Name: 複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 学ぶ 組織クリアリングと共焦点顕微鏡を用いた厚い皮膚切片での神経線維の3D可視化法。ラットの毛状・グラブラス皮膚におけるCGRP陽性神経線維と血管・リンパ管の構造関係を観察し、神経科学研究に応用可能な効率的な手法を解説する。

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この研究は、中国医学科学院イノベーション基金(プロジェクトコードNo.CI2021A03404)および国立漢方薬学際的イノベーション基金(プロジェクトコード番号。ZYYCXTD-D-202202)。

本研究は、中国医学科学院鍼灸研究所倫理委員会(参照番号D2018-04-13-1)により承認された。すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイド(National Academy Press、Washington、D.C.、1996)に従って実施されました。3匹の成体雄ラット(Sprague-Dawley、体重230±15g)を本研究に使用した。すべての動物は、温度と湿度を制御した12時間の明暗サイクルで飼育され、食物と水への自由なアクセスが許されました。
1. 灌流とサンプル調製
<ol><li>250mg/kgのトリブロモエタノール溶液( 材料表参照)をラットの腹腔内に注入し、安楽死を誘発する。</li>
	<li>呼吸が止まったら、ステンレス製の外科用はさみを使用してラットの胸腔を開きます。20 G 針を使用して、左心室13 を 3 mL/分の速度で 100 mL の 0.9% 正常生理食塩水で灌流し、続いて 0.1 M リン酸緩衝液 (PB、pH 7.4) に 250 ~ 300 mL の 4% パラホルムアルデヒドを注入します (図 1A、B)。</li>
	<li>灌流後、メスを使用して背骨と足裏の皮膚を後足から取り除きます。<ol>
<li>凍結切片を必要とするサンプルについては、組織を0.1M PB中の4%パラホルムアルデヒドに2時間固定する。その後、0.1M PB中の25%スクロース中の組織を4°Cで24時間以上凍結保護します</li>
		<li>組織透明化を必要とする厚いセクションを有するサンプルの場合、1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)中の4%パラホルムアルデヒド中の組織を2時間後固定する。その後、4°Cで1x PBSで組織を凍結保護します(図1C-E)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CGRP、ファロイジン、LYVE1によるトリプル蛍光染色とそれに続く組織透明化処理
注:CGRP、ファロイジンおよびLYVE1によるトリプル蛍光染色を適用して、組織透明化処理後の厚さ300μmの組織切片上の毛状およびグラブラスな皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管を明らかにした。
<ol><li>アガロースが溶解するまで電子レンジで2分間加熱することにより、1x PBS中の2%アガロースを調製する(材料表を参照)。</li>
	<li>洗浄後、皮膚組織を37°Cで2%アガロースに包埋し、冷却用のアイスボックス内に置きます(図1F、G)。</li>
	<li>取り付けた組織を氷水で振動ミクロトームに固定し、横方向に500μmの厚さでスライスする。振動スライサーを設定し、スライスを終了するには、速度 0.50 mm/s および振幅 1.5 mm のパラメータを使用します (図 1H-K)。</li>
	<li>スライス後、切片からアガロースを取り出し、1x PBS(pH 7.4)を含む6ウェルプレートに保存します(図1L)。</li>
	<li>組織切片を1x PBS(TriX-PB)中の2%Triton X-100の溶液中で4°Cで一晩インキュベートする。 以下の手順については、 図 2 を参照してください。</li>
	<li>組織切片をブロッキングバッファーに入れ、シェーカー上で72rpmで4°Cで一晩回転させる。 注:ブロッキングバッファー組成は、1x PBS中の10%正常ロバ血清、1%Triton-X 100、および0.2%アジ化ナトリウムです( 材料表を参照)。</li>
	<li>マウスモノクローナル抗CGRP(1:500)及びヒツジポリクローナル抗LYVE1抗体(1:500)の一次抗体を微量遠心管内の希釈緩衝液( 材料表参照)に含む溶液に組織切片を移し、シェーカー上で4°Cで2日間回転させた。 注:希釈バッファー組成は、1x PBS中の1%正常ロバ血清、0.2%Triton-X 100、および0.2%アジ化ナトリウムです。</li>
