Name: ヒツジの目の硝子体内注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: 学ぶヒツジの硝子体内注射法による遺伝子治療の実施手順。網膜変性症の治療に向けた侵襲性の低いアプローチを示し、ヒト眼モデルとしての有効性を検証する方法を解説します。

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著者らは、Steve Heap博士(BVSc、CertVOphthal)がこのプロトコルを確立し、Murrayらによって記述された注射を実行するのを支援したことに感謝したいと思います15。著者らはまた、CureKids New Zealand、Canterbury Medical Research Foundation、Neurogene Inc、およびBatten Disease Support and Research Associationからの資金提供にも感謝している。

すべての実験プロトコルは、リンカーン大学の動物倫理委員会によって承認され、研究における動物の世話と使用に関する米国国立衛生研究所のガイドラインとニュージーランド動物福祉法(1999)に準拠しています。ボーダーデール羊は14 歳の出生時に診断され、リンカーン大学の研究農場で飼育されていました。生後3ヶ月のホモ接合型(CLN5-/-)雌羊3頭にIVTを1回注射し,未治療の右眼を内部コントロールとした。網膜電図および病理データを、過去の健康および罹患対照データと比較した。この研究で使用されたウイルスベクターは、ニワトリベータ作用(CBh)プロモーターとコドンに最適化されたヒツジ CLN5 (scAAV9 / CBh-oCLN5opt)を含む自己補完的なアデノ随伴ウイルス血清型9でした。ウイルスベクターは、米国ノースカロライナ州ノースカロライナ大学ベクターコアによって提供されました。
1.手術前
<ol><li>手術キットをオートクレーブします(図1)。</li>
	<li>手術前に羊を24時間絶食させます。</li>
	<li>手術前に生体重を記録します。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg"> 図1:硝子体内手術キット。 IVT手術に必要な器具には、(1)まぶたを開いたままにするための検鏡と、(2)球結膜をつかんで目を回転させるための一対の湾曲した鼻鉗子が含まれます。(3)球結膜をつかみ、眼窩にロールバックした場合に目を所定の位置に保持するための代替器具として、ストレートノーズ止血剤も含まれています。このキットは手術前にオートクレーブ滅菌されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2.外科的処置
<ol><li>動物を拘束し、電子バリカンを使用して、首の片側から頸静脈の上にウールを剃ります。</li>
	<li>頸静脈溝の基部に圧力を加えて頸静脈を閉塞し、隆起した静脈を視覚化します。</li>
	<li>適切な量のジアゼパム(0.3 mg / kg)とケタミン(7.5 mg / kg)を滅菌注射器に吸い込み、滅菌した20 Gの針を取り付けます。.針を頸静脈に挿入し、プランジャーをそっと引き戻して、血液がハブに入り、針が静脈の内側にあることを確認します。確認したら、静脈内(頸静脈)投与によって誘導します。.</li>
	<li>誘導直後に、動物を背側横臥状態に置き、首を伸ばし、喉頭鏡を使用して喉頭を視覚化しながら舌を前後に保持します。動物が息を吐くときに声帯の間に気管内チューブ(羊のサイズに応じてサイズ6.0〜9.0)を静かに挿入することにより、気管内挿管を行います。気管内カフをすぐに膨らませ、下顎の周りにネクタイでチューブを固定します。チューブを通る空気の流れを確認します。</li>
	<li>羊を手術台に移し、横臥に置きます。</li>
	<li>直ちに気管内チューブを麻酔装置のホースに接続して、100%酸素中のイソフルランを送達する。最初は3%〜4%のイソフルランから始め、次にメンテナンスのために2%〜3%に減らします。羊の自発換気を観察します。</li>
	<li>手順全体を通して、心拍数(脈拍)、呼吸数、酸素飽和度、潮汐末CO2 レベル、および直腸体温を監視します。麻酔をかけた羊におけるこれらのパラメータの生理学的値については、 表1 を参照してください(可変ですが、ガイダンスとして使用してください)。</li>
	<li>大きな無菌の正方形のドレープを外科用手術カートに置き、続いて滅菌器具を置きます。</li>
	<li>注射する目の上に無菌の開窓された外科用ドレープを配置します。</li>
	<li>滅菌20mLシリンジを使用して眼を無菌的に消毒し、1〜5%ポビドンヨード溶液で眼を洗浄する。</li>
	<li>局所麻酔薬として、アルカイン0.5%W / V眼科溶液を1〜2滴目に塗布します。.</li>
	<li>ノパバラカーコリブリアイスペキュラム(10 mm)をまぶたに取り付けて、目を開いたままにします。</li>
	<li>目の背外側にある球結膜を鉗子でつかみ、眼球を腹内側に回転させます。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>コンシャス</td>
			<td>麻酔</td>
			<td>推奨される重要な介入ポイント</td>
		</tr><tr><td>心拍数(拍数/分)</td>
			<td>50-80 (静止) から 280 (アクティブ)</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50、&gt;100</td>
		</tr><tr><td>呼吸数(呼吸/分)</td>
			<td>15-40(休憩)から350(過熱)</td>
			<td>10-30</td>
			<td>&lt;8, &gt;40</td>
		</tr><tr><td>酸素飽和度(ミリメートルHg)</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr><tr><td>潮汐終末CO2 (mm Hg)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr><tr><td>体温(°C)</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36, &gt;40</td>
