Name: 新たに単離された初代マウス肝細胞へのCas9リボヌクレオタンパク質およびmRNAのエレクトロポレーション媒介送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶCRISPR-Cas9電気穿孔法による初代マウス肝細胞の遺伝子編集技術。エレクトロポレーションを用いてリボヌクレオタンパク質とmRNAを送達し、代謝性肝疾患のin vitroおよびin vivo疾患モデル生成を可能にする再現性の高い手法です。

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RNCは、米国国立衛生研究所の国立一般医学研究所(NIGMS)、米国肝疾患研究協会財団、および米国遺伝子細胞療法学会の支援を受けて、サウスカロライナ州バイオエンジニアリングセンターから助成金番号P30 GM131959、2021000920、 と2022000099それぞれ。内容は著者の責任であり、必ずしも米国遺伝子細胞療法学会または米国肝疾患学会財団の公式見解を表すものではありません。図1の回路 図 は、BioRender.com で作成しました。

動物実験はすべて、クレムソン大学で承認された動物ケアおよび使用委員会のガイドラインおよび承認されたプロトコルに準拠して実施された。外科的処置は、麻酔をかけた野生型C57BL/6Jマウスにおいて、生後8〜10週齢の間に実施された。
1. 動物手術
<ol><li>溶液および器具の調製 注:灌流溶液および麻酔カクテルレシピは、 材料表に示されています。<ol><li>灌流溶液1(HEPES、EGTA、およびEBSS)、灌流溶液2(HEPES、EGTA、EBSS、CaCl 2、およびMgSO4)、および灌流溶液3(溶液2およびリベラーゼ)を調製する。解決策がよく混在していることを確認してください。</li>
		<li>手順を開始する前に、ウォーターバスを42°Cに設定し、灌流ソリューション1、2、および3を最低30分間予温し、ウォーターバスに保管してください。 注:灌流溶液1および2はカルシウムをキレートし、肝臓の血液を洗い流します。灌流液3は、細胞外マトリックスを解離させる消化酵素リベラーゼを含有する。</li>
		<li>150mLのDMEM + 10%ウシ胎児血清(FBS)を円錐管に入れ、氷の上に置きます。 注:この培地は、肝臓カプセルから細胞を放出し、それぞれステップ2.1および2.2で単離された肝細胞を洗浄するために使用されます。</li>
		<li>遠心分離機を4°Cに設定する。</li>
		<li>70%エタノールで満たされたフラスコにチューブの両端を置き、エタノールを3回循環させて、ポンプチューブを滅菌する。</li>
		<li>チューブを蒸留水で洗って空にします。</li>
		<li>チューブを予温した30mLの灌流溶液1で満たし、続いて8mLの灌流溶液2で満たします。チューブにまだより多くの流体を入れるスペースがある場合は、チューブの残りの部分に灌流溶液3を満たします。チューブに気泡を導入しないように、別の灌流溶液に切り替えるときにポンプを停止します。</li>
		<li>余分なチューブを42°Cのウォーターバスに入れて、灌流溶液を暖かく保ちます。</li>
		<li>ポンプチューブの端部を灌流液3の入った円錐管に入れ、水浴中に保管したままにする。 注:このステップは、灌流中にポンプが灌流溶液3を連続的に充填できるようにするために必要です。</li>
	</ol></li>
	<li>動物の準備<ol><li>麻酔薬カクテルを10-11.7μL/g体重の用量で腹腔内に注射することによってマウスを麻酔する。麻酔カクテルの最終濃度は、7.5 mg/mL ケタミン、0.25 mg/mL アセプロマジン、1.5 mg/mL キシラジンです。</li>
		<li>マウスの呼吸を監視し、マウスが痛みに反応していないことを確認します。マウスが毎分〜55〜65回の呼吸数を持ち、つま先をつまんでも反応せず、弛緩した尾を持つまで待ちます。さらに、閉じた目の内側の皮膚に軽く触れて、眼瞼(まばたき)反射を確認してください。マウスがまばたきをしたり、目の筋肉がけいれんしたりする場合は、麻酔カクテル全体の用量を5〜10μL増やしてください。</li>
		<li>マウスを仰臥位に置き、ピンまたはテープを使用して四肢を表面に固定します(補足図S1)。</li>
		<li>腹部に70%エタノールを噴霧し、綿球で拭き取って乾かします。</li>
	</ol></li>
	<li>肝臓灌流<ol><li>はさみを使って腹部の皮膚にU字型の横切開を行い、側面を通して穴を広げます。</li>
		<li>引き続き皮膚を胸郭に開放する。</li>
		<li>はさみを使用して、腹膜を切り取って腹腔を胸郭まで露出させ、臓器を傷つけないように注意してください。鉗子の裏側またははさみの鈍い表面を使用して腸を右側に動かします。下大静脈と門脈を特定する(補足図S1)。</li>
		<li>ポンプを起動して、予温された灌流溶液をカテーテルを通して洗い流す。</li>
		<li>ポンプを停止し、すべての空気がシステムを通して洗い流されたら、カテーテルを取り外します。カテーテルに接続された針の先端を静脈に対して10°-20°の角度で下大静脈に挿入します。カテーテルから針を取り外し、静脈に平行な動きでカテーテルを静脈に静かに押し込みます。 注:ユーザーは、静脈内の適切なカニューレを確認するために、カテーテル内の血液のフラッシュバックを観察する必要があります。</li>
		<li>カテーテルを静脈内にさらに移動させることなく、チューブをカテーテルに接続します。</li>
		<li>2 mL/分の流量でポンプを起動します。灌流が成功したという兆候として、すぐに青白くなる肝臓を探してください。</li>
		<li>はさみで門脈を切ってください。</li>
		<li>徐々に流量を5mL/minに増やします。</li>
		<li>おおよその切断部位の門脈に定期的に圧力をかけ、鉗子または綿棒を使用して排水を遮断し、良好な灌流を促進する。</li>
		<li>灌流溶液3が流れたら、肝臓の弾力性を注意深く監視する。肝臓が柔らかくなっているかどうかを判断するには、綿棒または鉗子で肝臓を静かに押し、肝臓にくぼみが形成されているかどうかを確認します。細胞生存率の損失を避けるために、過剰に灌流しないように注意してください。</li>
		<li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li><ol><li><li><li></li><li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li> </li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li></li><li> </li><li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li><li> </li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li></li><li><li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63828/63828eq01.jpg" style="margin: auto;"></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><ol><li><li></li><li><li></ol></li><li><li><ol><li></li><li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><li></li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示すべき競合する利害関係はない。

