Name: リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶマウス顔面突起と培養口蓋間葉系細胞からリン酸化タンパク質を保持した全細胞タンパク質溶解物の単離法。頭蓋顔面発生におけるリン酸化タンパク質の動態と機能を解析し、細胞内シグナル伝達の分子メカニズムを解明する。

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129S4マウスは、シナイ山のアイカーン医科大学のフィリップ・ソリアーノ博士からの贈り物でした。この研究は、国立衛生研究所(NIH)/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)R01 DE027689およびK02 DE028572からK.A.F.、F31 DE029976からM.A.R.、F31 DE029364からB.J.C.D.への資金で支援されました。

動物を含むすべての手順は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、施設のガイドラインおよび規制に準拠して実施されました。生後1.5~6ヶ月の雌129S4マウスを21~23°Cの亜熱中性温度で飼育し、胚採取に用いた。プロトコルの概略ワークフローを 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、試薬、および動物の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. E11.5マウス胚の採取
<ol><li>約50%の変位(3チャンバーで2.95L/分)および曝露期間に必要なIACUC承認のCO2流量を使用して、CO2チャンバーでの時限交配中の膣プラグの検出後11.5日後に妊娠中のメスマウスを安楽死させる(材料表を参照)。安楽死の二次的方法として子宮頸部脱臼を行う。すぐに解剖に進みます。</li>
	<li>マウス本体を腹側を上に向けて解剖ボードの上に置きます。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。</li>
	<li>まっすぐなせんけ鉗子で前部の皮膚を膣口につまんで持ち上げ、持ち上げられた皮膚と下層の層をまっすぐな刃の手術用はさみで両側に45°の角度で切断して腹腔を開き、前肢と後肢のほぼ半分の各側面に広がる「V」形状を生成します。</li>
	<li>Semken鉗子を使用して、子宮角の1つをつかみ、外科用はさみで卵管の下と子宮頸部の上を切断します。子宮角を完全に除去できるようにメソメトリウムを切り取ります。</li>
	<li>解剖した子宮角を10 mLの組織学リン酸緩衝生理食塩水(PBS)[0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 一塩基, 10.14 mMNa2HPO 4二塩基, pH7.4] に10 cmのシャーレに移す。</li>
	<li>腹腔の反対側にある第2の子宮角は、ステップ1.4-1.5で説明したのと同じ手順を使用して除去する。</li>
	<li>個々の胚の解剖に直ちに進まない場合(すなわち、2匹目の雌マウスが解剖される場合)に、両方の子宮角を含む10cmのシャーレを氷の上に置く。</li>
	<li>解剖実体顕微鏡下で、デュモン#5の細かい鉗子で子宮角から各胚を慎重に解剖します。子宮筋層、デシドゥア、および絨毛膜をゆっくりと引き離す。胚を囲む比較的透明な羊膜を引き裂いて取り除き、胚と胎盤をつなぐ臍帯を切断する。</li>
	<li>切断したプラスチック転写ピペットまたは胚スプーンを用いて、氷上の12ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中の組織学PBSの2.5mLに各解剖胚を移す。 注:複数の遺伝子型の胚を含む可能性のあるごみを扱う場合は、氷上の独自のラベル付き0.5 mLマイクロ遠心チューブにそれぞれを入れて、ジェノタイピングのために各胚を囲む羊膜を保存します。</li>
</ol>2. E11.5マウス胚からの上顎突起を解剖する
<ol><li>組織学PBS10mLを含む3つの10cmペトリ皿を準備し、胚間の回転に使用するためにそれらを氷上に保管する。</li>
	<li>12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルから、切断されたプラスチック転写ピペットまたは胚スプーンを用いて氷上の組織学PBSを有する10cmペトリ皿の1つに1つの胚を移す。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で、微細な鉗子を使用して顔から各上顎プロセスを分離する。まず、側鼻突起と上顎突起とを隔てる自然圧痕に沿って1つの上顎突起の前側を切断する(図2A)。</li>
	<li>第2に、上顎突起と下顎突起とを隔てる自然のくぼみに沿って上顎突起の後側を切断する(図2A)。</li>
	<li>第3に、上顎突起を完全に分離するために、上顎突起の前側から後側に向かって、上顎突起の眼側で、上顎突起の端部を基準とした垂直方向の切り込みを行う(図2A-C)。</li>
	<li>顔の反対側の上顎プロセスに対してこれらの3つのカットを繰り返します。</li>
	<li>2 mL の小型ラテックス電球を備えた 9 インチパスツールピペットを使用して、解剖した一対の上顎プロセスと約 30 μL の組織学 PBS の小さな液滴を、氷上の標識された 35 mm シャーレに移します (図 2D)。</li>
	<li>各胚についてステップ2.3〜2.7に従い、組織学PBSを含む3つの10cmペトリ皿を胚間の氷上で回転させる。解剖された上顎突起の個々のペアを氷上の別々の35mmペトリ皿に入れる。 注:上顎プロセス外胚葉および間葉の分離(ステップ2.9〜2.17)は、同腹仔内のすべての胚の上顎プロセスを解剖した後に行うことができる。外胚葉と間葉の両方を含む無傷の上顎突起が必要な場合は、以下のステップ2.18に進みます。</li>
	<li>組織培養PBSに新鮮な2%トリプシン250 μL、組織培養PBSに10%ウシ胎児血清(FBS)250 μLを調製し、氷上で保存する。</li>
	<li>上顎プロセスを含む組織学PBSの最初の小さな液滴とは別の35mmシャーレに、約30μLの2%トリプシンの第2の小さな液滴を置く。パスツールピペットを使用して、一対の上顎プロセスを2%トリプシンの小さな液滴に移します(図2D)。</li>
	<li>皿を氷の上で15分間インキュベートする。</li>
	<li>氷から35mmのペトリ皿を取り出し、解剖顕微鏡の下に置きます。</li>