		</tr></tbody></table>表1:麻酔をかけた羊で監視するパラメータの生理学的値。
3.ウイルスの準備
<ol><li>AAVベクターアリコートは、使用するまで−80°Cで保存してください。</li>
	<li>手術当日、IVT送達に必要な数のバイアルを氷上で解凍します。</li>
	<li>投与直前に、ウイルスベクターアリコートをボルテックスし、400× g で10秒間遠心分離し、内容物を回収した。</li>
	<li>滅菌ろ過された1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で各ウイルスベクターアリコートを最終容量100 μLで所望の用量に希釈します。 滅菌フィルターピペットチップを使用して、滅菌1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブでベクター希釈液を調製します。ウイルスベクターと接触したすべての消耗品は消毒液で廃棄してください(材料の表を参照)。 注:元の出版物15 では、治療薬の用量(AAV9。CLN5)は1.9 x10 10 ウイルスゲノムであった。推奨される投与量は、投与される治療薬によって異なります。したがって、投与量はここに提示された標準プロトコルに含まれていません。.</li>
	<li>AAVベクター調製物の全100 μLを、28 G x 1/2針で恒久的に取り付けられた滅菌済みの低デッドスペース1 mLシリンジに引き込み、すぐに注入します。準備から注射までの時間が2分未満であることを確認してください。</li>
</ol>4.ウイルス投与
<ol><li>眼の外側の強膜の約7 mm後方に針を挿入し、レンズを避けるために後方に角度を付けます(図2 および 図3)。100 μLの単回注射を、網膜表面を乱すことなく、できるだけ網膜の近くにボーラスとして投与します。</li>
	<li>検鏡とドレープを取り除く前に、約10〜15 mLの1〜5%ポビドンヨード溶液とそれに続く10 mLの生理食塩水で目をすすぎます。.</li>
	<li>羊を裏返し、必要に応じてもう一方の目で繰り返します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg"> 図2:眼球の腹内側回転 。 (A)歯のない鉗子で球結膜をつかみ、(B)腹内側に(つまり、鼻に向かって)回転させて、注射のために目の背外側表面を露出させます。略語:V =腹側、D =背側、M =内側、L =外側。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg"> 図3:射出位置と深さ。 針は眼球の背外側側に注入され、針軸の全長(0.5インチ/ 12.7mm)が眼に挿入されます。水晶体を避け、網膜にできるだけ近づけて注入するために、針の目の後方への角度に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5.術後管理
<ol><li>手順が完了したら、イソフルランガス吸入麻酔を停止し、ラインを100%酸素で洗い流し、ホースを気管内チューブから外し、羊を回復室に移します。</li>
	<li>羊を胸骨横臥状態に置き、足を下に押し込み、完全に回復するまで監視します。動物の口に障害物がないことを確認してください。</li>
	<li>嚥下反射が観察されたら、気管内チューブのカフを部分的に収縮させ、チューブを口からそっと取り外します。</li>
	<li>後肢の大腿二頭筋に筋肉内非ステロイド性抗炎症剤を投与し、首の側面または肩の後ろに皮下抗生物質を投与し、0.5%クロラムフェニコール点眼薬を眼球の表面に投与します。</li>
	<li>羊が補助なしで立つことができるようになったら、水と食物(ルツェルンペレットと籾殻)を提供します。</li>
	<li>0.5%クロラムフェニコール点眼薬を手術後7日間、1日2〜3回投与します。.</li>
	<li>羊を一晩屋内に保管してから、手術後約24時間で屋外のパドックに戻ります。</li>
	<li>直腸温を3週間毎日記録します。脈拍または呼吸数、食物消費量、神経行動、体温、体重、姿勢、目の健康、および不健康の臨床的兆候の変化を監視します。有害事象の兆候がある場合は、適切な獣医治療を求めてください。.</li>
</ol>6. 生体内における有効性の評価
<ol><li>IVT注射の目的が視力を維持することである場合は、網膜細胞機能を評価するための迷路検査または網膜電図(ERG)または網膜構造を評価するための光干渉断層撮影(OCT)などの方法でin vivo で有効性を監視します。 注:これらの有効性の尺度は、IVT遺伝子治療11、15、16に続いて十分に説明されています。</li>
</ol>7.死後の組織分析
<ol><li>硝子体内注射手術後の適切なエンドポイントで承認された方法で羊の安楽死を実行します。 注:静脈内獣医安楽死薬や頸椎への貫通キャプティブボルトとそれに続く急速な放血などの推奨される安楽死方法は、他の場所で詳しく説明されています15,16。</li>
	<li>外科用の鋭利な/鈍い湾曲したはさみを使用して羊の目の球体を収穫します。外側と内側の眼窩を切断して眼窩の開口部を増やし、次に結膜のひだ、結合組織、筋肉、視神経を体系的に切断して、眼球を眼窩から解放します。</li>
	<li>無傷の除核アイグローブを10%ホルマリンで2時間浸漬固定した後、ブアン溶液に4時間後固定し、強膜を小さく(0.5 cm)カットして十分な灌流を可能にします。あるいは、アイグローブをDavidsonの溶液に48時間浸漬固定します。</li>
	<li>3〜5μmでのルーチンパラフィンワックス包埋および切片化を介して眼組織の切片を処理します。 注:ヘマトキシリンおよびエオジン(H&amp;E)染色および免疫組織化学的分析のための染色手順は、以前に説明されています15,16。</li>
	<li>網膜の総厚さ、網膜層の厚さ、外顆粒層の細胞列の数、網膜細胞の種類、網膜グリア、または目的のタンパク質の免疫組織化学染色などの測定値によって、死後組織の有効性を評価します。 注:これらの分析のプロトコルについては、以前の出版物15,16を参照してください。</li>
</ol>

