Name: 厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶマウス脳の自由浮遊組織切片を用いたアストロサイトの領域体積とタイリングの解析手法。共焦点顕微鏡とカスタムコードで形態を精密測定し、神経細胞相互作用の理解に貢献します。

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顕微鏡検査はUNC神経科学顕微鏡コア(RRID:SCR_019060)で実施され、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892およびNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54 HD079124からの資金提供によって部分的に支援されました。図 1 は BioRender.com を使用して作成されました。図4の画像及びデータは、出版社の許可を得て、以前の刊行物9 から転載したものである。

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</ol>

著者には利益相反はありません。

このプロトコルは、マウス皮質におけるアストロサイトの領域体積およびアストロサイトタイリングを分析するための確立された方法を記述し、灌流から始まり画像解析で終わるすべての主要なステップを詳述する。このプロトコルは、アストロサイトのまばらまたはモザイク集団で蛍光タンパク質を発現するマウスの脳を必要とする。この要件の外では、灌流設定と埋め込み型に加えられた凍結培地の量を少し調整するだけで、このプロトコルにはあらゆる年齢のマウスを使用できます。脳組織切片7,11におけるアストロサイトの分岐の複雑さおよび体積の分析のために他の方法が公開されているが、このプロトコルにはいくつかのユニークな利点がある。まず、このプロトコルは、アストロサイト領域体積を取得するために使用できるカスタムコードを記述する。アストロサイト領域体積は、その分岐の複雑さにかかわらず、アストロサイトが占める空間全体を測定するという点で、アストロサイト細胞体積とは別個の測定値である。さらに、このプロトコルは、アストロサイト領域オーバーラップ体積、したがってアストロサイ...

アストロサイトは、脳内で多くの重要な機能を果たす精巧に分岐した細胞です1。マウス皮質では、放射状グリア幹細胞は、後期胚期および出生後早期の段階2の間にアストロサイトを生じる。出生後最初の3週間の間に、アストロサイトはサイズと複雑さを増し、シナプスと直接相互作用する何千もの細かい枝を発達させます1。同時に、アストロサイトは隣接するアストロサイトと相互作用して、ギャップジャンクションチャネル4を介した通信を維持しながら、脳3をタイル状にするための離散的で重複しない領域を確立する。アストロサイトの形態および組織は、侮辱または傷害に続く多くの疾患状態において破壊され5、適切な脳機能のためのこれらのプロセスの重要性を示す。正常な発達、老化、および疾患中のアストロサイトの形態学的特性の分析は、アストロサイトの生物学および生理学に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、遺伝子操作後のアストロサイト形態の解析は、アストロサイトの形態学的複雑さの確立と維持を支配する細胞および分子メカニズムを識別するための貴重なツールです。
マウス脳におけるアストロサイト形態の解析は、アストロサイト分岐の複雑さとアストロサイトタイリングの両方によって複雑になる。中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)をアストロサイト特異的マーカーとして用いた抗体染色は、主要な枝のみを捕捉し、アストロサイトの形態学的複雑さを非常に過小評価している1。グルタミン酸トランスポーター1(GLT-1;slc1a2)、グルタミン合成酵素、またはS100βなどの他の細胞特異的マーカーは、アストロサイト枝6を標識するより良い仕事をするが、新しい問題を導入する。アストロサイトの領域は大部分が重なり合っていないが、周辺縁にはわずかな程度の重なりが存在する。分岐の複雑さのために、隣接するアストロサイトが同じ色でラベル付けされている場合、一方のアストロサイトがどこで終わり、もう一方が始まるかを区別することは不可能である。内因性蛍光タンパク質によるアストロサイトのスパースまたはモザイク標識は、両方の問題を解決します:蛍光マーカーは、すべての枝を捕捉するために細胞を満たし、それらの隣人と区別することができる個々のアストロサイトのイメージングを可能にします。ウイルス注射、プラスミドエレクトロポレーション、またはトランスジェニックマウス系統を含む、遺伝子操作の有無にかかわらず、アストロサイトのまばらな蛍光標識を達成するために、いくつかの異なる戦略が使用されてきた。これらの戦略の実行に関する詳細は、以前に発表された研究およびプロトコル1、7、8、9、10、11、12、13に記載されている。
この記事では、まばらなアストロサイトの集団において、蛍光標識を用いてマウス脳からのアストロサイト領域体積を測定する方法について説明します(図1)。マウス皮質におけるアストロサイトの平均直径は約60μmであるため、個々のアストロサイト全体を捕捉する効率を向上させるために、厚さ100μmの切片が使用される。免疫染色は必須ではありませんが、共焦点イメージングおよび分析のために内因性蛍光シグナルを増強するために推奨されます。免疫染色はまた、微細なアストロサイト枝のより良い検出を可能にし、画像取得中の内因性タンパク質のフォトブリーチングを低減する可能性がある。厚い切片への抗体の浸透を改善し、切片化からイメージングまでの組織体積を維持するために、自由に浮遊する組織切片が使用される。アストロサイト領域容積の解析は、市販の画像解析ソフトを用いて行う。さらに、このプロトコルは、隣接するアストロサイトが異なる蛍光標識を発現するモザイク標識を有する組織切片におけるアストロサイトタイリングの分析方法を記述する。このプロトコルは、正常な脳発達中のアストロサイト増殖、ならびにアストロサイト発達に対する遺伝子操作の影響を特徴付けるために、いくつかの最近の研究1,8,9において首尾よく使用されている。