	<li>微細な鉗子を用いて、各上顎突起から外胚葉の層をゆっくりと慎重に引き離す(図2E)。 注:外胚葉が無傷のシートで間葉から分離していない場合は、分離を続行する前に、室温(RT)で2%トリプシン中で最大5分間インキュベートしてください。組織が2%トリプシンで崩壊し始めたら、以下に説明するように上顎プロセスを10%FBSに移動してトリプシンを中和し、外胚葉と間葉の分離を終了します。</li>
	<li>上顎突起外胚葉と間葉が分離されたら(図2F)、パスツールピペットを使用して、一対の上顎突起から、約30μLの10%FBSの3番目の小さな液滴に所望の組織を移します(図2D)。</li>
	<li>35mmペトリ皿を氷の上に置き、トリプシン処理を停止します。</li>
	<li>上顎突起組織を氷上で10%FBS中で1〜2分間インキュベートし、その後、パスツールピペットを使用して、両方の上顎突起から、氷上の約30μLの予冷組織学PBSの第4の小さな液滴に組織を移す(前の3つの小さな液滴とは分離する)(図2D)。</li>
	<li>上顎プロセス組織を組織学PBS中で1分間インキュベートし、パスツールピペットの先端で上顎プロセス組織の周りに組織学PBSを穏やかに旋回させ、すべてのFBSが組織から洗い流されるようにする。</li>
	<li>パスツールピペットを使用して、一対の上顎プロセス組織を氷上の標識された1.5mL微量遠心チューブに移し、組織学PBSの移送を最小限に抑えた。パスツールピペットで1.5mL微量遠心チューブ内の過剰な組織像PBSを除去します。</li>
	<li>上記の手順に従って、同腹仔の各胚から上顎プロセスを解剖する。</li>
	<li>サンプルを直ちに処理して、全細胞タンパク質溶解物(下記)を単離するか、-80°Cで長期間保存します。長期保存する前に、1.5 mL マイクロ遠心チューブをドライアイス上の 100% EtOH の浴中で 5 分間スナップフリーズします。</li>
</ol>3. マウス上顎突起から全細胞タンパク質溶解物を単離する
<ol><li>上顎プロセスが以前に-80°Cで凍結していた場合は、氷上で解凍する。</li>
	<li>0.1 mLの氷冷NP-40溶解緩衝液(20 mM Tris HCl pH 8、150 mM NaCl、10% グリセロール、1% ノニデット P-40、2 mM EDTA、4 °C 保存)をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (1x 完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル [水に溶解; -20 °C 保存]、1 mM PMSF [イソプロパノールに溶解; 4°C 保存]) と共に加えます。 氷上で使用直前に10 mM NaF[-20°Cで保存;凍結/解凍を避け]、1 mMNa3VO4[-20°Cで保存]、25 mM β-グリセロリン酸[4°Cで保存])を加えた。 注:細胞分画は、細胞質、核、膜、またはミトコンドリアタンパク質画分を単離するために代替的に行うことができる。</li>
	<li>ピペットマンを200μLで10回上下させる。</li>
	<li>ボルテックスを10秒間、次いで200μLのピペットマンで上下に10回ピペットする。気泡の発生を避けてください。</li>
	<li>チューブリボルバー付きの1.5 mL/2 mLパドルを使用して端から端まで回転させながら、4 °C で 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを13,500 × g で4°Cで20分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を200 mLピペットマンで氷上の新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに集めます。</li>
	<li>実験サンプル用のタンパク質溶解液10 μL+NP-40溶解バッファー10 μL、およびNP-40溶解バッファー(画分V)のウシ血清アルブミン(画分V)(BSA)を3~5希釈液(BSA)をNP-40溶解バッファーでタンパク質標準として0.25~2.0 mg/mLの範囲で使用して、タンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を定量します。</li>
	<li>ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) (ステップ 5) を続行するか、残りの溶解物をドライアイス上で急速凍結し、-80 °C で長期間保存します。</li>
</ol>4. 初代および/または不死化マウス胚性口蓋間葉(MEPM)細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離する
注:E13.5マウス胚および不死化MEPM細胞からの初代MEPM細胞の単離および培養は、以前に記載されている32、33、34。成長因子による細胞の刺激(ステップ4.1〜4.7)は、細胞溶解の前に行うことができる。非刺激細胞が必要な場合は、以下のステップ4.8に進みます。
<ol><li>真空システムに取り付けられた5.75インチパスツールピペットを使用して、6cm細胞培養皿中の約70%コンフルエントでMEPM細胞から増殖培地[ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、10%FBSで吸引する。</li>
	<li>1mLの組織培養PBSで細胞を洗浄する。</li>
	<li>37°Cの水浴中で予備加温した血清飢餓培地3mL[DMEMとペニシリン50U/mL、ストレプトマイシン50μg/mL、2mM L-グルタミン、0.1%FBS]を加える。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2で23 時間インキュベートする。</li>
	<li>血清飢餓培地を、3 mL の新鮮な、予め加温した血清飢餓培地と交換する。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2 で1時間インキュベートする。</li>
	<li>所望の時間の間、経験的に決定された濃度で選択した成長因子で細胞を刺激する。</li>
	<li>真空システムに取り付けられた5.75インチパスツールピペットを使用して、MEPM細胞から80%〜100%コンフルエントで培地を吸引する。</li>
	<li>氷冷組織培養PBS(6cm細胞培養皿の場合は1mL)で細胞を2回洗浄する。最後の洗浄中にプレートを横に傾けて、すべての組織培養PBSが吸引されるようにする。</li>
	<li>使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した氷冷NP-40溶解バッファー(6cm細胞培養皿の場合は0.1mL)を氷上に加えて細胞を溶解する。</li>