	<li>組織切片を室温の洗浄バッファーで2回洗浄し、次いで洗浄バッファー中で4°Cで一晩シェーカーに保管する。 注:洗浄バッファー組成は、0.1M PB(pH 7.4)中の0.2%Triton-X 100です。</li>
	<li>翌日、ロバ抗マウスIgG H&L Alexa-Flour488(1:500)およびロバ抗ヒツジIgG H&L Alexa-Flour405(1:500)、ならびにAlexa-Flour594ファロイジン(1:1000)( 材料表参照)の二次抗体を含む混合溶液に組織切片を微小遠心管に移し、シェーカー上で72rpmで4°Cで5時間回転させる。</li>
	<li>6ウェルプレートの組織切片を洗浄バッファーで室温で1時間、2回洗浄する。組織切片をシェーカー上の洗浄バッファーに入れて4°Cで一晩保管する。</li>
	<li>組織切片を組織透明化試薬( 材料表を参照、その体積は試料体積の5倍以上であった)に移し、シェーカー上で60rpmで室温で1時間穏やかに回転させた。 注:この治療後、組織切片は透明になる(図2B)。</li>
	<li>クリアしたティッシュをスライドに取り付け、スペーサーでティッシュを丸め、新鮮なティッシュクリアリング試薬とカバースリップで隙間を貼り付けます。</li>
</ol>3. 従来のアプローチに従ったCGRP、ファロイジン、LYVE1によるトリプル蛍光染色
注:比較として、従来の技術に従って厚さ30μmの組織切片に対して同様の染色を実施した。
<ol><li>ミクロトーム上で組織切片を横方向に30μmでスライスし、スライドに取り付けます。</li>
	<li>0.1 M PBに3%正常ロバ血清および0.3%Triton X-100を含むブロッキング溶液を加え、室温で30分間切片をインキュベートする。</li>
	<li>ブロッキング溶液を除去し、切片をマウスモノクローナル抗CGRP(1:500)およびヒツジポリクローナル抗LYVE1抗体(1:500)の一次抗体を含む溶液と共に4°Cで一晩希釈緩衝液中でインキュベートする。</li>
	<li>翌日、組織切片を0.1M PB(pH 7.4)で3回洗浄し、ロバ抗マウスIgG H&L Alexa-Flour488(1:500)およびロバ抗ヒツジIgG H&L Alexa-Flour405(1:500)、ならびにAlexa-Flour594ファロイジン(1:1000)の二次抗体を含む混合溶液を切片に加え、室温で1時間インキュベートする。</li>
	<li>顕微鏡観察の前に、切片を0.1M PB(pH 7.4)で3回洗浄し、50%グリセリンのカバースリップで覆う。</li>
</ol>4. イメージングと解析
<ol><li>染色した試料を蛍光顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します。</li>
	<li>厚さ300 μmの各セクションから、それぞれ10 μmフレームの30枚の画像(Zスタック)をキャプチャし、共焦点顕微鏡システムのイメージプロセッサを使用して単一のピントが合った画像を統合します( 材料表を参照)。<ol>
<li>3次元(3D)解析用の共焦点セットアップの画像処理ソフトウェアで、次の手順を実行します: [焦点面の開始]|焦点面の終了|の設定ステップサイズ|を設定する深度パターン|を選択画像キャプチャ|Zシリーズ。 注:青色蛍光シグナルの励起波長と発光波長は、それぞれ401nmと421nmでした。緑色蛍光シグナルの励起波長および発光波長は、それぞれ499nmおよび519nmであった。赤色蛍光シグナルの励起波長および発光波長は、それぞれ591nmおよび618nmであった。152μmは共焦点ピンホール(10倍対物レンズ、NA:0.4)の直径である。画像キャプチャ解像度は1024×1024ピクセルであった。</li>
	</ol>
</li>
	<li>従来のサンプル(ステップ3)では、厚さ30μmの断面から1μmフレームに30枚の画像(Zスタック)をキャプチャし、さらにこれらの画像を上記のように処理します(ステップ4.1-4.2)。</li>
	<li>画像処理システムによる3D再構成のパターンで画像を実演する。</li>
	<li>Zスタック共焦点画像をImaris 9.0(細胞イメージングソフトウェア、 材料表を参照)にインポートして3D再構成を実行し、汚れの強度に基づいてサーフェスレンダリングを作成する: 新しいサーフェス|追加するソースチャンネル|を選択「サーフェスの詳細」(Surfaces) |の「スムーズ」(smooth) オプションでパラメータを決定します。「絶対強度」のしきい値オプションのパラメータを決定|サーフェスの分類|終了です。</li>
	<li>陽性神経線維の表面積のデータを細胞イメージングソフトウェアで取得します。 レンダリング イメージ |を選択します。統計|詳細な|特定の値|ボリューム。</li>
</ol>