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<li>Willekens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreally+injected+fluid+dispersion%3A+Importance+of+injection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).</li>
<li>Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+models+to+study+drug+delivery+barriers+in+the+posterior+segment+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).</li>
<li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Retinal+Physician%22%5BJournal%5D)">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+targeting+the+inner+retina+rescues+the+retinal+phenotype+in+a+mouse+model+of+CLN3+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

硝子体内注射は、ヒト眼科で最も一般的な外科的処置の1つであり、AAVを介した遺伝子治療を羊の網膜に送達するのに効果的であることが証明されています。我々は以前、AAV9の有効性を実証していた。セロイドリポフスチノーシス5遺伝子治療は、セロイドリポフスチ セリフスチの網膜機能障害および変性を弱めるために硝子体内に実施されました。この投与経路をヒトNCL患者に翻訳することも有益であることが期待されています。
羊の目への少量のIVT注射のプロトコルは、比較的簡単で非侵襲的で、容易に再現でき、専門家でなくても簡単に習得できます。成功は、網膜内の標的細胞、提供される治療、および注射自体の場所と方向に依存します。IVT注射は網膜内層を標的とするのに最も効果的であると考えられることが多いが、多くの研究者は、網膜外が疾患病因の主要な場所である疾患におけるIVT注射の有効性を実証している15,17,18,19<sup...