	<li>プレートを氷上で5分間インキュベートし、プレートを完全にカバーできるようにします。</li>
	<li>予冷されたセルリフターを使用してプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液を氷上の予冷された1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。</li>
	<li>細胞懸濁液を4°Cで30分間インキュベートし、チューブリボルバーを備えた1.5mL/2mLパドルを用いてエンドオーバーエンドを回転させた。</li>
	<li>上記の手順 3.6 ~ 3.9 に進みます。</li>
</ol>5. リンタンパク質に対するマウスフェイシャルプロセスおよび/またはMEPM細胞からの全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング
<ol><li>SDS-PAGE用の全細胞タンパク質溶解物サンプルを調製する。<ol>
<li>ロードするタンパク質の量を決定します, 組織/細胞内のタンパク質の存在量に応じて;12.5μgは、通常、全細胞タンパク質溶解物中の強固に発現されたタンパク質に十分である。</li>
		<li>等量の2x Laemmli緩衝液[20%グリセロール、4%SDS、0.004%ブロモフェノールブルー、0.125MトリスHCl pH 6.8]を、使用直前に10%β-メルカプトエタノールを加えて加える。 警告: β-メルカプトエタノールは、皮膚または眼に腐食性があり、有毒で、飲み込むと危険であり、水生毒性があります。手袋、実験用コート、フェイスシールド、安全メガネを着用して、化学ヒュームフードで取り扱います。環境安全衛生ガイドラインに従って廃棄してください。</li>
		<li>ボルテックスでミックスします。</li>
		<li>サンプルをミニドライバス中で100°Cで5分間加熱する。</li>
		<li>ボルテックスで混合し、サンプルを氷の上に置きます。</li>
		<li>9,400 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。</li>
		<li>SDS-PAGEゲルにロードする前にサンプルを氷上に短時間置くか、-20°Cで長期間保存してください。</li>
	</ol></li>
	<li>4%〜15%プレキャストタンパク質ゲルおよび電気泳動緩衝液35を有する電気泳動細胞を用いてSDS−PAGEを行う。</li>
	<li>使用直前に0%〜20%メタノール(100kDaを超えるタンパク質の場合は0%〜10%、100kDa未満のタンパク質の場合は20%)を添加した転写緩衝液を使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に電気転写する35。</li>
	<li>目的のリンタンパク質の膜およびプローブを遮断する。<ol>
<li>転写後、膜を1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)[20mM Tris、0.137M NaCl、pH 7.6]でウェスタンブロットボックスで5分間洗浄する。</li>
		<li>膜を5 mLのブロッキングバッファー[1x TBS、0.1% Tween 20、5% w/v BSA;よく混合し、ルアーチップ付き10 mLシリンジを使用して0.2 μmの孔を有する25 mmシリンジフィルターでろ過]で1時間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで1時間インキュベートする。 注:牛乳にはリンタンパク質カゼインが含まれており、高い非特異的なバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性があるため、リンタンパク質を特徴付ける際にブロッキング剤として使用しないでください。</li>
		<li>TBS-T[1x TBS, 0.1% Tween 20]で膜を3回ずつ5分間洗浄し、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスに入れます。</li>
		<li>ブロッキングバッファーで希釈した5 mLの一次抗体のメンブレンを、チューブリボルバーを備えた50 mLパドルを用いて50 mL円錐形チューブ中で4°Cで一晩インキュベートする。 注: ウェスタンブロッティングの適切な濃度については、抗体データシートを参照してください。</li>
		<li>TBS-TでRTで3回、それぞれ5分間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで膜を洗浄します。</li>
		<li>膜を、ブロッキングバッファーで希釈した適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体の5mL中で、オービタルシェーカー上で撹拌しながらウェスタンブロットボックス内で1時間インキュベートする。</li>
		<li>オービタルシェーカーで攪拌しながら、ウェスタンブロットボックス内のTBS-Tで膜を5分間3回洗浄する。</li>
		<li>膜を増強化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基質[ボトル1および2から等容量を混合;大型(8.6cm×6.7cm)膜に対してそれぞれ0.5mL]で1分間インキュベートし、膜全体がECLウェスタンブロッティング基質に継続的に曝露されるようにする。</li>
		<li>余分なECLウェスタンブロッティング基板の膜をドレインし、化学発光イメージャーを用いて直ちに現像する。</li>
	</ol></li>
	<li>メンブレンを剥ぎ取り、目的のタンパク質全体を再プローブします。<ol>
<li>PVDF膜を、使用直前に8 μL/mLのβ-メルカプトエタノールを加えた5 mLのストリッピングバッファー[2% SDS、62.5 mM Tris HCl pH 6.8]を含むポリエチレンライニング付きの透明パウチに入れます。</li>
		<li>ハイブリダイゼーションオーブン中で毎分11回転でロッキングしながら、50°Cで30分間インキュベートする。</li>
		<li>TBS-TでRTで3回、それぞれ5分間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで膜を洗浄します。</li>
		<li>上記の手順 5.4.2-5.4.9 に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>ImageJソフトウェアを用いてウェスタンブロットバンド密度を定量し、目的のリン酸化タンパク質のレベルを目的の総タンパク質のレベル36に正規化する。</li>
</ol>

