Name: リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶ PIB-MSを用いたリンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターの質量分析ベースの同定法。細胞や組織から内因性タンパク質を濃縮し、質量分析で定量化する革新的なプロテオミクス技術です。

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<li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li>
<li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li>
<li>Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pot%2C+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
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<li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet%3A+an+open-source+MS%2FMS+sequence+database+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もなく、利益相反もありません。

PIB-MSは、単一の分析でさまざまなサンプルソースからPPPomeを定量的にプロファイリングするために使用される化学プロテオミクスアプローチです。キナーゼ阻害剤ビーズを使用して、キノメとそれが癌および他の疾患状態においてどのように変化するかを研究するために多くの研究が行われてきた10、11、12、13。しかし、PPPomeの研究は遅れをとっている。このアプローチは、このギャップを埋め、細胞脱リン酸化の調節に光を当てることができると期待しています。ここでは、PIBを使用して、PP1、PP2A、PP4、PP5、およびPP6の触媒成分および非触媒成分を濃縮できることを示しています。我々はまた、様々な細胞株、組織型、および生物における新しいPPP相互作用因子候補を同定することができる。
PIB-MS プロトコルには、見落とされてはなら...

タンパク質リン酸化は、DNA損傷に対する応答、成長因子シグナル伝達、および有糸分裂1,2,3の通過を含むがこれらに限定されない、ほとんどの細胞プロセスを制御する。哺乳動物細胞では、タンパク質の大部分は、ある時点で1つ以上のセリン、スレオニン、またはチロシン残基でリン酸化され、ホスホセリンおよびホスホスレオニンは、すべてのリン酸化部位の約98%を占める2,3。キナーゼは細胞シグナル伝達において広く研究されてきたが、動的細胞プロセスの調節におけるPPPの役割はまだ現れている。
リン酸化ダイナミクスは、キナーゼとホスファターゼの間の動的相互作用によって制御される。哺乳類細胞には、セリン/スレオニンリン酸化を触媒する400以上のプロテインキナーゼが存在する。これらの部位の90%以上は、PP1、PP2A、PP2B、PP4-7、PPT、およびPPZ 2,3からなる酵素の小さなファミリーであるリンタンパク質ホスファターゼ(PPP)によって脱リン酸化されている。PP1およびPP2Aは、細胞内のホスホセリンおよびホスホスレオニン脱リン酸化の大部分を担う2、3、4。キナーゼとホスファターゼの数の顕著な違いおよびインビトロでのPPP触媒サブユニットの特異性の欠如は、キナーゼがリン酸化の主な決定因子であるという信念につながった2,3。しかしながら、複数の研究は、ホスファターゼが多量体ホロ酵素5、6、7、8、9の形成を通じて基質特異性を確立することを示している。例えば、PP1は、触媒サブユニットおよび、所与の時点で、150を超える調節サブユニットのうちの1つからなるヘテロ二量体である6、7、8である。逆に、PP2Aは、足場(A)、調節(B)、および触媒(C)サブユニット2,3,9から形成されるヘテロ三量体である。PP2A調節サブユニット(B55、B56、PR72、および線条体)の4つの異なるファミリーがあり、それぞれに複数の遺伝子、スプライスバリアント、および局在化パターン2、3、9がある。PPPの多量体性は、キナーゼおよびPPP触媒サブユニットの数のギャップを埋める。しかし、PPPシグナリングを研究するための分析上の課題が生じます。PPPシグナル伝達を網羅的に解析するためには、細胞または組織内の様々なホロ酵素を調べることが重要です。キナーゼ阻害剤ビーズ(マルチプレックス阻害剤ビーズまたはキノビーズと呼ばれる)の使用を通じてヒトキノメの研究において大きな進歩がなされており、キナーゼ阻害剤がビーズに固定化され、質量分析法が濃縮キナーゼおよびそれらのインターアクターを同定するために使用される化学的プロテオミクス戦略10,11,12,13。
我々は、PPP生物学を研究するために同様のアプローチを確立している。この技術は、ホスファターゼ阻害剤ビーズ(PIB)と呼ばれるミクロシスチン−LR(MCLR)と呼ばれる固定化された非選択的PPP阻害剤を有するビーズを用いたPPP触媒サブユニットの親和性捕捉を含む14,15。タンパク質活性または局在化を変化させる可能性のある外因性PPPサブユニットの内因性タグ付けまたは発現を必要とする他の方法とは異なり、PIB-MSは、内因性PPP触媒サブユニット、それらに関連する調節および足場サブユニット、および所定の時点または特定の治療条件下での細胞および組織からの相互作用タンパク質(PPPomeと呼ばれる)の濃縮を可能にする。MCLRは、PP1、PP2A、PP4-6、PPT、およびPPZをナノモル濃度で阻害し、PIBをPPPome16の濃縮に非常に効果的にする。この方法は、細胞から臨床サンプルまでの任意の出発物質に使用するためにスケーリングすることができる。ここでは、内因性PPPomeとその修飾状態を効率的に捕捉、同定、定量化するためのPIBおよび質量分析(PIB-MS)の使用について詳しく説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> 図1:PIB-MSプロトコルの視覚的な概要 PIB-MS実験では、細胞から腫瘍まで、さまざまな形態でサンプルを得ることができます。サンプルは、PPP 濃縮の前に収集、溶解、および均質化されます。PPPを富化するために、溶解液をMCLRなどのPPP阻害剤の有無にかかわらずPIBと共にインキュベートする。その後、PIBを洗浄し、PPPを変性条件下で溶出します。サンプルは、SP3タンパク質濃縮、トリプシン消化、および脱塩による洗剤の除去によって質量分析分析用に調製される。次いで、サンプルを、質量分析分析の前に任意選択でTMT標識することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
PIB-MSには、細胞または組織の溶解および清澄化、溶解液とPIBとのインキュベーション、溶出、およびウェスタンブロッティングまたは質量分析ベースのアプローチによる溶出液の分析が含まれます(図1)。遊離MCLRの添加は、特異的PIB結合剤を非特異的相互作用体から区別するための対照として使用することができる。ほとんどのアプリケーションでは、溶出液中のタンパク質を直接同定するためにラベルフリーのアプローチを使用できます。定量化または低存在種の同定においてより高い精度が必要な場合は、タンデム質量タグ(TMT)標識によるさらなる処理を使用して、カバレッジを増加させ、入力を減少させることができる。