硝子体内(IVT)、網膜下、脈絡膜上、眼周囲、または局所投与を含むいくつかの方法を網膜に送達するために使用することができる。各投与経路は、血液網膜関門または内外限界膜などの障壁を克服することを含み、送達される薬物および特定の網膜標的に応じて異なる有効性を有する1,2。
IVT薬物送達は、眼の後房を占めるゼラチン状物質である眼の硝子体液への注射を含む。硝子体液の主な機能は、眼球の形状を維持し、水晶体や網膜などの眼組織を所定の位置に保つことです。硝子体液は主に水で構成されており、少量のコラーゲン、ヒアルロン酸、およびその他の非コラーゲン性タンパク質が含まれています3。IVT注射は、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、およびいくつかの遺伝性網膜ジストロフィーを含む幅広い眼の状態を治療するために日常的に使用される単純で一般的な手順です4,5。
ニューロンセロイドリポフスノース(NCL;バッテン病)は、脳および網膜の重度の変性を引き起こす致命的なリソソーム蓄積症のグループです。現在、さまざまな遺伝子(CLN1-8、CLN10-14)の突然変異に起因するNCLの既知の変異体は13あり、主に子供に影響を与えますが、発症年齢と病気の重症度はさまざまです6。NCLは、認知および運動機能の低下、発作、視力喪失などの一般的な進行性症状を共有しています。NCLの治療法はありません。しかし、脳指向酵素補充療法は現在、セロイドリポフスチック2疾患7,8の臨床試験中であり、AAVを介した遺伝子治療は前臨床試験で大きな期待が寄せられており、CLN5遺伝子治療の臨床試験は2022年に開始される予定です9,10。
他の多くの種は、猫、犬、羊、牛など、自然に発生する形のNCLを開発します。NCLの2つのヒツジモデルが現在ニュージーランドで活発に研究されています:ボーダーデール羊のCLN5病モデルとサウスハンプシャー羊のCLN6病モデル。罹患したヒツジは、網膜萎縮および視力喪失を含むヒト疾患の臨床的および病理学的特徴の多くを示す10,11。セプチリフスチノーシス5型シマチのヒツジにおける脳指向型セロイドリポフスチックリコウソリフスチックリコウセリフスチックリコチックリセリコチックリコチックリセリコウこれは、視力を維持し、より良い生活の質を維持するために網膜を治療する必要性を浮き彫りにし、羊の眼遺伝子治療のためのプロトコルの確立につながりました。
羊の目は、眼球の寸法、硝子体容積、および網膜構造の類似性により、人間の目の優れたモデルを表しています10、12、13。この論文では、少量の(≤100 μL)の治療用ウイルスベクターをヒツジの眼にIVT送達するための外科的プロトコルについて詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>1 mL 低デッドスペース安全シリンジ、0.5 インチ ニードルが恒久的に取り付けられた</td><td>Fisher Scientific、オークランド、ニュージーランド</td><td>05-561-28</td><td>Covidien Monoject Tuberculin 安全シリンジまたは類似の</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>使用前に滅菌するオートクレーブ チューブ</td></tr><tr><td>ガスベンチとモニター付き麻酔器&nbsp;</td><td>Hyvet麻酔、クライストチャーチ、ニュージーランド抗生物質</td><td></td><td></td></tr><tr><td>点眼薬&nbsp;</td><td>Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand</td><td></td><td>商品名: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)</td></tr><tr><td>BrightMount plus anti-fade mounting medium</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime; ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>ジアゼパム鎮静剤</td><td>Ilium、Troy Laboratories Pty Ltd、タウランガ、ニュージーランド</td><td></td>5 <td>mg / mL</td></tr><tr><td>気管内チューブ</td><td>Flexicare Medical Ltd、Mountain Ash、英国</td><td></td><td>標準、カフ付き。サイズ 7、7.5、または8 羊のサイズに応じて</td></tr><tr><td>眼鏡</td><td>ケープスメディカル株式会社、タウランガ、ニュージーランド</td><td>KP151/14</td><td>ノパバラカー-コリブリ (10 mm)</td></tr><tr><td>穴あき手術用ドレープ</td><td>Amtech Medical Ltd、ファンガヌイ、ニュージーランド</td><td>DI583</td><td>または類似のもの&nbsp;</td></tr><tr><td>フィルターチップ</td><td>Interlab、オークランド、ニュージーランド10</td><td></td><td>、200、および1,000 &micro;L&nbsp;</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液(37%)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、オークランド、ニュージーランド</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>0.9%NaClで蒸留水で最大10%を作る</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad, CA, USA&</td><td>nbsp;A-11012</td> 1<td>:500</td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔薬</td><td>Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケタミンHCl麻酔薬/鎮痛薬</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd, オークランド, ニュージーランド</td><td></td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>喉頭鏡(獣医学)</td><td>KaWe Medical, Denmark</td><td></td><td>Miller Cブレード, サイズ2</td></tr><tr><td>針&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>302025</td><td>BD Hypodermic Needles, or similar</td></tr><tr><td>Non-steroidal anti-inflammatory</td><td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand</td><td>49402/008</td><td>商品名: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)</td></tr><tr><td>Non-toothed Forceps</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AB864/16</td><td>or similar&nbsp;</td></tr><tr><td>歯のない止血</td>剤 <td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AA150/12</td><td>or similar&nbsp;</td></tr><tr><td>通常のヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、クライストチャーチ、ニュージーランド</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>酸素(医療用)</td><td>BOCガス、クライストチャーチ、ニュージーランド</td><td></td><td>D2シリンダー、ガスコード180</td></tr>リン酸<tr><td>緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand</td><td>10010023</td><td>滅菌済みろ過</td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素溶液</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>005835</td><td>商品名:ベタジン(10%ポビドンヨード)</td></tr><tr><td>ウサギ抗牛グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>Z0334</td><td>1:2,500</td></tr><tr><td>の希釈で使用ニワトリベータ作用(CBh)プロモーターとコドン最適化ヒツジCLN5を含む自己補色アデノ随伴ウイルス血清型9</td> ノース<td>カロライナ大学ベクターコア、ノースカロライナ州、米国。</td><td>scAAV9/CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム 0.9% IV 溶液</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AHB1322</td><td>商業名: 生理食塩水&nbsp;</td></tr><tr><td>皮下抗生物質</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd、ウェリントン、ニュージーランド</td><td></td><td>商品名:デュプロシリンLA(150,000 IU / mLプロカインペニシリンおよび115,000 IU / mLベンザチンペニシリン)</td></tr><tr><td>外科用鋭利な鈍い湾曲ハサミ&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Syringe Luer Lock</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand</td><td>SH159/SH160</td><td>滅菌シリンジ; 10 mL (導入薬の作成用) 20 mL (生理食塩水の作成用</td></tr>) <tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>Powder EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ</td><td>28461115</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒツジの目の硝子体内注射

