複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証
May 20th, 2022
組織切片の厚さは、皮膚神経支配の形態学的研究を制限した。本プロトコールは、共焦点顕微鏡下で厚さ300μmの組織切片中の皮膚神経線維を可視化する独自の組織透明化技術を記載する。
我々のプロトコルは、共焦点顕微鏡を用いて同期部を観察する実行可能な方法を提供し、神経線維の観察における精度を保証することができた。シンプルで簡単な組織洗浄プロトコルは、この技術の主な利点です。組織洗浄プロセスは効率的であり、約30分〜1時間かかる。
テキスト原稿に記載されているように、安楽死したラットに灌流を行う。メスを使用して、背骨とソールの皮膚を後足から取り除きます。凍結切片を必要とするサンプルの場合、組織を0.1モルPB中のアルデヒドから4%で2時間固定する。
洗浄後、皮膚組織を摂氏37度で2%のアガロースに埋め込み、冷却のためにアイスボックスの中に置きます。取り付けた組織を氷水で振動マイクロトーンに固定し、横方向に500マイクロメートルの厚さでスライスします。スライス後、切片からアガロースを取り出し、1x PBSを含む6ウェルプレートに保存します。
組織切片を1x PBS中の2%トリトンX-100の溶液中で摂氏4度で一晩インキュベートする。組織切片をブロッキングバッファーに入れ、シェーカー上で毎分72回転で摂氏4度で一晩回転させます。マイクロ遠沈管内の希釈緩衝液中のマウスモノクローナル抗CGRPおよびヒツジポリクローナル抗LYVE-1抗体の一次抗体を含む溶液に組織切片を移す。
その後、シェーカーを摂氏4度で2日間回転させます。組織切片を室温の洗浄バッファーで2回洗浄し、次いで洗浄バッファー中の摂氏4度で一晩シェーカーに保管する。翌日、マイクロ遠沈管内の二次抗体を含む混合溶液に組織切片を移し、シェーカー上で毎分72回転で摂氏4度で5時間回転させる。
6ウェルプレート中の組織切片を洗浄バッファーで室温で1時間2回洗浄する。組織切片をシェーカー上の洗浄バッファーに4°Cで一晩保管してください。組織切片を組織透明化試薬に移し、シェーカー上で毎分60回転で室温で1時間穏やかに回転させる。
透明な組織をスライドに取り付け、スペーサーで組織を囲み、新鮮な組織透明化試薬とカバースリップで隙間を貼り付けます。3Dパターンは、CGRP陽性神経線維が皮下組織および真皮を通って表皮に通過することを実証した。これらの神経線維は、真皮内で分岐し、表皮で終端した皮下組織において束状に走った。
これに対し、陽性血管およびLYVE-1陽性リンパ管におけるファロイジンは、皮下組織および真皮に分布している。一般に、CGRP陽性神経線維は、毛むくじゃらでグラブラスな皮膚において3Dネットワークを形成する血管およびリンパ管に平行に、または周囲を走っていた。従来の手法では、神経線維血管やリンパ管は、薄切片にCGRPファロイジンやLYVE-1で明確に標識されていましたが、これらの構造の観察はスライスの厚さによって制限され、完全に観察することはできませんでした。
厚さ30マイクロメートルの区間では、CGRP陽性神経線維の表面積において、毛むくじゃらの皮膚とグラブラスな皮膚との間に差はなかった。厚さ300マイクロメートルの組織切片では、毛むくじゃらの皮膚と比較して、グラブラス皮膚のCGRP陽性神経線維の表面積が有意に増加した。抗体インキュベーション後には、浸透圧の高い洗浄バッファーを使用することが重要です。
数回、免疫蛍光染色に要する洗浄時間が必要である。この手順に従えば、6つの切片に他の組織や臓器の染色や観察も存在する可能性があると考えています。この技術は、神経繊維の表面積と状態に遭遇する神経科学研究者を助けることができる。
また、組織や臓器の革新を観察するのにも役立ちます。
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概要
この研究は、共焦点顕微鏡を用いて厚さ300 µmの組織切片における皮膚神経線維の可視化のための新しい組織クリアリング技術を提示します。この方法は従来の薄い切片法の限界に対処し、皮膚神経支配の形態学的研究を強化します。
研究の主要構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 組織イメージング
- 共焦点顕微鏡法
背景
- 皮膚神経支配の研究は感覚経路を理解する上で重要です。
- 従来の方法は組織切片の薄さによって制限されています。
- より厚い切片での神経線維の可視化により、より深い洞察が得られます。
- この方法は、イメージングの精度と効率を向上させることを目指しています。
研究の目的
- 厚い皮膚切片用の組織クリアリング技術を開発し、検証すること。
- 神経線維と血管およびリンパ管との関係の観察を容易にすること。
- 他の組織や器官の研究に適応できる方法を提供すること。
使用された方法
- 共焦点顕微鏡を用いて、クリアリングされた組織切片の神経線維を可視化しました。
- 生物学的モデルには、処分されたラットを使用し、背面と後肢の皮膚を観察しました。
- 主要なステップには組織の灌流、埋め込み、抗体染色、組織クリアリングが含まれました。
- クリアリングとイメージングの全体的なプロトコルは通常30分から1時間かかります。
主な結果
- このクリアリング技術は、皮膚内に3Dネットワークを形成するCGRP陽性神経線維を成功裏に明らかにしました。
- 結果は、有毛皮膚と無毛皮膚の神経線維の分布に著しい違いがあることを示しました。
- この方法により、血管やリンパ管との構造的関係の詳細な観察が可能になりました。
- CGRP陽性線維は血管やリンパ管に平行に走るか、またはそれらを囲んでいることが分かりました。
結論
- この技術は、皮膚神経支配の包括的な可視化と研究の能力を向上させます。
- 改善された可視化は、神経生物学的メカニズムに関する貴重な洞察を提供する可能性があります。
- 潜在的な応用範囲は様々な組織に及び、より広範な神経科学研究を促進します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Three-dimensional visualization of skin innervation using thick tissue sections and multiplex fluorescent staining addresses a critical gap in mapping peripheral nerve architecture. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling comprehensive analysis of nerve, blood, and lymphatic vessel interactions in disease-relevant skin models. The method supports translational continuity for neurobiology and dermatology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed mapping of sensory nerve fiber distribution in both hairy and glabrous skin.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships between nerves and vasculature.
- Improves predictive confidence for target validation in peripheral nervous system research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated 3D skin models for downstream phenotypic screening.
- Enhances assay reproducibility by standardizing tissue clearing and staining protocols.
- Provides quantitative outputs on nerve fiber surface area and network complexity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling both hairy and glabrous skin innervation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neurocutaneous targets.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing structural biomarkers in skin tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on nerve-vasculature interactions in skin.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D readouts for assay development.
- Analytics: Provides surface area measurements and network mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment in disease-relevant skin models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other tissues and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in nerve mapping.
- Operational Value: Streamlines tissue processing with efficient clearing and staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust 3D data for target evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous and dermatological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and multiplex immunofluorescence.
- Demands access to tissue clearing reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining and clearing protocols.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization.
- Dependent on antibody quality and clearing efficiency for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