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Chai, Y., Ito, Y., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+and+its+functional+significance+in+regulating+the+fate+of+cranial+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22TheInternational+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+regulating+neural+crest+development+one+phosphate+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).</li>
<li>Xavier, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+receptor+function+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog receptor function during craniofacial development.</a> Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).</li>
<li>Grimsrud, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-6+is+an+autocrine+stimulator+of+chondrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).</li>
<li>MacArthur, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-8+isoforms+activate+receptor+splice+forms+that+are+expressed+in+mesenchymal+regions+of+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development.</a> Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).</li>
<li>Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-8+determines+rostral-caudal+polarity+in+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch.</a> Development. 126 (1), 51-61 (1999).</li>
<li>Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+inactivation+demonstrates+that+FGF8+is+required+for+cell+survival+and+patterning+of+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch.</a> Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).</li>
<li>Tabler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuz+mutant+mice+reveal+shared+mechanisms+between+ciliopathies+and+FGF-related+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes.</a> Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).</li>
<li>Pakvasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+Its+essential+roles+in+bone+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development.</a> Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).</li>
<li>Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-A+and+PDGFR-alpha+regulate+tooth+formation+via+autocrine+mechanism+during+mandibular+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro.</a> Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).</li>
<li>Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDGF+receptor+mutation+in+the+mouse+%28Patch%29+perturbs+the+development+of+a+non-neuronal+subset+of+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells.</a> Development. 115 (1), 133-142 (1992).</li>
<li>Orr-Urtreger, A., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-A+and+its+receptor+are+expressed+in+separate%2C+but+adjacent+cell+layers+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo.</a> Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Pdgfc+gene%3A+dynamic+expression+in+embryonic+tissues+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis.</a> Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 103 (2), 211-225 (2000).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX2-modifying+enzymes%3A+therapeutic+targets+for+bone+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).</li>
<li>Firulli, B. A., Firulli, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+penetrant+cardiac+neural+crest+defects+in+Hand1+Phosphomutant+mice%3A+Dimer+choice+that+is+not+so+critical%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical.</a> Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).</li>
<li>Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+regulates+phosphorylation+and+osteogenic+activity+of+Dlx3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).</li>
<li>Jeong, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+phosphorylates+and+regulates+the+function+of+Dlx5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+kinase+II+regulates+Dlx5+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).</li>
<li>Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+craniofacial+development%3A+From+receptor+signaling+to+transcriptional+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).</li>
<li>Schock, E. N., LaBonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+sox%3A+Diverse+roles+for+sox+transcription+factors+during+neural+crest+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development.</a> Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).</li>
<li>Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srsf3+mediates+alternative+RNA+splicing+downstream+of+PDGFRalpha+signaling+in+the+facial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme.</a> Development. 148 (14), (2021).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+by+reversible+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural crest migration.</a> Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).</li>
<li>Kindberg, A. A., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+boundary+formation+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and boundary formation in craniofacial development.</a> Genesis. 57 (1), 23271(2019).</li>
<li>Faundes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raine+syndrome%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Raine syndrome: an overview.</a> European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
<li>Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+time-lapse+imaging+of+primary+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cells+to+analyze+collective+movement+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/">https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/</a> (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+alteration+of+protein+phosphorylation+during+postmortem%3A+implication+in+the+study+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation.</a> Scientific Reports. 5, 15709(2015).</li>
<li>Sharma, S. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+of+phosphatase+inhibitors+during+Western+blotting+enhances+signal+detection+with+phospho-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies.</a> Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+Western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medicine+%26+Science+in+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research.</a> Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Hooper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+facial+development%3A+contributions+of+ectoderm+and+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme.</a> Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).</li>
<li>Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+contains+a+platelet-derived+transforming+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serum contains a platelet-derived transforming growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).</li>
<li>Swaisgood, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+update+of+casein+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Review and update of casein chemistry.</a> Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+Western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).</li>
<li>Salinovich, O., Montelaro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+staining+and+peptide+mapping+of+proteins+transferred+to+nitrocellulose+after+separation+by+sodium+dodecylsulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

