消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術

当社のプロトコルは、現在使用されている唯一の免疫適格マウスモデルであるGISTの繁殖、維持、解剖、および検体処理について説明しています。今後の研究者には、このマウスモデルをGISTでのトランスレーショナルリサーチに活用していただきたいと考えています。GISTの伝統的な治療法は、チロシンキナーゼ阻害剤による標的分子療法を含む。

このモデルにより、研究者はGISTで免疫療法をテストすることができます。まず、すべての器具を滅菌し、手順全体を通して手袋を着用し、滅菌フィールドを維持します。切開部を70%エタノールで準備する。

はさみを使用して、2センチメートルの正中線垂直切開を行い、腹腔に入る。腹腔内癒着を鋭く溶解する。排水する腸間膜リンパ節を除去するには、盲腸を特定し、その腸間膜を優越的に持ち上げる。

結腸腸間膜の基部のほぼ中間で、腸間膜リンパ節を同定し、それを鋭く解剖する。必要に応じて、リンパ節組織を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。リンパ節組織を単一細胞懸濁液用のRPMI培地の20ミリリットルに入れ、氷上に保つ。

盲腸は、Kit558マウスのGISTによって主に置き換えられる。GISTと盲腸を単離するために、回腸結節を腫瘍の基部から慎重に分割する。次に、盲腸を再び、腫瘍の基部に対して2センチメートル遠位に分割する。

Kit558マウスの50〜60%において、腫瘍の頭部には盲腸組織のキャップが含まれており、これは典型的には漿液を含むが、膿を含むことはめったにない。キャップ組織を腫瘍組織から遠ざけて鋭く解剖する。腫瘍組織と盲腸を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。

単一細胞懸濁液の場合は、腫瘍組織または盲腸を2%FCSでHBSSに入れ、サンプルを覆うのに十分であり、氷の上に保つ。リンパ節検体を含むRPMI培地を100マイクロメートルのフィルターに注ぎます。フィルターを新しい50ミリリットルの円錐形に移動し、リンパ節を3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップします。

フィルターを20ミリリットルのRPMI培地で洗浄します。サンプルを遠心分離し、上清を吸引します。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターに注ぎます。

細胞濾液を採取する。血球計数器を用いて細胞を計数する。サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。

次いで、フローサイトメトリー用のビーズ緩衝液に再懸濁する。テキスト原稿に記載されているようにコラゲナーゼ緩衝液を調製する。滅菌皿にGISTを入れ、2.5ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液を加える。

滅菌メスとはさみを使用して、腫瘍が細かい断片になるまで腫瘍をミンチします。大口径ピペットを使用して、腫瘍とコラゲナーゼを50ミリリットルのチューブに吸引します。摂氏37度で毎分100回転で30分間インキュベートし、次いで2ミリリットルのFBSで反応をクエンチする。

GIST標本を含むコラゲナーゼを100マイクロメートルのフィルターに注ぎ、3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端で腫瘍をマッシュアップし、50ミリリットルのチューブに集める。20ミリリットルのHBSSでフィルターを洗浄します。濾液を450RCFで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てる。

ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、濾液を収集し、血球計数器を使用して細胞を計数する40マイクロメートルフィルターに注ぎます。遠心分離機で上清を吸引し、次いでフローサイトメトリー用のビーズバッファーに再懸濁する。はさみを用いて、盲腸を縦方向に分割し、内粘膜を露出させた。

それを0.5センチメートルのセクションに切断し、5ミリリットルのHBSSと2%FBSを入れた50ミリリットルのチューブに入れます。30秒間激しく振とうし、450RCFで20秒間遠心分離する。その後、上清を捨てる。

5~20ミリリットルのHBSSを2ミリモルのEDTAで加える。摂氏37度で毎分100回転で15分間インキュベートします。遠心分離機で上清を捨て、次いでペレットを5〜20ミリリットルのHBSSに再懸濁する。

混合物を30秒間激しく振とうし、次いで450RCFで20秒間遠心分離し、上清を捨てる。このプロセスをもう一度繰り返します。ペレットを5ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液に再懸濁し、摂氏37度で毎分100回転で30分間インキュベートする。

10分ごとに激しく振とうし、2ミリリットルのFBSで反応を急冷する。100マイクロメートルのフィルターの上に盲腸標本を含むコラゲナーゼを注ぎ、3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップします。フィルターを20ミリリットルのHBSSで洗浄し、ろ液を回収する。

遠心分離機で上清を捨てる。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターに注ぎます。濾液を収集し、血球計数器を用いて細胞を計数する。

遠心分離プロセスをもう一度繰り返し、フローサイトメトリー用のビーズバッファーにペレットを再懸濁します。Kit558マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞のために8ヶ月であった。Kit558マウス由来の腫瘍は、チロシンキナーゼKIT、膜貫通チャネルDog1、および転写因子ETV1を含むGISTの正準マーカーを発現した。

腫瘍は、ヒトGISTを密接に模倣した下流マーカーERKおよびAKTまたは免疫微小環境などのKITシグナル伝達経路の変化について研究された。MRIまたはCTは、腫瘍応答の正確な測定として腫瘍体積を追跡するために使用された。回腸骨接合部から離れ、盲腸キャップから離れて腫瘍を解剖することは、真の腫瘍重量および免疫および分子分析を捕捉するために重要である。

GIST内では、このモデルは腫瘍微小環境の調査と免疫療法を可能にしました。