肝細胞単離のためのプロトコルに概説されているステップは挑戦的であり、熟練のための練習を必要とする。肝臓からの肝細胞単離を成功させるためのいくつかの重要なステップがあります。まず、下大静脈の適切なカニューレレーションは、完全な肝臓灌流に不可欠です。灌流後の肝臓におけるブランチングの不在は、カテーテルの変位を示す(表1)。下大静脈(逆行性灌流)は、門脈(順行性灌流)よりも簡単でアクセスしやすいため、手順でカニューレ採取されました17,18。いくつかのプロトコルは、カテーテル19を固定するために縫合糸を使用する。しかし、縫合糸はプロセスを複雑にする。カテーテルを縫合すると、カテーテルの配置ミスや位置の調整が不可能になるなど、望ましくない結果が生じる可能性があります。また、針を抜くことなく肝臓でカニューレを行うことができるため、肝臓灌流をさらに簡略化することができる。ポンプをカテーテルに接続することは、静脈内の針で不要である。さらに、誤ってカテーテ...

肝臓のIMDは、毒性代謝産物の蓄積につながる代謝に関与する重要な肝酵素の欠乏を特徴とする遺伝性疾患である。治療がなければ、肝臓のIMDは臓器不全または早期死亡をもたらす1,2。肝臓のIMDを有する患者のための唯一の治癒的選択肢は、ドナー臓器の可用性が低いため、および手順3,4に続く免疫抑制療法による合併症のために制限されている同所性肝移植である。臓器調達移植ネットワークが収集した最近のデータによると、肝移植待機リストに載っている成人患者の40%〜46%のみが臓器を受けており、これらの患者の12.3%が待機リストで死亡しています5。さらに、すべてのまれな肝疾患のわずか5%がFDA承認の治療を受けています6。肝臓のIMDに対する新規治療が決定的に必要であることは明らかです。しかし、新しい治療選択肢を開発するには、適切な疾患モデルが必要です。
インビトロおよびインビボシステムを使用してヒト疾患をモデル化することは、効果的な治療法を開発し、肝臓のIMDの病理を研究するための障害であり続けている。まれな肝疾患を有する患者からの肝細胞は、7を得ることが困難である。動物モデルは、疾患病理学の理解を深め、治療戦略をテストするために不可欠です。しかし、1つの障害は、致命的な変異を持つ胚からモデルを生成することです。例えば、Jag1遺伝子の5'末端付近に5kb配列のホモ接合型欠失を含む胚を有するアラギル症候群(ALGS)のマウスモデルを作成しようとする試みは、胚の早期死をもたらした8。さらに、胚性幹細胞における遺伝子編集によるマウスモデルの生成は、時間とリソースを大量に消費する可能性がある9。最後に、突然変異は標的組織の外側に現れ、交絡変数をもたらし、疾患の研究を妨げる可能性がある9。体細胞遺伝子編集は、肝臓組織における編集を容易にし、胚性幹細胞を用いたモデル生成に関連する課題を迂回するであろう。
エレクトロポレーションは、高電圧電流を印加して細胞膜を透過させることにより、CRISPR-Cas9を核に直接送達することを可能にし、ヒト胚性幹細胞、多能性幹細胞、ニューロンなどのトランスフェクション技術に非妥協的なものを含む多くの細胞型と適合性である10,11,12.しかし、低い生存率はエレクトロポレーションの潜在的な欠点である。手順を最適化すると、毒性を制限しながら高レベルの送達をもたらすことができます13。最近の研究は、非常に効率的なアプローチとして、CRISPR-Cas9成分を初代マウスおよびヒト肝細胞にエレクトロポレーションすることの実現可能性を実証している14。肝細胞におけるエクスビボエレクトロポレーションは、肝臓のヒトIMDsのための新しいマウスモデルを生成するために適用される可能性を有する。
このプロトコルは、肝臓からマウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9を、Cas9タンパク質と合成シングルガイドRNA(sgRNA)、またはCas9 mRNAとsgRNAを組み合わせて高レベルのオンターゲット遺伝子編集を得るためのRNP複合体としてエレクトロポレーションするための詳細なステップバイステップ手順を提供します。さらに、このプロトコルは、新たに単離されたマウス肝細胞へのCRISPR-Cas9のエレクトロポレーション後の遺伝子編集効率、生存率、および機能性を定量する方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 8チューブ FLEX-FREEストリップ、クリアフラットキャップ付き、ナチュラル</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルコラーゲンプレート</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>オールインワン蛍光顕微鏡</td><td>キーエンス</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>アナログボルテックス</td><td>ミキサーVWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ARTワイドボアフィルターチップ1,000&micro;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>全自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Blue Wax Dissection Tray</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9インチ x 6.5インチ x 1/2インチ + F21</td></tr><tr><td>セルスクレーパー/リフター</td><td>アルゴステクノロジー</td><td>ズ UX-04396-53</td><td>非発熱性、滅菌</td></tr><tr><td>コニカルチューブ (15 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ (50 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>コットンアプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>湾曲はさみ</td><td>のクーパー外科</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td>100mm、滅菌</td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm、滅菌</td></tr><tr><td>エポックマイクロプレート分光光度計</td><td>BioTek</td>機器<td>250082</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン細胞ストレーナー(70 & マイクロ;m)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>クーパーサージカル</td><td>61864</td><td>ユーロメッド広告ソン組織鉗子</td></tr><tr><td>IVカテーテル&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0.75</td></tr><tr><td>in