<table><tbody><tr><td>#5 鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS (トリス緩衝生理食塩水)</td><td></td><td></td><td>30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; 室温で保存 (RT)</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O;RT</td></tr><tr><td>1x TBS + ヘパリン</td><td></td><td></td><td>28.2 mg ヘパリン + 250 mL 1x TBS で保存; 4 度で保存;C</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>30% スクロース TBS</td><td></td><td></td><td>15 g スクロース、1x TBS 〜 50 mL; 4 °C; 4°C;</td></tr><tr><td>TB</td><td></td><td></td><td>40 g PFA、4-6 NaOH ペレット、100 mL 10x TBS、dH2O to 1 L; 4 °C; 4°C;C</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0.3125 g トリブロモエタノール、0.625 mL メチルブタノール、dH2O to 25 mL; 4 °Cで保存;C;</td></tr><tr><td>ブロッキングおよび抗体緩衝液</td><td></td><td></td><td>10%ヤギ血清をTBSTで作成してから2週間後に廃棄し、4°Cで保存してください。C</td></tr><tr><td>CD1 マウス</td><td>チャールズ リバー</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>脳用コレクションバイアル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>共焦点取得ソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモScientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタットブレード</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>凍結培地</td><td></td><td></td><td>2:1 30% スクロース:OCT; RT</td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol で保存</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ニワトリ 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Version 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metal lunch Tin</td><td>AQUARIUS</td><td>N/A</td><td>Amazonより、「DIY Large Fun Box」</td></tr><tr><td>メチルブタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>実装媒体</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 8.0、90% グリセロール、0.5% N-プロピルガレート;4°Cで保管します。C;最長2ヶ月間有効</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-プロピルガレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>オイル</td><td>オリンパス</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>顕微鏡/対物レンズ</td></tr><tr><td>操作はさみ6 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>軌道プラットフォームシェーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>88861043</td><td>必要な最小速度:25 rpm</td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>Bogrinuo</td><td>N / A</td><td>アマゾンから、"詳細ペイントブラシ-ミニチュアブラシ「</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット (5.75インチ)」</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット (9インチ)</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP抗体</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>切片化培地</td><td></td><td></td><td>1:1 グリセロール:1x TBS; RT</td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム クロロイドナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td><td>0.2% Triton in 1x TBS; RT</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-bromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (高品質)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>カスタムXTensionは、補足材料として提供します</td></tr></tbody></table>