ここで説明するプロトコルにより、研究者は頭蓋顔面発達中の重要なリン酸化依存性シグナル伝達事象を堅牢かつ再現可能な方法でプローブすることができます。このプロトコルには、データの適切な収集と結果の分析を保証するいくつかの重要なステップがあります。マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉細胞からリンタンパク質を単離するかどうかにかかわらず、指示されたときにすべての試薬および材料を氷上に保持しながら、迅速かつ効率的に移動することが不可欠です。氷の低温は細胞内の代謝活性を低下させ、それによってリン酸化タンパク質をホスファターゼ活性38から保護し、高いタンパク質収率を維持する。上顎プロセスの解剖中に3つの別々の10cmペトリ皿を使用することにより、すべての解剖が十分に予冷された組織学PBSで行われることを確実にする。関連して、このタンパク質単離プロトコルの追加的で必須の成分は、すべての溶解緩衝液におけるホスファターゼ阻害剤の使用である。これらの試薬はまた、目的のタンパク質39、40上のリン酸基を保護し...

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。マウスでは、このプロセスは胚期(E)9.5に始まり、前頭鼻突出部および上顎および下顎突起のペアの形成が起こり、それぞれに回遊後頭蓋神経堤細胞が含まれる。側方および内側の鼻プロセスは、鼻孔の出現を伴う前頭鼻突出部から生じ、最終的に融合して鼻孔を形成する。さらに、内側鼻プロセスと上顎プロセスが融合して上唇を生成する。同時に、口蓋形成は、E11.5で上顎突起の口腔側から明確な外生(二次口蓋棚)の形成によって開始される。時間が経つにつれて、口蓋棚は舌の両側で下方に成長し、舌の上の反対の位置に上昇し、最終的に正中線で融合して、E16.51によって鼻腔と口腔を隔てる連続的な口蓋を形成する。
頭蓋顔面発達全体にわたるこれらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始および維持される。例えば、骨形成タンパク質受容体(BMPR)を含む形質転換成長因子(TGF)β受容体のサブファミリー、および種々の受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーなどの細胞膜受容体は、頭蓋神経堤細胞におけるリガンド結合および活性化時に自己リン酸化される2,3,4。.さらに、平滑化されたGタンパク質共役型膜貫通型受容体は、Patched1受容体に結合するソニックヘッジホッグ(SHH)リガンドの下流の頭蓋神経堤細胞および頭蓋顔面外胚葉においてリン酸化され、毛様体膜およびSHH経路活性化5における平滑化蓄積をもたらす。このようなリガンド-受容体相互作用は、頭蓋顔面状況におけるオートクリン、パラクリン、および/またはジュクスタクリンシグナル伝達を介して起こり得る。例えば、BMP6は軟骨細胞分化6中にオートクリン様式でシグナル伝達することが知られており、一方、線維芽細胞増殖因子(FGF)8は咽頭弓外胚葉に発現し、咽頭弓間葉に発現するRTKのFGFファミリーのメンバーにパラクリン様式で結合して咽頭弓7のパターニングおよび外生を開始し、8,9,10。さらに、Notchシグナル伝達は、膜貫通デルタおよび/またはギザギザリガンドが隣接する細胞上の膜貫通Notch受容体に結合し、その後切断およびリン酸化されるときに、傍タクリンシグナル伝達を介して、頭蓋顔面骨格発達中に軟骨細胞および骨芽細胞の両方で活性化される11。しかし、頭蓋顔面発達にとって重要な他のリガンドおよび受容体対は、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達の両方において機能する柔軟性を有する。一例として、マウス歯の形態形成中に、血小板由来成長因子(PDGF)−AAリガンドがオートクリン様式でシグナル伝達し、エナメル器官上皮12中のRTK PDGFRαを活性化することが実証された。対照的に、妊娠中期のマウス顔面突起では、リガンドPDGF-AAおよびPDGF-CCをコードする転写産物が頭蓋顔面外胚葉で発現し、一方、PDGFRα受容体は下層の頭蓋神経堤由来間葉系で発現され、パラクリンシグナル伝達をもたらす13、14、15、16、17.シグナル伝達機構にかかわらず、これらの受容体リン酸化事象は、しばしばアダプタータンパク質および/またはシグナル伝達分子の動員をもたらし、それらはしばしばそれ自体がリン酸化されてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路などの細胞内キナーゼカスケードを開始する18,19。
これらのカスケードの末端細胞内エフェクターは、転写因子、RNA結合、細胞骨格および細胞外マトリックスタンパク質などの基質の配列をリン酸化することができる。Runx220、Hand1 21、Dlx3/5 22、23、24、Gli1-3 25、およびSox9 26は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化された転写因子の1つである。この翻訳後修飾(PTM)は、他の活性の中でも特に、代替PTMに対する感受性、二量体化、安定性、切断、および/またはDNA結合親和性に直接影響し得る20、21、25、26。さらに、RNA結合タンパク質Srsf3は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化され、その核移行をもたらす27。一般に、RNA結合タンパク質のリン酸化は、その細胞内局在化、タンパク質間相互作用、RNA結合、および/または配列特異性に影響を及ぼすことが示されている28。さらに、アクトミオシンのリン酸化は、頭蓋顔面発生29、30全体にわたる細胞骨格再配列をもたらし得、小さなインテグリン結合リガンドN結合型糖タンパク質などの細胞外マトリックスタンパク質のリン酸化は、骨格発生中のバイオミネラリゼーションに寄与する31。上記および他の多くの例を通して、頭蓋顔面発達中のタンパク質リン酸化に幅広い意味合いがあることは明らかである。さらなるレベルの調節を加えると、タンパク質リン酸化はホスファターゼによってさらに調節され、ホスファターゼはリン酸基を除去することによってキナーゼを打ち消す。
受容体レベルとエフェクター分子レベルの両方でのこれらのリン酸化事象は、シグナル伝達経路の伝播にとって重要であり、最終的には核内の遺伝子発現の変化をもたらし、遊走、増殖、生存、分化などの特定の細胞活性を駆動し、哺乳動物の顔の適切な形成をもたらす。キナーゼおよびホスファターゼとのタンパク質相互作用の状況特異性、PTMの結果生じる変化、および細胞活性に対するそれらの影響を考慮すると、これらのパラメータを生理学的に関連する設定で研究することが重要であり、頭蓋顔面発達に対するリン酸化事象の寄与を完全に理解する。ここでは、タンパク質のリン酸化、したがって哺乳類の頭蓋顔面発達中のシグナル伝達経路の活性化を研究するための2つの文脈の例が提供される:マウスの顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉細胞 - 一次32および不死化33の両方.E11.5では、上顎突起は側鼻突起および内側鼻突起1と融合する過程にあり、それによってマウス頭蓋顔面発達中の臨界時点を表す。さらに、口蓋棚に由来する上顎プロセスおよび細胞がここで選択されたのは、後者の構造が前者の誘導体であり、それによって研究者に、関連する文脈においてインビボおよびインビトロでタンパク質リン酸化を調査する機会を提供するからである。しかし、このプロトコルは、代替の顔のプロセスや発達の時点にも適用できます。
リン酸化タンパク質を研究する上で重要な問題は、豊富な環境ホスファターゼによってタンパク質単離中に容易に脱リン酸化されることである。この障壁を克服するために、リン酸化タンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、リン酸化タンパク質の適切な分析と定量のためのベストプラクティスが提供されています。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活動する様々なシグナル伝達経路のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。