IV 輸液セット</td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini Centrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Scientific 1220P38</td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Device</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>マスターフレックス</td><td>&nbsp;HV-77120-42</td><td>10 から 60 rpm; 90 から 260 VAC</td></tr><tr><td>精密ポンプ管</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 ft, シリコーン</td></tr><tr><td>Primaria 培養プレート</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>窒素含有組織培養プレート</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット (25 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, 滅菌</td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 シリーズ、2.5 L</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP、5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp;EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>低グルコース、ピルビン酸</td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞のメンテナンスミディアム (MM)</td><td>ロンザ</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞プレーティング メディウム (PM)</td><td>ロンザ</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>マウスアルブミン ELISA キット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>マウス/ラット肝細胞ヌクレオフェクターキット</td><td>ロンザ</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなし</td></tr><tr><td>Percoll (PVP 溶液)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>過ヨウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 抽出液</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>シフフクシン亜硫酸試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Phenol red</td></tr><tr><td>Vybrant MTT Cell Viability Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4°で安定しています。C 2ヶ月間</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14155063</td> 200 mL EGTA(0.5 M)<td>まで完全 200 mL</td></tr> <tr><td></td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro;L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7.3, 1 m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><ストロング>灌流液2(pH7.4、フィルター滅菌済み)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4°で安定しています。C 2ヶ月間</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H20 (1.8 mM)</td><td>シグマ</td><td>C7902-500G</td><td>360 &L of 1 M stock&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td> HEPES (1 M)<td>まで 200 mL まで完了</td></tr><tr><td>ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H20 (0.8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 & マイクロ;L of 1 M stock</td></tr><tr><td>灌流溶液 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td>使用前に新鮮に調製</td></tr><tr><td>溶液 2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>リベラ</td>ーゼ <td>ロシュ</td><td>5401127001</td><td>0.094 Wunsch 単位/mL</td></tr><tr><td>マウス麻酔カクテル&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acepromzine</td><td></td><td></td><td>0.25 mg/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td></td><td></td><td>7.5 mg/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td></td><td></td><td>1.5 mg/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE:分解によるインデルの追跡</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