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

アストロサイトは、脳内のほぼすべてのタイプの細胞および構造と相互作用することを可能にする驚くべき程度の形態学的複雑さを有する。これらの相互作用を通じて、アストロサイトはシナプス形成、神経伝達、イオン恒常性など、多くの重要な脳機能を積極的に調節します。げっ歯類の脳では、アストロサイトは出生後最初の3週間でサイズと複雑さを増し、脳をタイル状にするために、重複しない明確な領域を確立します。このプロトコルは、マウス脳からの自由浮遊組織切片を用いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイトタイリングを分析するための確立された方法を提供する。まず、このプロトコルは、自由に浮遊する組織切片の組織収集、凍結切断、および免疫染色のステップを記述する。第2に、このプロトコルは、市販の画像解析ソフトウェアを用いて、アストロサイトの領域体積および領域重複体積の画像取得および分析を記述する。最後に、この原稿では、これらの方法の利点、重要な考慮事項、一般的な落とし穴、および制限について説明します。このプロトコルは、アストロサイトのスパースまたはモザイク蛍光標識を有する脳組織を必要とし、一般的なラボ機器、共焦点顕微鏡、および市販の画像解析ソフトウェアで使用するように設計されています。

図 1 に、このプロトコルの主要なステップとワークフローの概略図を示します。 図 2 は、画像解析ソフトウェアを使用してサーフェスを生成し、サーフェスに近いスポットを生成し、凸包を生成するための主要な手順のスクリーンショットを示しています。 図3は 、アストロサイトの領域の重複/タイリングを決定するためのこの手法の適用を示しています。 図4において、以前に公開された原稿9 からの代表的な結果は、このプロトコルの適用を実証する。図 4A および 図4Bにおいて、アストロサイト富化細胞接着分子hepaCAMのノックダウンは、アストロサイト領域容積を有意に減少させる。図 4C および...

このプロトコールは、マウス脳の自由浮遊組織切片の切片化、染色、および画像化のための方法を記載し、続いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイト領域オーバーラップまたはタイリングの分析の詳細な説明を記載する。