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

網膜への治療薬の送達には、硝子体内(IVT)、網膜下、脈絡膜上、眼周囲、または局所投与を含むいくつかの方法があります。IVT薬物送達は、眼の後房を満たし、眼球の形状を維持するゼラチン状物質である眼の硝子体液への注射を含む。IVT経路は網膜下送達よりも特異的に標的化されていませんが、侵襲性ははるかに低く、さまざまな眼疾患の臨床現場で広く使用されています。 
我々は以前、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介遺伝子治療製品(AAV9)の硝子体内送達の有効性を実証した。CLN5)は、天然に存在するCLN5型のニューロンセロイドリポフスチン症(NCL)を有するヒツジにおいて。罹患したヒツジは、片方の眼でIVT遺伝子治療を受け、もう片方の未治療の眼を内部対照とした。網膜の構造と機能は治療後15か月まで治療された眼で維持されましたが、未治療の眼は死後検査中に機能が徐々に低下し、重度の萎縮を示しました。ヒツジの研究に基づいて、CLN5遺伝子治療製品は、2021年9月に米国食品医薬品局によって候補治験新薬(IND)として認可されました。この論文では、治療用ウイルスベクターをヒツジの目にIVT送達するための外科的プロトコルについて詳しく説明します。

セロイドリポフスチ NCLのヒツジの網膜機能障害および変性を減弱させるCLN5遺伝子治療ベクターのIVT送達の有効性は、この研究グループ15によって以前に実証されています。罹患したヒツジは、AAV血清型9(AAV9)ベクター(AAV9)にパッケージされたCLN5の100μLIVT注射を単回受けた。CLN5)を片方の眼に挿入し、反対側の眼を未治療の内部コントロールとして機能させる。視力は、注射時の年齢(3か月)から末期疾患(18か月)まで毎月評価されました。網膜組織学の死後分析は、治療された眼と未治療の眼、ならびに年齢を一致させた健康な対照とCLN5に罹患した対照で実施されました。
網膜電図(ERG)解析では、治療を受けた眼では網膜機能が維持されていることが示されましたが、未治療の眼では、CLN5に罹患した動物と同様に低下しました(図4)15。網膜組織像は治療された眼でほぼ正常化され、網膜中心では健康な対照動物に匹敵する総網膜厚さ...

