複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証

我々のプロトコルは、共焦点顕微鏡を用いて同期部を観察する実行可能な方法を提供し、神経線維の観察における精度を保証することができた。シンプルで簡単な組織洗浄プロトコルは、この技術の主な利点です。組織洗浄プロセスは効率的であり、約30分〜1時間かかる。

テキスト原稿に記載されているように、安楽死したラットに灌流を行う。メスを使用して、背骨とソールの皮膚を後足から取り除きます。凍結切片を必要とするサンプルの場合、組織を0.1モルPB中のアルデヒドから4%で2時間固定する。

洗浄後、皮膚組織を摂氏37度で2%のアガロースに埋め込み、冷却のためにアイスボックスの中に置きます。取り付けた組織を氷水で振動マイクロトーンに固定し、横方向に500マイクロメートルの厚さでスライスします。スライス後、切片からアガロースを取り出し、1x PBSを含む6ウェルプレートに保存します。

組織切片を1x PBS中の2%トリトンX-100の溶液中で摂氏4度で一晩インキュベートする。組織切片をブロッキングバッファーに入れ、シェーカー上で毎分72回転で摂氏4度で一晩回転させます。マイクロ遠沈管内の希釈緩衝液中のマウスモノクローナル抗CGRPおよびヒツジポリクローナル抗LYVE-1抗体の一次抗体を含む溶液に組織切片を移す。

その後、シェーカーを摂氏4度で2日間回転させます。組織切片を室温の洗浄バッファーで2回洗浄し、次いで洗浄バッファー中の摂氏4度で一晩シェーカーに保管する。翌日、マイクロ遠沈管内の二次抗体を含む混合溶液に組織切片を移し、シェーカー上で毎分72回転で摂氏4度で5時間回転させる。

6ウェルプレート中の組織切片を洗浄バッファーで室温で1時間2回洗浄する。組織切片をシェーカー上の洗浄バッファーに4°Cで一晩保管してください。組織切片を組織透明化試薬に移し、シェーカー上で毎分60回転で室温で1時間穏やかに回転させる。

透明な組織をスライドに取り付け、スペーサーで組織を囲み、新鮮な組織透明化試薬とカバースリップで隙間を貼り付けます。3Dパターンは、CGRP陽性神経線維が皮下組織および真皮を通って表皮に通過することを実証した。これらの神経線維は、真皮内で分岐し、表皮で終端した皮下組織において束状に走った。

これに対し、陽性血管およびLYVE-1陽性リンパ管におけるファロイジンは、皮下組織および真皮に分布している。一般に、CGRP陽性神経線維は、毛むくじゃらでグラブラスな皮膚において3Dネットワークを形成する血管およびリンパ管に平行に、または周囲を走っていた。従来の手法では、神経線維血管やリンパ管は、薄切片にCGRPファロイジンやLYVE-1で明確に標識されていましたが、これらの構造の観察はスライスの厚さによって制限され、完全に観察することはできませんでした。

厚さ30マイクロメートルの区間では、CGRP陽性神経線維の表面積において、毛むくじゃらの皮膚とグラブラスな皮膚との間に差はなかった。厚さ300マイクロメートルの組織切片では、毛むくじゃらの皮膚と比較して、グラブラス皮膚のCGRP陽性神経線維の表面積が有意に増加した。抗体インキュベーション後には、浸透圧の高い洗浄バッファーを使用することが重要です。

数回、免疫蛍光染色に要する洗浄時間が必要である。この手順に従えば、6つの切片に他の組織や臓器の染色や観察も存在する可能性があると考えています。この技術は、神経繊維の表面積と状態に遭遇する神経科学研究者を助けることができる。

また、組織や臓器の革新を観察するのにも役立ちます。