<table><tbody>ミニドライバス用<tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Block</td><td>Research Products International Corp</td><td>400783</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab ソフトウェア付き</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>化学発光イメージャー</td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター、エアジャケット</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td>解剖ボード、11 x 13 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動細胞、4ゲル、ミニトランスブロットモジュール付きミニプレキャストゲル用</td><td>Bio-Rad</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Fisher Scientific</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr><td>Mini dry bath</td><td>研究製品International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>長方形のアイスパン、マキシ 9 L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>スタンド付き Stemi 508 実体顕微鏡 K LAB、LED リングライト</td><td>Zeiss</td><td>4350649020000000</td><td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>タイマー</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>チューブリボルバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr><tr><td>ウエスタンブロットボックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9358182</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿、6 cm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート、12ウェル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</</td><td>sub>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ、ポリプロピレン、50mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 ファイン フォーセプス</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>胚スプーン</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、0.5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット、5.75インチ</td> <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット、9 インチ</td> <td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、10 cm</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、35 mm</td><td>フィッシャー サイエン</td>ティフィック <td>FB0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>ポーチ、透明、ポリエチレン ライニング</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メン</td>ブ<td>レン フィッシャー科学</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>セムケン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>小さなラテックス電球、2 mL</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、25 mm、0.2 &mu;m 細孔径</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>09-740-108</td><td></td></tr><tr><td>ルアーチップ付きシリンジ、10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロットカセット開口レバー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann 3MM chr クロマトグラフィーペーパー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15% プレキャストタンパク質ゲル、10ウェル、30 & マイクロ;L</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4561083</td><td></td></tr> <tr><td>β;-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5422-25G</td><td>ストック濃度 1 M</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック試験</td>済み <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>AC403140050</tr><tr><td>完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836153001</td><td>ストック濃度 25x</td></tr><tr><td>DC タンパク質アッセイキット II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7、マウスモノクローナルβチューブリン一次抗体、濃縮物 0.1 mL</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>ECL ウェスタンブロッティング基質</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI32106</td><td>低ピコグラム範囲</td></tr><tr><td>ECL ウェスタンブロッティング基質</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td><td>低フェムトグラム範囲</td></tr><tr><td>電気泳動バッファー、5 L</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610772</td><td>ストック濃度 10x</td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ、1 ガロン</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、Di Na塩二水素。(結晶性POWD./電気泳動。</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、特性評価済み、米国原産、500 mL</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール (認定 ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HRP 標識二次抗体、ヤギ抗マウス IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td><td>1:20,000</td></tr><tr><td>HRP 標識二次抗体、ヤギ抗ウサギIgG</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>111-035-003</td><td>1:20,000</td></tr><tr><td>塩酸溶液、6N (認証)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SA56-500</td><td>HCl</td></tr><tr><td>イゲパル Ca - 630 非イオン性洗剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>ICN19859650</td><td>ノニデット P-40</td></tr><tr><td>イソプロパノール (HPLC)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A451-1</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>25030081</td><td>ストック濃度 200 mM</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) 一次抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9102S</td><td>1:1,000; 抗 Erk1/2</td></tr><tr><td>PDGF-BB 組換えリガンド, ラット</td><td>Fisher Scientific</td><td>520BB050</td><td></td></tr><tr><td>PDGF Receptor &beta; 一次抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169S</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>ストック濃度 100 U/mL、100 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物、99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740100</td><td>PMSF; ストック濃度 100 mM</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) 一次抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9101S</td><td>1:1,000, 抗リン酸化 Erk1/2</td></tr><tr><td>Phospho-PDGF 受容体 & α; /PDGF 受容体 &β; 一次抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3170S</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>塩化カリウム(白色結晶)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP366-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(白色結晶)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP362-500</td><td>KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ</td></tr><tr><td>>SDS溶液、10%</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(結晶性/生物学的、認証)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S671-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム(粉末/認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S299-100</td><td>NaF;1回限りの使用のためのアリコート;ストック濃度1 M</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム、99%</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td></td><td>AC205330500 Na<サブ>3</サブ>VO<サブ>4</サブ>;ストック濃度100 mM</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水ナトリウム(粒状または粉末/認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S374-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Tissue culture PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Transfer buffer, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td>Stock Concentration 10x</td></tr><tr><td>Tris base (白色結晶または結晶性粉末/分子生物学)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BioWorld</td><td>21560033</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロット分子量マーカー</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Female 129S4 mice</td><td></td><td></td><td>フィリップ・ソリアーノ博士、マウントサイナイのアイカーン医科大学からの贈り物</td></tr></tbody></table>

