、研究者はRNAシーケンシングまたはqPCRを使用してFACS精製細胞の転写産物の変化を測定するか、ELISAを使用してサイトカインまたは神経ペプチドの分泌を測定することができます。このような相互作用は、NK細胞の機能が侵害受容器ニューロンによって調整されている可能性が高いことを明らかにしています。そして、このクロストークは、神経損傷、細菌およびウイルス感染から悪性腫瘍に至るまでの生物学的プロセスにおいて重要である可能性があります。

teasing-out-interplay-between-natural-killer-cells-nociceptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ナチュラルキラーT細胞（NKT）は、がん、autioimmunityの規制、感染のクリアランス、及びartherioscleroticプラークの開発に対する免疫応答の重要な決定要因である。このインタビューでは、ミッチクローネンベルクは、NKT細胞は糖脂質抗原によって活性化されるメカニズムを理解するために彼の研究室の取り組みを説明します。...

インタビュー：CD1dによる糖脂質抗原提示とNKT細胞の活性化の治療の可能性

末梢感覚神経線維のサブタイプの免疫細胞化学的同定（とそこにタンパク質発現の検出）が末梢感覚の分子メカニズムの理解の鍵となります。ここでは、末梢感覚神経線維の特異的免疫染色のための皮膚や四肢骨などの周辺/内臓の組織サンプル、、の調製のための方法を説明します。...

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

このビデオでは、酵素消化、機械的解離、および勾配遠心分離によるDRGニューロンの分離について説明しています。DRG細胞は、免疫細胞と感覚ニューロンとの間の相互作用を研究するために、細胞外マトリックス上でナチュラルキラー細胞と共培養されます。...

感覚ニューロンの単離とナチュラルキラー細胞との共培養

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。...

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。...

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

トランスレーショナルペイン研究のためのオープンソースのリアルタイム閉ループ電気閾値追跡

ニューロン膜プロテアソーム (NMP)...

体性感覚ニューロンにおける神経膜プロテアソームの細胞サブタイプ特異的解析

我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは​​、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。...

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

このビデオでは、我々は非対称的に無傷で感覚器官の前駆細胞と表皮細胞を割っての生細胞イメージングのための方法を説明します。...

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

学ぶ侵害受容器ニューロンとNK細胞の共培養法。マウス脾臓と背根神経節から細胞を単離し、相互作用を解析することで、神経免疫応答や抗腫瘍機能の制御メカニズムを解明する。

ナチュラルキラー細胞と侵害受容器ニューロンの相互作用を解明する

さらに動画を探す