ヒト人工多能性幹細胞から改変された同質遺伝子腎臓糸球体チップ

同質遺伝子糸球体チップは、患者固有の疾患モデリング、腎毒性試験、および高度な精密医療アプリケーションを可能にします。糸球体上皮および内皮は、ヒト誘導多能性幹細胞(IPSC)の単一集団に由来する。IPSCは無制限の自己複製を持ち、ほぼすべての細胞型に分化することができます。

この技術は、病理学的細胞表現型および疾患を評価するために使用することができる。患者固有の臓器チップは、薬物スクリーニングおよび機構研究のプラットフォームとしても機能します。このモデルは、特定の患者にパーソナライズされたボディオンチップシステムの開発に適用できます。

このシステムは、臨床試験の前に患者固有の反応を予測する可能性があります。まず、25マイクロリットルの基底膜マトリックス2溶液を尿路に、20マイクロリットルをチップの毛細管チャネルに穏やかに加えます。2つの滅菌15ミリリットルコニカルチューブキャップを取り、500マイクロリットルの滅菌蒸留水で満たします。

乾燥を防ぐためにキャップをペトリ皿に入れ、皿に蓋をします。摂氏37度で一晩インキュベートします。進行し、血管内皮細胞の培養物を90%コンフルエントで15日間収容したT75フラスコから培地を吸引する。

5ミリリットルの細胞剥離バッファーを加え、摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。次に、細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、5ミリリットルのDMEM / F-12を追加します。200倍Gで5分間遠心分離します。

上清を除去し、細胞を300マイクロリットルの内皮維持培地に再懸濁します。血球計算盤で細胞を数え、約200万個の細胞を取得します。P200バリアチップを使用して、マイクロ流体チップの上部チャネルと下部チャネルの両方を200マイクロリットルのDMEM / F-12でフラッシュし、同時に出口の周囲から吸引します。

P200バリアチップをアスピレーターに取り付けて、下部チャネルの出口から離してチップをしっかりと保持します。20マイクロリットルの血管内皮細胞懸濁液をチップの毛細血管チャネルにしっかりと注入し、出口の周囲から培地を注意深く吸引します。顕微鏡で気泡や不均一な播種密度がないか確認してください。

細胞が柔軟なPDMS膜の基底側に接着できるように、チップを静かに反転させます。チップをホルダーカートリッジに入れ、メンブレンが乾燥しないように3ミリリットルのPBSをカートリッジに追加します。チップを摂氏37度で3時間インキュベートします。

顕微鏡下でボトムチャネルをチェックして、柔軟なPDMSメンブレンに付着した細胞のコンフルエント層を確認します。キャピラリーチャネル出口の周囲から吸引しながら、底部チャネルの入口に200マイクロリットルの内皮維持培地を添加して、付着していない細胞を洗浄する。チップをホルダーカートリッジに戻し、摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、キャピラリーチャネルを200マイクロリットルの内皮維持培地で静かに洗い流します。尿路を200マイクロリットルのDMEM / F-12で洗い流し、50マイクロリットルのDMEM / F-12を入口ポートと出口ポートに落とします。中間中胚葉細胞を進め、12ウェルプレートの各ウェルからの中間中胚葉誘導培地を1ミリリットルのトリプシンEDTAで交換し、摂氏37度で5分間インキュベートする。

セルリフターを使用して細胞を穏やかにこすり、ピペッティングを使用して細胞を解離します。各ウェルに2ミリリットルのトリプシン中和溶液を加え、細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。細胞懸濁液の容量をDMEM/F-12で50ミリリットルに構成し、200倍Gで5分間遠心分離します。

上清を吸引し、500マイクロリットルの中間中胚葉誘導培地に細胞を再懸濁して、約300万個の細胞を得ます。血球計算盤で細胞を数えます。チップを保持し、出口の周囲から培地を注意深く吸引しながら、チップの尿路に25マイクロリットルの細胞懸濁液をしっかりと注入します。

気泡や不均一な細胞播種密度を確認します。チップホルダーカートリッジに3ミリリットルのPBSを加え、摂氏37度で3時間インキュベートします。インキュベーション後、両方のチャネルを200マイクロリットルのそれぞれの細胞培養培地で洗い流します。