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

アストロサイトがどのように発達し、その複雑な形態を確立するかを理解することは、脳がどのように発達し機能するかを理解するために不可欠です。このプロトコルは、脳組織におけるアストロサイト形態の重要な側面を分析する方法を記述している。このプロトコルは、カスタムコードを使用して、厚い組織切片のアストロサイト領域体積を測定します。この戦略は、隣接するアストロサイト間の領域重複の量を測定するためにも適用することができる。このプロトコルをアストロサイトの遺伝子操作と組み合わせることで、研究者はアストロサイトの発生とアストロサイト-アストロサイト相互作用における特定のタンパク質と経路の役割を直接調査することができます まず、1ミリリットルの10%Triton Xを50ミリリットルのチューブに添加し、チューブをTBSで50ミリリットルに充填することによって、TBSTの新鮮な溶液を調製します。 ヤギ血清とTBSTを組み合わせて、各脳に2ミリリットルのブロッキングおよび抗体溶液を調製する。15ミリリットルのチューブ。次に、24ウェルプレートにラベルを付け、異なるカラムの異なる溶液に異なるサンプルを異なる列に配置し、洗浄1、洗浄2、および洗浄3とラベル付けされた最初の3つの列に1ミリリットルのTBSTを加え、4番目のカラムに1ミリリットルのブロッキング溶液を加えます。5.75インチパスツールピペットの端部をブンゼンバーナーを使用して小さなフックに溶かしてガラスピックを作製し、次いで、組織切片を12ウェルプレートからピックを用いて24ウェルプレートの洗浄1カラムに移し、次いで、洗浄1、2で切片をそれぞれ10分間洗浄し、 ガラスピックを用いて3つのウェルを1つのウェルから次のウェルに切片を移し、続いて切片をブロッキング溶液中で1時間インキュベートした。抗体溶液に抗体を添加してqミリリットルの一次抗体溶液を調製し、次いで、4°Cで4,000倍g以上で5分間遠心分離して短時間ボルテックスする。次に、切片を一次抗体中で、振とうしながら摂氏4度で2〜3晩インキュベートする。一次抗体インキュベーション後、洗浄ウェルから1日目TBSTを吸引し、各洗浄ウェルに1ミリリットルの新しいTBSTを加え、切片を最初の洗浄ウェルに移動します。次に、切片を二次抗体中で室温で3時間インキュベートする。二次抗体インキュベーション後、洗浄ウェルから2日目TBSTを吸引し、各洗浄ウェルに1ミリリットルの新しいTBSTを加え、切片を最初の洗浄ウェルに移動します。最終洗浄中は、マウント媒体を摂氏4度から取り出して室温まで温め、TBSと脱イオン水の2対1の混合物を調製し、ペトリ皿に加えます。次に、表面にTBSと脱イオン水の2対1混合物を800マイクロリットル加えて顕微鏡スライドを作製した。洗浄3ウェルから切片をシャーレに移し、次いで細かい絵筆を用いて、シャーレからスライド上の液体に切片を1枚ずつ移す。次に、ペイントブラシを使用して、スライド上で平らになるようにセクションを慎重に配置します。慎重に、P-1000ピペットでスライドから余分な液体を取り除き、続いて真空吸引します。余分な液体がスライドからすべて取り除かれたら、トランスファーピペットを使用してすぐに各セクションに1滴の取り付けメディアを追加し、カバースリップをスライドの上に静かに置きます。マウントメディアが数分間広がるのを待ってから、カバースリップの下から出てくる余分なマウントメディアを真空吸引で取り外します。その後、カバースリップの4つの端をすべて透明なマニキュアで密封します。スライドを室温で30分間乾燥させ、その後4°Cで平らに保管します。10倍の対物レンズを使用して、イメージングのために個々の細胞を見つけ、実験に関連する特定の脳領域またはサブ領域を書き留め、フォーカスノブを使用して、アストロサイト全体がセクション内に含まれるかどうかを判断します。その後、高倍率のオイル対物レンズに切り替えて、セルに焦点を合わせます。アイピースを覗き込みながら、フォーカスノブを使用してセルの上から下に移動し、セルを目視で検査して、セル全体がセクション内に収まっていることを確認します。共焦点顕微鏡関連の集録ソフトウェアを使用して、集録パラメータを調整して適切な信号対雑音比と詳細レベルを取得し、40倍対物レンズの場合は2倍ズームを使用し、60倍または63倍対物レンズを使用する場合はズームを使用しません。Zスタックの上下の境界を0.5マイクロメートルのステップサイズで設定し、細胞の蛍光標識なしでアストロサイト全体が最初と最後の画像でキャプチャされるようにします。解析を開始する前に、XT フォルダの rtmatlab サブフォルダにファイルを貼り付けて、凸包拡張ファイル XtspotsConvexHull をインストールします。Imaris ファイル・コンバーターを使用して、イメージを IMS 形式に変換します。次に、画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開き、[3D 表示] ボタンを選択して画像を 3D モードで表示し、セルが包含基準を満たしていることを確認します。サーフェスを作成するには、青色の「新しいサーフェスを追加」(Add New Surfaces) アイコンをクリックし、サーフェス作成ツールのサイズの下にあるボックスに寸法を入力するか、黄色のボックスの端をドラッグして、セルの周囲に関心領域を作成します。次に、黄色のバーをドラッグするか、ボックスに値を入力して、グレーの表面がセルの境界を超えずにできるだけ多くのセル信号を埋めるようにして、しきい値の絶対強度を調整します。その後、緑色の矢印をクリックしてサーフェスの生成を終了します。新しく生成されたサーフェスを慎重に検査し、セルの一部ではないサーフェスピースを選択して削除し、[鉛筆編集]ツールをクリックしてから[削除]オプションをクリックします。残りのサーフェスピースを統一するには、「ファネルフィルター」アイコンをクリックしてすべてを選択し、「鉛筆編集」アイコンをクリックして「統一」オプションを選択します。オレンジ色の「新規スポットを追加」アイコンをクリックし、ドロップダウンリストから正しいソースチャンネルを選択し、0.400マイクロメートルの推定XY直径値をボックスに入力します。次に、緑色の矢印をクリックしてスポットの作成を終了し、スポットを再選択します。[フィルタ]アイコンをクリックし、[サーフェス サーフェス X](サーフェス X は解析対象のサーフェス)の[サーフェス X] を選択し、電源ボタンが緑色になっていることを確認します。次に、最小距離からマイナス1.0マイクロメートルを下限ボックスに入力し、最大距離0.1マイクロメートルを上限しきい値ボックスに入力し、[セクションを新しいスポットに複製]ボタンをクリックして、新しく作成したスポットがソフトウェアウィンドウの左上パネルで選択されていることを確認します。その後、ギアツールアイコンをクリックし、凸ハルプラグインを1回だけクリックし、MATLABウィンドウが表示されるのを待ってから消え、3Dビューで固体船体になります。左上のパネルで、「スポット X 選択の凸船体」、スポット X 選択が「新しく作成されたスポット」である最短距離」が選択されていることを確認し、船体をクリックして選択します。次に、グラフ統計アイコンをクリックします。[選択] タブで、上部のドロップダウン リストから [特定の値] が選択されていることを確認し、下部のドロップダウン リストから [ボリューム] を選択してから、船体のボリュームを記録してファイルを保存し、次のイメージに進みます。アストロサイト領域体積は、膜標的赤色蛍光タンパク質を発現するアストロサイトにおいて測定した。アストロサイト富化細胞接着分子hepaCAMのノックダウンは、アストロサイト領域体積を有意に減少させる。二重マーカーを用いたモザイク解析を用いて、野生型アストロサイトが赤色蛍光タンパク質を発現し、hepaCamノックアウトアストロサイトが緑色蛍光タンパク質を発現するマウスを作製した。隣接する赤色および緑色蛍光タンパク質アストロサイト対間の領域重複の割合を計算した。hepaCAMおよび緑色アストロサイトの遺伝子改変を有するマウスは、野生型のみのアストロサイト対と比較して、赤色の野生型隣接体との領域重複体積の割合が有意に増加したことを示した。この結果は、hepaCAMが正常なアストロサイト領域容積、およびアストロサイトタイリングに必要であることを実証する。セルが包含基準を満たしていることを確認することが重要です。不完全なセルはテリトリーのボリュームが小さくなり、全体的な結果と結論に影響を与える可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、一次抗体と二次抗体を使用して、蛍光標識されたアストロサイトによる固定マウス脳組織切片の免疫染色手順と、共焦点顕微鏡で染色されたアストロサイトの画像を取得する手順を示しています。...