<table><tbody><tr><td>アセトニトリル(ACN)</td><td>ハネウェル</td><td>AH015-4</td><td>注意:ACNは可燃性で有毒です。手袋を着用し、化学ドラフトで作業してください。</td></tr><tr><td>無水アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td>注意: ACNは可燃性で有毒です。手袋を着用し、化学ヒュームフードで作業してください。</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>モデル番号5424</td><td></td></tr><tr><td>ベータグリセロリン酸、二ナトリウム塩 五水和物</td><td>アクロスオーガニックス 410991000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>モデル番号5810 R 15アンペアバージョン</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>デュースティッシュグラインダー</td><td>フィッシャーブランド ペレット 乳棒</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>エンポア固相抽出ディスク、C18</td><td>CDS アナリティカル</td><td>76333-132</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ チューブ、1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363204</td><td>クリティカル: 他のチューブはポリマーをサンプルに浸出し、分析を汚染する可能性があります。</td></tr><tr><td>Eppendorfチューブ、2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>CRITICAL:他のチューブはポリマーをサンプルに浸出し、分析を汚染する可能性があります。</td></tr><tr><td>抽出プレートマニホールド</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT097944</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ、50mL</td><td>VWR</td><td>21008</td><td></td></tr><tr><td>ジェネリック ブラントエンドニードルとプランジャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジェネリック磁気分離ラック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>塩化水素(HCl)</td><td>VWR ケミカルズ BDH</td><td>BDH3028</td><td>注意:HClは腐食性です。手袋を着用し、化学ドラフトで作業してください。</td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン溶液 50% (wt/vol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター, 65 >C</td><td>VWR</td><td>モデル番号 1380FM</td><td></td></tr><tr><td>Koptec 純エタノール、200 プルーフ</td><td>デコン ラボ</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 用 メタノール (MeOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-4L-R</td><td>注意: MeOH は可燃性で有毒です。手袋を着用し、化学薬品のヒュームフードで作業してください。</td></tr><tr><td>Microcystin LR (MCLR)</td><td>ケイマンケミカル</td><td>10007188</td><td>注意:MCLRは有毒ですので、取り扱いの際は手袋を着用し、皮膚に触れないようにしてください。</td></tr><tr><td>PBS、1&times;カルシウムとマグネシウムなし、pH 7.4 &plusmn; 0.1</td><td>コーニング</td><td>&nbsp;21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>pHテストストリップ、例えばMilliporeSigma MColorpHast pHテストストリップおよび指示薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1095310001</td><td></td></tr><tr><td>PIBs</td><td></td><td></td><td>PIBsの生成のためのプロトコルについては、Moorhead et al., 2007を参照してください。</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、10 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491504</td><td>CRITICAL:他のチップは、ポリマーをサンプルに浸出し、分析を汚染する可能性があります。</td></tr><tr><td>ピペットチップ、1000 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491555</td><td>CRITICAL:他のチップは、ポリマーをサンプルに浸出し、分析を汚染する可能性があります。</td></tr><tr><td>ピペットチップ、200 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491539</td><td>CRITICAL:他のチップはポリマーをサンプルに浸出し、分析を汚染する可能性があります。</td></tr><tr><td>プラスチックシリンジ、10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル III</td><td>研究製品 International</td><td>P50700-1</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus ハイブリッド四重極-Orbitrap 質量分析計、Oribtrap Fusion、Orbitrap Fusion Lumos、または Orbitrap Eclipse トライブリッド質量分析計&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵卓上遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>8 rpm 回転</td></tr><tr><td>サンプル収集プレート、96 ウェル、1 mL</td><td>Waters</td><td>WAT058957</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1311-1</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシンググレード変性トリプシン</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>EMDの化学薬品</td><td>SX0299-1</td><td>注意:アジ化ナトリウムは爆発性で有毒です;手袋を着用し、化学薬品のヒュームフードで作業し、金属との接触を避けてください。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター(ブランソンデジタルソニファイア)</td><td></td><td>モデル番号SFX 250</td><td></td></tr><tr><td>SPE C18 脱塩プレート</td><td>Waters</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBeads 磁性カルボン酸修飾粒子 (SP3 ビーズ)</td><td>Cytiva</td><td>6.51521E+13</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>モデル番号 5350</td><td></td></tr><tr><td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &times; 0.8 mg per tag</td><td>ThermoFisher</td><td>A37725</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸(TFA)</td><td>ハネウェル</td><td>T6508-25ML</td><td>注意:TFAは腐食性があり、接触すると皮膚を刺激します。手袋と目の保護具を着用し、化学薬品のヒュームフードで作業してください。</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>真空遠心分離機および蒸気トラップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>モデル番号SpeedVac SPD120 & RVT5105</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water LC-MS</td><td>Honeywell</td><td>LC365-4</td><td></td></tr></tbody></table>