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。これらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始され、維持される。ここでは、哺乳類の頭蓋顔面発達中のタンパク質のリン酸化を研究する生理学的に関連する文脈の2つの例が提供される:マウス顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉間膜細胞。タンパク質単離中の脱リン酸化の一般的な障壁を克服するために、リンタンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング後のリンタンパク質の適切な分析および定量化のためのベストプラクティスが提供される。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活性な様々なリンタンパク質の動態および役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。

マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉系細胞から単離されたタンパク質のリン酸化を特徴付けようとする場合、代表的な結果は、対応する総タンパク質バンドの高さまたはその近くで実行される抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロッティング後の、明確で再現性のあるバンドを理想的に明らかにするであろう(図3).しかしながら、タンパク質の広範なリン酸化が起こる場合、全タンパク質バンドのそれと比較してリンタンパク質バンドのわずかな上方シフトがあり得る。さらに、タンパク質の複数のアイソフォームが組織内に存在し、それぞれがリン酸化されている場合、またはタンパク質が可変的に追加のPTMを受ける場合、抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロットに複数のバンドが現れ得る。目的のリンタンパク質についてシグナルが観察されない場合、目的の全タンパク質が検出されているにもかかわらず、タンパク質が選択されたコンテキストでリン酸化されないか、またはプロトコルに技術的な問題が生じている可能性があります。後者の場合、全細胞溶解物のウェスタンブロッティングを抗ホスホセリン/スレオニンおよび/または抗ホスホチロシン抗...

このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

このプロトコルは、哺乳類の頭蓋顔面発達中に活性なリンタンパク質のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。このプロトコールは、2つの生理学的に関連する文脈、マウス顔面プロセスおよび培養マウス胚性口蓋間葉系細胞からのタンパク質単離中の脱リン酸化の共通の障壁を克服する。すべての試薬と材料を氷上に保持しながら迅速に移動し、リン酸化タンパク質の完全性を維持するためにすべての溶解バッファーにホスファターゼ阻害剤を使用することが不可欠です。まず、腹側を上に向けてマウスの体を解剖ボードの上に置き、マウス腹部に70%エタノールを噴霧します。次に、まっすぐなせんけ鉗子で膣口に前部の皮膚をつまんで持ち上げて腹腔を開きます。次に、持ち上げた皮膚を下層に、直刃の外科用ハサミで両側の45度の角度で切断し、四肢と後肢のほぼ中間のそれぞれの側方面まで伸びるV字型を生成する。Semken鉗子を使用して、子宮角の1つをつかみ、外科用はさみで卵管の下と子宮頸部の上を切る。子宮角の完全な除去を可能にするために、メソメトリウムを切り取り、次いで解剖した子宮角を10センチメートルのペトリ皿中の10ミリリットルの組織学PBSに移す。同様に、腹腔の反対側にある第2の子宮角を除去する。その後、両方の子宮の角が入った10センチのペトリ皿を氷の上に置きます。解剖実体顕微鏡下で、デュモン5個の細かい鉗子で子宮角から各胚を慎重に解剖する。その後、筋層、デシジュア、および絨毛膜をゆっくりと引き離す。次に、胚を囲む比較的透明な羊膜を引き裂いて除去し、胚と胎盤をつなぐ臍帯を切断する。次いで、切断されたプラスチック転写ピペットを用いて氷上の12ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中の組織学PBSの2.5ミリリットルに各解剖胚を移す。10ミリリットルの組織学PBSを含む3つの10センチメートルのペトリ皿を準備し、胚間の回転に使用するためにそれらを氷の上に保管する。次いで、12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルから、切断されたプラスチック転写ピペットを用いて氷上の組織学PBSを用いて10センチメートルのペトリ皿の1つに1つの胚を移す。解剖顕微鏡下で、上顎突起で外鼻突起を隔てる自然のくぼみに沿って、まず1つの上顎突起の前側に切り込みを入れ、細かい鉗子を用いて各上顎突起を顔面から分離する。次に、上顎突起と下顎突起とを隔てる自然のくぼみに沿って上顎突起の後側を切断する。次に、上顎突起の眼側で上顎突起の前側から後側に向かって垂直に切断することによって上顎突起を完全に分離する。2ミリリットルの小さなラテックス電球を備えた9インチパスツールピペットを使用して、約30マイクロリットルの組織学PBSの小さな液滴で解剖された一対の上顎プロセスを氷上のラベル付き35ミリメートルペトリ皿に移す。次いで、一対の上顎プロセス組織を、パスツールピペットを用いて氷上の標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、組織学PBSの移送を最小限に抑えた。さらに、パスツールピペットで1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の過剰な組織像PBSを除去します。氷上での使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した0.1ミリリットルの氷冷NP40溶解緩衝液を加える。その後、200マイクロリットルのピペットマンで10回ピペットを上下させます。次に、10秒間ボルテックスし、気泡の発生を避けながら、200マイクロリットルのピペットマンで10回上下にピペットした。チューブリボルバー付きの1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのパドルを使用してエンドオーバーエンドで回転させながら、摂氏4度で2時間インキュベートします。その後、サンプルを13, 500 x gで摂氏4度で20分間遠心分離し、上清を200ミリリットルのPIPETMANで氷上の新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。まず、真空系に取り付けられた5.75インチパスツールピペットを用いてマウス胚性口蓋間葉系細胞から培地を吸引する。次いで、氷冷した組織培養PBSで細胞を2回洗浄し、最後の洗浄中にプレートを横に傾けて、すべての組織培養PBSが吸引されるようにする。次に、氷上で使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した氷冷NP40溶解バッファーを添加し、細胞を溶解する。プレートを氷上で5分間インキュベートし、プレートを完全にカバーできるように、ほぼ毎分回転させます。次いで、予め冷却されたセルリフターを用いてプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液を氷上の予冷却された1.5ミリリットルの微量遠心管に移した。その後、チューブリボルバーで1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのパドルを使用してエンドオーバーエンドで回転させながら、細胞懸濁液を摂氏4度で30分間インキュベートします。その後、サンプルを13, 500 x gで摂氏4度で20分間遠心分離し、上清を200ミリリットルのPIPETMANで氷上の新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。PDFG-Bリガンドによる刺激を2~15分間行った不死化マウス胚性口蓋間葉系細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、対応する全タンパク質バンドの高さまたはその近くで走るリンタンパク質の明確な再現性バンドが明らかになった。リンタンパク質バンド強度の増加は、未処理の細胞と比較して成長因子で処理すると観察されたが、総タンパク質バンド強度はサンプル間で比較的同等であった。このプロトコルは、摂動およびリン酸化が頭蓋顔面状況における細胞間シグナル伝達、遺伝子発現、および細胞活動に直接どのように影響するかを調べるために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、マウスの脳組織から単離された細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の解析を示しています。このプロセスでは、非パルミトイル化システインを露出させてブロックし、次にパルミトイル化システインに結合するポリマーを使用して、単離されたタンパク質のパルミトイル化状態の評価を支援します。...

マウス脳組織由来細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の評価

胚顔面外胚葉と間充織を分離するためのプロトコルが記載されている。我々は、最初の全体の胚を扱う全体フェイシャルプロミネンスを解剖してから、顔の外胚葉と間充織を分離するためにディスパーゼIIを使用。...

マウス胚性外胚葉顔と間葉の分離

プロテオミクス分析は、液体クロマトグラフィー質量分析(MS)の前にサンプルを分解するために、出発物質の純度と事前分画の両方に大きく依存します。バックフラッシング技術を使用することにより、げっ歯類から純粋な精子を得ることができます。消化後、リン酸化ペプチドはTiO2を使用して濃縮できます。...

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

若い胚性マウス弁におけるタンパク質発現の解析は、利用可能な組織が限られているために妨げられてきました。この原稿は、ウェスタンブロット解析のために、発生中の胚性マウス弁領域からタンパク質を調製するためのプロトコルを提供します。...

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。...

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

このプロトコルは、皮膚ケラチノサイトをマウスモデルから単離し、金属タグ付き抗体で染色し、異なる細胞周期相で目的のタンパク質の発現パターンをプロファイリングするために質量サイトメトリーによって染色された細胞を分析する方法について説明する。...

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。...

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

本プロトコルは、成人マウス口蓋に由来する経口角化細胞の分離および培養について説明する。免疫染色を用いた評価方法も報告されている。...

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。...

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。...

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

学ぶマウス顔面突起と培養口蓋間葉系細胞からリン酸化タンパク質を保持した全細胞タンパク質溶解物の単離法。頭蓋顔面発生におけるリン酸化タンパク質の動態と機能を解析し、細胞内シグナル伝達の分子メカニズムを解明する。

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

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