<ol><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).</li>
<li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181(2012).</li>
<li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).</li>
<li>Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw%3A+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).</li>
<li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin%3A+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).</li>
<li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models%3A+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+whole+mount%3A+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick%2C+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).</li>
<li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li>
<li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lymphatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).</li>
<li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

本研究は、皮膚神経支配をよりよく理解するために、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、皮膚神経支配をよりよく理解することによって、毛状およびグラブラス皮膚における皮膚神経線維の詳細な実証を提供する。抗体インキュベーション時間は最大1〜2日で、一晩の洗浄プロセスが重要です。これら2つの重要なステップは、厚い切片の免疫蛍光染色効果に直接影響します。抗体の選択からさらなる問題が提起されたが、そのすべてが厚い切片に適しているわけではない。我々は、分子量の小さい抗体が、厚い切片の免疫蛍光染色に理想的であるかもしれないと推測している。したがって、抗体選択の難しさは、このアプローチの主要な限界である。本研究は、ラットの毛むくじゃらで無毛の皮膚上の血管、リンパ管、神経の分布の違いを観察した。人間にとって、皮膚の構造はげっ歯類の構造とは非常に異なります。次のステップでは、組織クリアリング技術を使用して人間の皮膚を観察し、研究することを楽しみにしています。
これまでの研究では、皮膚神経線維...

皮膚は、環境への重要なインターフェースとして機能する体内最大の器官であり、多くの神経線維1,2,3によって密に神経支配されている。皮膚神経支配は、全マウント皮膚および組織切片4,5,6に対する染色など、様々な組織学的方法を用いて以前に広く研究されてきたが、皮膚神経線維の詳細な効果的な実証は依然として課題である7,8。これを踏まえ、本プロトコールは、厚い組織切片において皮膚神経線維をより明確に示すための独自の技術を開発した。
切片の太さによる限界のため、神経支配皮膚神経線維の観察は、取得した画像情報からカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)神経線維と局所組織・臓器との関係を正確に描くほど正確ではない。3D組織クリアリング技術の出現は、この問題を解決するための実行可能な方法を提供する9,10。組織クリアリングアプローチの急速な発展は、近年、組織構造、器官全体、ニューロン突起、および動物全体を研究するための多くのツールを提供してきました11。透明な皮膚組織は、共焦点顕微鏡によってはるかに厚い部分で画像化され、皮膚神経線維を視覚化するためのデータを得ることができる。
現在の研究では、ラット後足の足底および背部皮膚を、毛状およびグラブラス性皮膚の2つの標的部位として選択した3、4、7。より長い距離で皮膚神経線維をトレースするために、皮膚組織を免疫組織化学的および組織化学的染色のために300μmの厚さでスライスし、続いて組織透明化処置を行った。CGRPは、感覚神経線維12、13を標識するために使用した。さらに、組織背景上の皮膚神経線維を強調するために、ファロイジンおよびリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1(LYVE1)をさらに用いて、それぞれ血管およびリンパ管を標識した14、15。
これらのアプローチは、皮膚神経線維の高解像度ビューを実証し、また、皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管間の空間的相関を視覚化するために適用することができる直接的な方法を提供し、正常な皮膚の恒常性および病理学的条件下での皮膚の変化を理解するためのはるかに多くの情報を提供し得る。

<table><tbody><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td></tr><tr><td>2,2,2-トリブロモエタノール</td><td>Sigma Life Science</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>共焦点蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>ロバ 抗マウス IgG H&L アレクサ-小麦粉488アブ</td><td>カムplc。</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ヒツジIgG H&L アレクサ-小麦粉405</td>アブ<td>カムplc。</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>EPチューブ</td>無<td>錫NESTバイオテクノロジー株式会社</td><td>615001</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>凍結ステージスライド式ミクロトームシステム</td><td>ライカバイオシステム</td>ズ <td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>IRIS標準シザー</td><td>WPI(ワールド・プレシジョンズ社製)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>503242 iSpacer</td><td>SunJin Lab co. (株)</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ鉗子-Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗CGRP抗体</td><td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G2161</td><td>10%</td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン Alexa-Fluor 594</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>ラピクリア 1.52ソリューション</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>レギュラー アガロース</td><td>Gene Company Limited</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ ポリクローナル抗LYVE1抗体</td><td>R&Dシステムズ株式会社</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング社</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>S2002</td><td>25 g</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>V900116</td><td>500 g</td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>Henkel AG & Co.</td><td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td>サージカル ハンドル</td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>9002-93-1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>ウレタン</td><td>Sigma Life Science</td><td>U2500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>VANNAS スプリングハサミ</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>振動ミクロトーム</td><td>ライカ バイオシステムズ</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