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

ほとんどの細胞プロセスは、動的タンパク質リン酸化によって調節される。タンパク質の4分の3以上がリン酸化されており、リンプロテインホスファターゼ(PPP)はすべての細胞セリン/スレオニン脱リン酸化の90%以上をコーディネートしています。タンパク質リン酸化の調節解除は、癌および神経変性を含む様々な疾患の病態生理学に関与している。それらの広範な活性にもかかわらず、PPPsおよびPPPによって制御される分子機構は、ほとんど特徴付けられていない。ここでは、ホスファターゼ阻害剤ビーズおよび質量分析(PIB-MS)と呼ばれるプロテオミクスアプローチが、任意の細胞株または組織を使用してわずか12時間でPPP、それらの翻訳後修飾、およびそれらの相互作用因子を同定および定量するために記載されている。PIB-MSは、セファロースビーズに固定化された非選択的PPP阻害剤であるミクロシスチン-LR(MCLR)を利用して、内因性PPPおよびその関連タンパク質(PPPomeと呼ばれる)を捕捉および濃縮する。この方法は、PPPのタグ付きバージョンの外因性発現または特異的抗体の使用を必要としない。PIB-MSは、進化的に保存されたPPPを研究し、脱リン酸化シグナル伝達に関する現在の理解を広げる革新的な方法を提供します。

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> 図2:特定のPIBバインダーの同定(A)PIB-MSを介して、さまざまな組織タイプまたは細胞を分析できます。生物学的三連中のHeLa細胞をDMSOまたはPPP阻害剤MCLRで処理し、PIBと共にインキュベートし、LC-MS/MS(B)DMSOおよびMCLR処理HeLa細胞溶解物におけるPIB-MS分析の火山プロット、特定のPIB結合剤を赤色で示した。PPP触媒サブユニットは標識され、青色で示されている。新規候補PPPサブユニットまたは相互作用タンパク質は黒色で示されている。非特異的結合剤は灰色で示されている。(c)濃縮の再現性を実証するためにDMSO...