新たに単離された初代マウス肝細胞へのcas9リボヌクレオタンパク質およびmrnaのエレクトロポレーション媒介送達

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

このプロトコルは、初代マウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質(RNP)およびmRNAとしてエレクトロポレーション媒介送達するための迅速かつ効果的な方法を記載している。初代マウス肝細胞を3段階逆行性灌流法を用いて単離し、肝臓あたり最大50×106 細胞の高収率および>85%の細胞生存率をもたらした。このプロトコルは、肝細胞のプレーティング、染色、および培養に関する詳細な手順を提供します。この結果は、エレクトロポレーションが緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞の割合およびマウス肝細胞における>35%の適度な細胞生存率によって測定されるように、89%の高いトランスフェクション効率を提供することを示している。
このアプローチの有用性を実証するために、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ遺伝子を標的とするCRISPR-Cas9を、肝臓の遺伝性代謝疾患(IMD)に関連する治療遺伝子を破壊するための原理実証遺伝子編集として初代マウス肝細胞にエレクトロポレーションした。mRNAによる47%の編集効率と比較して、RNPでは78%の高いオンターゲット編集が観察された。肝細胞の機能性を、RNPおよびmRNAとしてCRISPR-Cas9を送達することが初代マウス肝細胞において同等の細胞生存率をもたらすことを示したアルブミンアッセイを用いてイン ビトロ で評価した。このプロトコルの有望な用途は、肝臓に影響を及ぼすヒト遺伝性疾患のマウスモデルの生成である。

肝臓からの平板状初代肝細胞の単離 肝臓灌流および肝細胞単離の全体的なプロセスを 図1に示します。本実験では、野生型、8~10週齢のC57BL6/6Jマウスを用いた。この手順は、マウスあたり20〜50個×106 個の細胞を産出し、生存率は85%〜95%であると予想されます。生存率が&lt;70%の場合、死細胞を除去するためにパーコール処理に従うべきである。新たに単離した肝細胞は、コラーゲンIコートまたは窒素含有組織培養プレートに播種する必要があります。めっきから3〜12時間以内に、肝細胞はプレートに接着すると予想され、細胞形態は24時間以内に典型的な多角形または六角形の外観を想定する(図2)。肝細胞は、グリコーゲンの形でグルコースを貯蔵する肝臓で唯一の細胞である。単離された細胞の純度を検証するために、グリコーゲン染色は、メッキ後24時間で過ヨウ素酸-シッフ試薬を用いて行われる。染色された肝細胞の細胞質はマゼンタ色に見える(<strong class="xfig...

このプロトコルは、初代マウス肝細胞を肝臓から単離し、CRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質およびmRNAとしてエレクトロポレーションして、肝臓の遺伝性代謝疾患に関連する治療標的遺伝子を破壊する技術について記載している。記載された方法は、エレクトロポレーション後に高い生存率および高レベルの遺伝子改変をもたらす。