硝子体内注射は、ウイルス媒介遺伝子治療を網膜に送達することを目的として羊の目に行われました。

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

硝子体内注射は、治療薬を網膜に送達するために使用することができる。人間の目のモデルとしての羊の目への硝子体内注射のプロトコルがここに提示されています。硝子体内注射は、他の眼内注射よりもはるかに侵襲性が低いです。硝子体内注射は、遺伝子治療製品を送達し、天然に存在するニューロンセロイドリポフスノースを有するヒツジの網膜変性を治療するために首尾よく使用することができる。羊に麻酔をかけたら、20ミリリットルの注射器を使用して1〜5%のポビドンヨード溶液で洗浄することにより、注射する眼を無菌消毒し始めます。次に、無菌の開窓された外科用ドレープを目の上に配置します。眼球をまぶたに当てはめて、目を開いたままにします。鉗子で目の背側外側の球結膜をつかみ、眼球を腹内側に回転させます。針を眼の外側の強膜の約7ミリメートル後方に挿入し、レンズを避けるために後方に角度を付けます。網膜表面を乱すことなく、できるだけ網膜に近いボーラスとして100マイクロリットルの単回注射を投与する。検鏡とドレープを取り除く前に、約10〜15ミリリットルの1〜5%ポビドンヨウ素溶液とそれに続く10ミリリットルの生理食塩水で目をすすぎます。.網膜電図分析では、治療された眼の網膜機能が維持されていることが示されましたが、未治療の眼はセロイドリポフスチノリフスチノリコウノリフス�に罹患した動物と同様に低下しました。網膜組織像は、治療された眼ではほぼ正常化しており、網膜中心では健康な対照動物に匹敵する総網膜厚さであった。対照的に、未治療の網膜の厚さは、CLN5に罹患した動物と同等であった。網膜ストレスとアストログリアのマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の発現は、治療を受けた眼で未治療の眼よりも低く、治療後に疾患関連炎症が弱まったことを示しています。ヒツジの眼への硝子体内注射のプロトコルの確立により、ヒツジを使用して、多くの硝子体内投与治療薬の安全性と有効性をテストできるようになりました。

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

硝子体内注射、眼の疾患のためのまたは局所治療の直接的な応用として、視覚科学の研究に広く使用されている技術です。このビデオでは、ガラスピペットで1ミリリットル注射器を使用して硝子体内注射のためのプロトコルを示した。大量出血し、レンズの損傷を避けることについての有用なヒントが与えられている。...

眼疾患モデルを確立するための硝子体内注射

出典: Park, SW, et al.マウス網膜色素上皮における遺伝子治療のためのウイルスベクタの輪部アプローチ‐網膜下注射J. Vis. 経験。(2015年)このビデオでは、マウスモデルで網膜色素上皮(RPE)にウイルスベクターを網膜下注射する方法を説明しています。麻酔と眼の準備から正確なレンチウイルスベクター送達までの手順が詳細に説明されており、RPE...

マウスモデルにおける網膜色素上皮へのウイルスベクターの網膜下注射

ウサギは、眼内薬の薬物動態を研究するために広く使用されています。ウサギの眼を用いた眼内薬物の薬物動態研究の方法について述べる。...

眼薬の薬物動態試験でウサギの眼の使用

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網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。...

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。...

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。...

小動物モデルにおけるアデノ随伴ウイルスベクターの結膜下投与

このプロトコルは、中央角膜切開と前房への長いトンネルを使用したラットの皮内房内注射の技術を説明しています。この注入方法により、不注意による組織損傷を誘発するリスクが最小限に抑えられ、精度と再現性が向上します。...

副作用のリスクが低いラットにおける皮内注射

このプロトコルは、経結膜アプローチを使用してラットの視神経にアクセスして注射する独自の技術について説明しています。...

ラット視神経への注射のための経結膜アプローチ

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成体ラットにおける眼治療送達と高度な組織回収

学ぶヒツジの硝子体内注射法による遺伝子治療の実施手順。網膜変性症の治療に向けた侵襲性の低いアプローチを示し、ヒト眼モデルとしての有効性を検証する方法を解説します。

ヒツジの目の硝子体内注射

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