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MSは、内因性リンプロテインホスファターゼを濃縮するために使用される新しい技術であり、それらは細胞および組織からのタンパク質と相互作用している。これは、質量分析ベースのプロテオミクスを用いたこれらのタンパク質の同定および定量を含む。この技術は、タンパク質活性または局在化を変化させる可能性のあるリンタンパク質ホスファターゼのタグ付きバージョンの外因性発現を必要としない。また、非特異的であるか、または特定のアイソフォームを区別できない可能性のある抗体は使用しません。PPPMを調査するためのこの方法は、細胞から臨床サンプルまで、あらゆるもので使用するためにスケーリングすることができる。開始するために、室温で2分間277回gで遠心分離することによって細胞ペレットを集める。培地を除去し、5ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。テキストプロトコルに記載されているように溶解バッファーを準備し、氷の上にとどまります。1ミリリットルのチルド溶解バッファーをサンプルに加え、超音波処理によってサンプルを均質化し、パルス間で細胞を氷上に保ちます。ライセートを新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。超音波処理したサンプルを21、130回gで4°Cで15分間遠心分離する。溶解物のアリコートを使用して、ビシンコニン酸アッセイを用いて総タンパク質濃度を定量する。このステップは、各サンプル中のタンパク質濃度が等しいことを保証するために不可欠です。リンプロテインホスファターゼ阻害剤対照の場合、各サンプルについて等しいタンパク質濃度の2つのアリコートを調製する。溶解バッファーを使用して、各チューブのタンパク質濃度が等しくなるようにサンプルを希釈することができます。1つのアリコートに1マイクロモルの遊離ミクロシスチン-LRを加え、他方に等量のDMSOを加える。サンプルをボルテックスし、氷上で15分間インキュベートします。ホスファターゼ阻害剤ビーズの調製は、試料調製の項で説明したインキュベーションステップの前または最中に実施されるべきである。1ミリグラムのタンパク質に対して10マイクロリットルの固体ホスファターゼ阻害剤ビーズ(PIB樹脂)を使用し、1.5ミリリットルのチューブに加えます。ボルテックス処理により0.5ミリリットルの溶解バッファーでPIBを3回洗浄し、続いて室温で30秒間376回gで遠心分離した。洗浄したPIBに適量の溶解バッファーを加え、50容量%のPIBバッファー溶液を作ります。ピペットチップとスラリーを静かにピペッティングして混合し、PIBを再懸濁します。20マイクロリットルのスラリーを、0.5ミリリットルの溶解緩衝液を含む1.5ミリリットルのチューブに移す。チューブを376回gで30秒間回転させる。各チューブには、同量のPIBが含まれています。各チューブに固形樹脂と最大50マイクロリットルの溶解バッファーのみを残しながら上清を捨てる。溶解物をPIBを含む適切に標識されたチューブに移す。溶解液をPIBと共に摂氏4度で1時間インキュベートし、8rpmで回転させる。溶解液とのインキュベーション後、PIBを摂氏4度で30秒間、376倍gで遠心分離し、上清を除去する。0.5ミリリットルの溶解バッファーを加えてビーズを洗浄し、チューブを反転させます 遠心分離でビーズを集め、上清を除去します。この手順を繰り返して、合計 3 回の洗浄を行います。最終洗浄後、PIBをピペッティングせずに溶解バッファーをできるだけ除去します。2%SDSを含む溶出バッファーを調製し、溶出バッファーをPIBの4~5倍容量で添加します。摂氏65度で1時間インキュベートし、ビーズからリンタンパク質ホスファターゼを溶出させる。チューブを室温で30秒間、376倍gで遠心分離する。溶出液を別のチューブに集め、質量分析分析またはウェスタンブロッティングに進みます。PIBを再生するには、2%SDS溶液中で、8rpmで回転させて室温で1時間インキュベートします。ビーズを25ミリモルのTris-HCl pH 7.5で3〜5回洗浄し、洗浄あたり30分間回転させる。PIBをアジ化ナトリウムと共に25ミリモルのトリスHCL pH 7.5に貯蔵する。質量分析分析の場合、データのフィルタリングおよび分析の方法はさまざまで、研究者または中核施設によって実行され得る。種固有のプロテオーム データベースに対して生データを検索した後、検索結果をフィルター処理し、Microsoft Excel ワークシートとしてエクスポートします。データを 3 つずつ分析します。ラベルのない定量化のために、MS1ピーク面積測定を使用してデータを定量化します。PPPサブユニットおよびそれらのインターアクターde novoを同定するために、ミクロシスチン-LR阻害およびDMSO処理サンプルの生物学的三連を比較する。3 つの DMSO 対照処理サンプルのうち少なくとも 2 つにおいて、合計ペプチド数が 1 を超えるタンパク質のみが存在するようにデータをフィルタリングします。樹脂に非特異的に結合するタンパク質を除外するには、ミクロシスチン-LR処理条件における総ペプチド数がPPP触媒サブユニットの総ペプチド数よりも多いタンパク質を除去する。ケラチン、コラーゲン、リボソームタンパク質、不均一な核リボヌクレオタンパク質などの一般的な汚染物質を分析から除外します。CSVファイルは、ペルセウスにデータをインポートするために不可欠です。フィルター処理されたデータを Perseus にインポートするには、[読み込み] セクションの [汎用マトリックスのアップロード] をクリックします。基本変換に移動し、データを選択し、変換関数を x の対数ベース 2 として指定して、データを変換します。正規分布から欠損値を求めるには、[代入]、[正規分布の欠損値を置き換える]に移動し、データを選択し、計算の幅とシフトを下げます。分位点正規化を実行するには、[正規化]、[分位点正規化] の順に移動します。アノット行、カテゴリ注釈行に移動してデータに注釈を付けます。テスト、2サンプル検定に移動し、グループ、実行する検定、および切り捨てに使用する多重仮説検定修正の方法を選択して、学生のT検定を実行します。この関数は、対数 2 比も計算します。リンタンパク質ホスホテートおよびそのインターアクターを、PIBプルダウン実験を用いてHeLa細胞において同定し、続いてDMSO処理およびミクロシスチン-LR処理サンプル中のタンパク質存在量の標識フリー定量を行った。質量分析の火山プロットでは、特定のPIBバインダーが赤、触媒サブユニットが青、新しい候補PPPサブユニット、または相互作用タンパク質が白で示されました。非特異的結合剤は灰色で示した。DMSO処理HeLa細胞溶解物からのlog2領域の散布図は、存在量が高度に相関していることを示し、データの再現性を示した。すべてのリンタンパク質ホスファターゼサブユニットおよび相互作用タンパク質のネットワーク解析は、これらのタンパク質がPIBプルダウンにおける特異的相互作用因子であることを示した。グローバルプロテオミクス解析を実施し、その結果をPIB解析と比較して、PPPome組成がPPPの存在量によって駆動されるのか、翻訳後メカニズムによって調節されているのかを判断することができます。PIB-MSは広く適用可能なツールであり、同相間サンプルと有糸分裂サンプルの違い、がん細胞株間の差異など、さまざまな条件下でのPPP発現パターンの違いを特定することができました。