空のP200バリアチップを尿路と毛細血管チャネルの両方の出口に取り付けます。200マイクロリットルの内皮維持培地をピペットし、その半分をキャピラリーチャネル入口に注入する。ピペットチップをインレット内に外して、チャネルの入口と出口の両方が培地で満たされたピペットチップに取り付けられるようにします。

200マイクロリットルの中間中胚葉維持培地を含む尿路入口に対してこの手順を繰り返します。チップを埋め込んだチップを摂氏37度で一晩インキュベートします。チップを臓器チップバイオリアクターに接続するには、まず、チャネルからP200チップを取り外します。

乾燥を防ぐために、尿路と毛細血管チャネルの入口と出口にそれぞれの媒体の液滴を追加します。3ミリリットルの温かい足細胞誘導培地を尿入口リザーバーに追加し、3ミリリットルの温かい内皮維持培地をキャピラリーインレットリザーバーに追加します。300マイクロリットルのそれぞれの培地を出口ポートの真上の出口リザーバーに追加します。

ポッドをトレイにスライドさせ、臓器チップバイオリアクターに入れます。回転式ダイヤルを使用してプライムサイクルを選択し、2分間開始します。ポッドの下側に、4つの流体ポートすべてに小さな液滴がないか目視検査します。

ポッドの下側とマイクロ流体チップポートを流体間接触させるには、チップキャリアをポッドにゆっくりとスライドさせます。チップキャリアタブをゆっくりと押し込みます。チップの表面から余分な媒体を吸引します。

臓器チップバイオリアクターの流量を毎時60マイクロリットルに設定します。周期ひずみを0.4ヘルツで10%に設定します。臓器チップバイオリアクターの回転ダイヤルを使用して調整サイクルを選択し、2時間実行します。

出口リザーバーを目視検査して、媒体のレベルが上昇します。臓器チップバイオリアクターの回転ダイヤルを使用して、調整サイクルを選択します。培養17日目以降、毎日、ポートから斜め離れた尿路出口リザーバーから培地を吸引しますが、一部の培地をリザーバーに保持します。

尿路入口リザーバーに、2日ごとに最大3ミリリットルの足細胞誘導培地を5日間補充します。5日後、尿路から培地を吸引しますが、一部の培地をリザーバーに保管します。尿路入口リザーバーに毎日3ミリリットルの足細胞維持培地を補充します。

同様に、毛細管チャネル出口から培地を吸引し、内皮維持培地を毎日入口リザーバに補充する。このプロトコールを用いてヒト人工多能性幹細胞、血管内皮細胞および足細胞を増殖させることによる糸球体の機能的in vitroモデルを開発するために使用した。足細胞誘導および血管内皮増殖後21日目に、チップ内の細胞は、ポドサイトについてはポドシンおよびネフリン、血管内皮細胞についてはVEカドヘリンおよびPECAM-1などの系統識別マーカーを発現した。

足細胞層と血管内皮細胞層の両方が、腎臓糸球体で最も豊富なGBMタンパク質であるコラーゲンIVを発現しました。糸球体チップは、イヌリンなどの小分子を毛細血管から尿路に選択的にろ過し、アルブミンなどの大きなタンパク質が毛細血管チャネルから出るのを防ぎ、選択的な分子ろ過機能を示しました。4〜7日目の内皮誘導中に、細胞数の増加は細胞の二次層をもたらす可能性がありますが、過剰播種は凝集を引き起こし、分化を妨げる可能性があります。

PDMSチップコンポーネントの不十分な結合、流体流路の閉塞、またはろ過バリアの損傷の場合、尿路と毛細血管チャネル間の予期しない流体クロスフローが観察される可能性があります。内皮と上皮を播種し、15日目以降からチップを維持する場合、すべてのステップでチャネル内の気泡を目視検査することが重要です。同質遺伝子糸球体チップでは、臨床的に関連する薬物候補を投与して、それらの治療可能性または毒性レベルを試験することができる。

この技術は現在、ヒト腎臓病の遺伝的基盤を理解し、個別化された治療法を開発する機会を開きます。