新たに単離された初代マウス肝細胞へのCas9リボヌクレオタンパク質およびmRNAのエレクトロポレーション媒介送達

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

私たちの技術の主な利点は、in vitroおよびin vivo疾患モデルを生成する方法として、初代マウス肝細胞の遺伝子を編集するための簡単、迅速、かつ再現性のあるアプローチであることです。私たちの技術を使用すると、単離された肝細胞で標的遺伝子をノックダウンしてから患者に移植し、罹患細胞を遺伝子編集肝細胞に置き換えることができるかもしれません。 経験の浅い研究者は、カニューレ挿入と灌流中のカテーテルの安定性の維持に苦労する可能性があります。ユーザーは、開始する前に、手順とトラブルシューティング方法を注意深く読み、練習することをお勧めします。肝灌流と肝細胞分離を実証するのは、臨床施設マネージャーのティナパーカーと大学院研究助手のイライダエイツです。エレクトロポレーション手順は、私の研究室の大学院研究助手であるカリー・スチュアートによって実証されます。麻酔の手術面の下。ハサミを使用して腹部の皮膚をU字型の横方向切開を行うことによって肝臓灌流を開始し、側面から穴を広げます。胸郭に皮膚を開き続けます。ハサミを使用して腹膜を切り裂き、腹腔を胸郭まで露出させます。臓器を傷つけないように注意してください。鉗子の後ろまたははさみの鈍い面を使って腸を右側に動かします。門脈と下大静脈を特定します。ポンプを始動して、予熱した灌流溶液をカテーテルから洗い流します。ポンプを停止し、カテーテルを取り外します。次に、カテーテルに接続された針の先端を静脈に対して10〜20度の角度で下大静脈に挿入し、カテーテルから針を取り外します。次に、静脈と平行な動きでカテーテルを静脈にそっと押し込みます。カテーテルをさらに静脈内に動かさずに、チューブをカテーテルに接続します。毎分2ミリリットルの流量でポンプを始動します。灌流が成功した兆候として、肝臓がすぐに青白くなるのを探します。ハサミを使って門脈を切ります。流量を毎分5ミリリットルまで徐々に増やします。灌流液3が流れたら肝臓の弾力性を注意深く監視する。肝臓が柔らかくなったかどうかを判断するには、綿棒または鉗子で肝臓をそっと押し、肝臓にくぼみができるかどうかを確認します。細胞の生存率の損失を避けるために、灌流しすぎないように注意してください。.30〜50ミリリットルの灌流液3が流れた後に肝臓が柔らかくなったら、ポンプを停止し、カテーテルと胆嚢を取り外します。中身をこぼさないように注意してください。それから慎重に肝臓を解剖します。肝臓を、10%FBS培地を含む氷冷DMEMMを含む100ミリメートルのペトリ皿に入れます。ペトリ皿をそっと回転させて、血栓を取り除きます。肝臓を氷冷DME Mと10%FBS培地を含む新しいペトリ皿に移します。肝嚢から細胞を放出するには、ペトリ皿を氷の上に置き、2対の滅菌鉗子を使用して、すべての葉の肝被膜をそっと引き裂きます。セルリ

electroporation-mediated-delivery-cas9-ribonucleoproteins-mrna-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

記事の詳細は微小電極アレイ（MEA）を使用して付着した哺乳動物細胞培養におけるsiRNAのスクランブル配列の部位特異的なトランスフェクションするためのプロトコル。...

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

トランスポゾン ベースの統合のベクトルの流体尾静脈注射によりマウス肝細胞の安定したトランスフェクション体内。長期的な単一遺伝子の発現や遺伝子や肝臓でミール shRNA の組み合わせ構成とドキシサイクリン誘導式ことができますトランスフェクション...

流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは遺伝子工学の有望なツールを提供し、transgenes の対象となる統合の可能性を開きます。(HMEJ) に参加する相同性の終わりについて述べる-ベースの戦略を効率的な DNA が生体内で統合対象し、標的遺伝子療法 CRISPR/Cas9...

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

ここでは、健康で機能的なプライマリ...

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

ここに提示される、チューブエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞における効率的なCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介遺伝子編集のためのプロトコルである。...

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

リボソームアフィニティ精製(TRAP)の翻訳により、細胞型特異的翻訳mRNAの迅速かつ効率的な単離が可能になります。ここでは、肝再集団とTRAPのマウスモデルにおける流体力学的尾静脈注射を組み合わせた方法を示し、再入発性肝細胞の発現プロファイルを調べる。...

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。...

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

このプロトコルは、一次ヒトT細胞におけるTCRα/β受容体の微型CRISPR–Cas9ゲノム編集を、デジタルマイクロ流体(DMF)エレクトロポレーションプラットフォーム「DMF-ection」を用いて説明しています。この方法は並列で低入力の遺伝子編集を高生存率で可能にし、さらにmRNAの多細胞3D球体への送達にも適応可能です。...

懸濁T細胞および3D細胞モデルにおける低入力CRISPRゲノム編集およびmRNAトランスフェクションのためのデジタルマイクロ流体電気穿孔プラットフォーム

学ぶCRISPR-Cas9電気穿孔法による初代マウス肝細胞の遺伝子編集技術。エレクトロポレーションを用いてリボヌクレオタンパク質とmRNAを送達し、代謝性肝疾患のin vitroおよびin vivo疾患モデル生成を可能にする再現性の高い手法です。

新たに単離された初代マウス肝細胞へのCas9リボヌクレオタンパク質およびmRNAのエレクトロポレーション媒介送達

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