a-mass-spectrometry-based-approach-to-identify-phosphoprotein

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Biochemistry

生物化学

冷凍融解、尿素solubilziation、HILIC分画とリン酸化ペプチドのIMAC濃縮を用いた定量的リン酸化の手順の説明。...

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。...

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

このプロトコルでは、抽出し、前立腺癌細胞株あるいは質量分析を用いたプロテオミクスによるリン酸化プロテオーム解析のためのティッシュから調製したカゼインホスホペプチドを豊かにする手順について説明します。...

前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調べる定量的ラベル無料質量と相まってリン酸化ペプチド濃縮

ここでは、co 免疫沈降法及び酵素採用し酵素活性細胞膜受容体の特定のタンパク質ドメインの貢献を同時に勉強するビーズの酵素活性測定のためのプロトコルを提案する.

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。...

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。...

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。...

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

翻訳後修飾(PTM)は、タンパク質の構造と機能を変化させます。複数のPTMタイプを同時に強化する方法は、分析のカバレッジを最大化することができます。我々は、膵臓組織におけるタンパク質N-グリコシル化およびリン酸化の同時濃縮および分析のための質量分析に続く二重機能Ti(IV)固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。...

ヒト膵臓組織からのN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析のためのスピンチップ濃縮戦略

学ぶ PIB-MSを用いたリンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターの質量分析ベースの同定法。細胞や組織から内因性タンパク質を濃縮し、質量分析で定量化する革新的なプロテオミクス技術です。

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

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