皮膚神経支配は末梢神経系の重要な部分です。皮膚神経線維の研究は急速に進歩しているが、それらの分布的および化学的特性の理解の大部分は、薄い組織切片に対する従来の組織化学的および免疫組織化学的染色から来ている。組織透明化技術の開発により、より厚い組織切片上の皮膚神経線維を見ることが可能となった。本プロトコールは、ラット後足の足底および背部皮膚から300μmの厚さで組織切片に複数の蛍光染色を記載する、2つの典型的な毛深いおよびグラブラスな皮膚部位である。ここで、カルシトニン遺伝子関連ペプチドは感覚神経線維を標識し、一方ファロイジン及びリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1は血液及びリンパ管をそれぞれ標識する。共焦点顕微鏡下では、標識された感覚神経線維は、より長い距離で完全に追跡され、深い皮膚層では束状に、表層ではフリースタイルで走った。これらの神経線維は血管と平行に走ったり、血管を囲んだりして、リンパ管は毛むくじゃらでグラブラスな皮膚に3次元(3D)ネットワークを形成しました。現在のプロトコルは、方法論の観点から既存の従来の方法よりも皮膚神経支配を研究するためのより効果的なアプローチを提供する。

トリプル蛍光染色後、神経線維、血管、リンパ管を、毛むくじゃらの皮膚およびグラブラス皮膚において、それぞれCGRP、ファロイジン、およびLYVE1で明確に標識した(図3、4)。クリアリング治療により、CGRP陽性神経線維、ファロイジン陽性血管、およびLYVE1陽性リンパ管をより高い深さで画像化し、皮膚の完全な構造情報を取得することができます(図3)。これらの組織構造を3Dパターンでさらに再構築すると、その分布を追跡しやすくなりました。CGRP陽性神経線維が皮下組織と真皮を通って表皮に伝わることが示された。これらの神経線維は皮下組織で束となって走り、真皮内で分岐し、表皮で終端した(図3)。これに対し、ファロイジン陽性血管およびLYVE1陽性リンパ管は、皮下組織および真皮に分布している(図3)。一般に、CGRP陽性神経線維は、血管およびリンパ管に平行に走るか、または血管を囲...

組織切片の厚さは、皮膚神経支配の形態学的研究を制限した。本プロトコールは、共焦点顕微鏡下で厚さ300μmの組織切片中の皮膚神経線維を可視化する独自の組織透明化技術を記載する。