マウス脳組織切片における蛍光標識アストロサイトの免疫染色

出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

固定マウス脳スライスにおける蛍光色素イオントフォレーシスを用いたアストロサイト形態の可視化

出典: Bagheri, M., et. al.アストロサイトの三次元共焦点形態計測解析のためのプロトコルJ. Vis.

共焦点顕微鏡を用いた免疫標識星状細胞の三次元イメージング

中枢神経系の星状細胞は、有害な刺激に反応して機能的および構造的特性を変化させます。このレポートは、疾患状態または治療介入後の三次元アストロサイトの形態を評価するためのプロトコルを示しています。...

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

記載されているパイプラインは、ギガバイトより大きい電子顕微鏡データセットのセグメンテーション用に設計され、細胞全体の形態を抽出します。セルを3Dで再構築すると、個々のニーズに合わせて設計されたカスタマイズされたソフトウェアを使用して、3Dで直接定性的および定量的な分析を実行し、また、仮想現実を使用してビューの閉塞を克服することができます。...

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

アストロサイトは形態的に複雑な細胞であり、その複数のプロセスとふさふさした領域によって例示される。彼らの精巧な形態を分析するために、我々は軽く固定された組織で細胞内ルシファー黄色イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを提示する。...

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。...

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

アストロサイトは大脳皮質を均一にタイル化し、複雑な形態の分析を細胞レベルで困難にします。ここで提供されるプロトコルは、子宮内のエレクトロポレーションに基づく多色標識を使用して、皮質アストロサイトを単一にし、ユーザーフレンドリーな画像解析パイプラインでボリュームと形態を分析します。...

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と脳クリアリングを組み合わせることで、多数のニューロンとアストロサイトを同時に調べることができます。...

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

学ぶマウス脳の自由浮遊組織切片を用いたアストロサイトの領域体積とタイリングの解析手法。共焦点顕微鏡とカスタムコードで形態を精密測定し、神経細胞相互作用の理解に貢献します。

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

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