複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

我々のプロトコルは、共焦点顕微鏡を用いて同期部を観察する実行可能な方法を提供し、神経線維の観察における精度を保証することができた。シンプルで簡単な組織洗浄プロトコルは、この技術の主な利点です。組織洗浄プロセスは効率的であり、約30分〜1時間かかる。テキスト原稿に記載されているように、安楽死したラットに灌流を行う。メスを使用して、背骨とソールの皮膚を後足から取り除きます。凍結切片を必要とするサンプルの場合、組織を0.1モルPB中のアルデヒドから4%で2時間固定する。洗浄後、皮膚組織を摂氏37度で2%のアガロースに埋め込み、冷却のためにアイスボックスの中に置きます。取り付けた組織を氷水で振動マイクロトーンに固定し、横方向に500マイクロメートルの厚さでスライスします。スライス後、切片からアガロースを取り出し、1x PBSを含む6ウェルプレートに保存します。組織切片を1x PBS中の2%トリトンX-100の溶液中で摂氏4度で一晩インキュベートする。組織切片をブロッキングバッファーに入れ、シェーカー上で毎分72回転で摂氏4度で一晩回転させます。マイクロ遠沈管内の希釈緩衝液中のマウスモノクローナル抗CGRPおよびヒツジポリクローナル抗LYVE-1抗体の一次抗体を含む溶液に組織切片を移す。その後、シェーカーを摂氏4度で2日間回転させます。組織切片を室温の洗浄バッファーで2回洗浄し、次いで洗浄バッファー中の摂氏4度で一晩シェーカーに保管する。翌日、マイクロ遠沈管内の二次抗体を含む混合溶液に組織切片を移し、シェーカー上で毎分72回転で摂氏4度で5時間回転させる。6ウェルプレート中の組織切片を洗浄バッファーで室温で1時間2回洗浄する。組織切片をシェーカー上の洗浄バッファーに4°Cで一晩保管してください。組織切片を組織透明化試薬に移し、シェーカー上で毎分60回転で室温で1時間穏やかに回転させる。透明な組織をスライドに取り付け、スペーサーで組織を囲み、新鮮な組織透明化試薬とカバースリップで隙間を貼り付けます。3Dパターンは、CGRP陽性神経線維が皮下組織および真皮を通って表皮に通過することを実証した。これらの神経線維は、真皮内で分岐し、表皮で終端した皮下組織において束状に走った。これに対し、陽性血管およびLYVE-1陽性リンパ管におけるファロイジンは、皮下組織および真皮に分布している。一般に、CGRP陽性神経線維は、毛むくじゃらでグラブラスな皮膚において3Dネットワークを形成する血管およびリンパ管に平行に、または周囲を走っていた。従来の手法では、神経線維血管やリンパ管は、薄切片にCGRPファロイジンやLYVE-1で明確に標識されていましたが、これらの構造の観察はスライスの厚さによって制限され、完全に観察することはできませんでした。厚さ30マイクロメートルの区間では、CGRP陽性神経線維の表面積において、毛むくじゃらの皮膚とグラブラスな皮膚との間に差はなかった。厚さ300マイクロメートルの組織切片では、毛むくじゃらの皮膚と比較して、グラブラス皮膚のCGRP陽性神経線維の表面積が有意に増加した。抗体インキュベーション後には、浸透圧の高い洗浄バッファーを使用することが重要です。数回、免疫蛍光染色に要する洗浄時間が必要である。この手順に従えば、6つの切片に他の組織や臓器の染色や観察も存在する可能性があると考えています。この技術は、神経繊維の表面積と状態に遭遇する神経科学研究者を助けることができる。また、組織や臓器の革新を観察するのにも役立ちます。

demonstrating-hairy-glabrous-skin-innervation-3d-pattern-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々はマウス胚の四肢の皮膚に複雑な血管網の形成を分析するために複数のラベルで共焦点顕微鏡を走査型ホールマウントの免疫組織化学とレーザーをご紹介。...

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末梢感覚神経線維のサブタイプの免疫細胞化学的同定（とそこにタンパク質発現の検出）が末梢感覚の分子メカニズムの理解の鍵となります。ここでは、末梢感覚神経線維の特異的免疫染色のための皮膚や四肢骨などの周辺/内臓の組織サンプル、、の調製のための方法を説明します。...

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。...

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痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。...

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このような毛包と神経終末など -   - 空間構成の特徴的なパターンを示す哺乳動物の皮膚は、構造体の多様な配列が含まれています。フラットマウントとして皮膚を分析して皮膚構造の全層の高解像度画像を生成するためにこの組織の2次元形状を利用する。...

マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1...

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

ここでは、ステリルピリジニウム染料による染色および脱染中にマウスの耳の皮膚の毛包を神経支配する柵末端の生きた披針形感覚終末をイメージングするための新しい準備について説明します。...

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。...

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

この研究は、共焦点イメージングモダリティの完全な利用を可能にする、厚い3次元組織断面分析のための新規な処理およびイメージングプロトコルを提示する。このプロトコールは抗原性を保持し、皮膚組織学および潜在的に他の組織型を分析するための堅牢なシステムを表す。...

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

ここでは、細胞培養ラボでの日常的な研究のためのさまざまな3Dスキンモデルを導入するための安価で簡単な手順を紹介します。研究者は、市販のモデルに頼ることなく、自分のニーズに合わせたモデルを作成することができます。...

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

本研究は、マウスの前足の皮膚における低閾値機械受容体(LTMR)軸索末端の構造を可視化するための 生体内...

マウス皮膚における触覚感覚軸索形態のバイタル2光子イメージング

学ぶ 組織クリアリングと共焦点顕微鏡を用いた厚い皮膚切片での神経線維の3D可視化法。ラットの毛状・グラブラス皮膚におけるCGRP陽性神経線維と血管・リンパ管の構造関係を観察し、神経科学研究に応用可能な効率的な手法を解説する。

複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証

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