消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術
May 2nd, 2022
この原稿の目的は、 KitV558Δ/+マウスモデルと、マウス標本の解剖と処理を成功させるための技術を説明することです。
当社のプロトコルは、現在使用されている唯一の免疫適格マウスモデルであるGISTの繁殖、維持、解剖、および検体処理について説明しています。今後の研究者には、このマウスモデルをGISTでのトランスレーショナルリサーチに活用していただきたいと考えています。GISTの伝統的な治療法は、チロシンキナーゼ阻害剤による標的分子療法を含む。
このモデルにより、研究者はGISTで免疫療法をテストすることができます。まず、すべての器具を滅菌し、手順全体を通して手袋を着用し、滅菌フィールドを維持します。切開部を70%エタノールで準備する。
はさみを使用して、2センチメートルの正中線垂直切開を行い、腹腔に入る。腹腔内癒着を鋭く溶解する。排水する腸間膜リンパ節を除去するには、盲腸を特定し、その腸間膜を優越的に持ち上げる。
結腸腸間膜の基部のほぼ中間で、腸間膜リンパ節を同定し、それを鋭く解剖する。必要に応じて、リンパ節組織を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。リンパ節組織を単一細胞懸濁液用のRPMI培地の20ミリリットルに入れ、氷上に保つ。
盲腸は、Kit558マウスのGISTによって主に置き換えられる。GISTと盲腸を単離するために、回腸結節を腫瘍の基部から慎重に分割する。次に、盲腸を再び、腫瘍の基部に対して2センチメートル遠位に分割する。
Kit558マウスの50〜60%において、腫瘍の頭部には盲腸組織のキャップが含まれており、これは典型的には漿液を含むが、膿を含むことはめったにない。キャップ組織を腫瘍組織から遠ざけて鋭く解剖する。腫瘍組織と盲腸を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。
単一細胞懸濁液の場合は、腫瘍組織または盲腸を2%FCSでHBSSに入れ、サンプルを覆うのに十分であり、氷の上に保つ。リンパ節検体を含むRPMI培地を100マイクロメートルのフィルターに注ぎます。フィルターを新しい50ミリリットルの円錐形に移動し、リンパ節を3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップします。
フィルターを20ミリリットルのRPMI培地で洗浄します。サンプルを遠心分離し、上清を吸引します。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターに注ぎます。
細胞濾液を採取する。血球計数器を用いて細胞を計数する。サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。
次いで、フローサイトメトリー用のビーズ緩衝液に再懸濁する。テキスト原稿に記載されているようにコラゲナーゼ緩衝液を調製する。滅菌皿にGISTを入れ、2.5ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液を加える。
滅菌メスとはさみを使用して、腫瘍が細かい断片になるまで腫瘍をミンチします。大口径ピペットを使用して、腫瘍とコラゲナーゼを50ミリリットルのチューブに吸引します。摂氏37度で毎分100回転で30分間インキュベートし、次いで2ミリリットルのFBSで反応をクエンチする。
GIST標本を含むコラゲナーゼを100マイクロメートルのフィルターに注ぎ、3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端で腫瘍をマッシュアップし、50ミリリットルのチューブに集める。20ミリリットルのHBSSでフィルターを洗浄します。濾液を450RCFで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てる。
ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、濾液を収集し、血球計数器を使用して細胞を計数する40マイクロメートルフィルターに注ぎます。遠心分離機で上清を吸引し、次いでフローサイトメトリー用のビーズバッファーに再懸濁する。はさみを用いて、盲腸を縦方向に分割し、内粘膜を露出させた。
それを0.5センチメートルのセクションに切断し、5ミリリットルのHBSSと2%FBSを入れた50ミリリットルのチューブに入れます。30秒間激しく振とうし、450RCFで20秒間遠心分離する。その後、上清を捨てる。
5~20ミリリットルのHBSSを2ミリモルのEDTAで加える。摂氏37度で毎分100回転で15分間インキュベートします。遠心分離機で上清を捨て、次いでペレットを5〜20ミリリットルのHBSSに再懸濁する。
混合物を30秒間激しく振とうし、次いで450RCFで20秒間遠心分離し、上清を捨てる。このプロセスをもう一度繰り返します。ペレットを5ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液に再懸濁し、摂氏37度で毎分100回転で30分間インキュベートする。
10分ごとに激しく振とうし、2ミリリットルのFBSで反応を急冷する。100マイクロメートルのフィルターの上に盲腸標本を含むコラゲナーゼを注ぎ、3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップします。フィルターを20ミリリットルのHBSSで洗浄し、ろ液を回収する。
遠心分離機で上清を捨てる。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターに注ぎます。濾液を収集し、血球計数器を用いて細胞を計数する。
遠心分離プロセスをもう一度繰り返し、フローサイトメトリー用のビーズバッファーにペレットを再懸濁します。Kit558マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞のために8ヶ月であった。Kit558マウス由来の腫瘍は、チロシンキナーゼKIT、膜貫通チャネルDog1、および転写因子ETV1を含むGISTの正準マーカーを発現した。
腫瘍は、ヒトGISTを密接に模倣した下流マーカーERKおよびAKTまたは免疫微小環境などのKITシグナル伝達経路の変化について研究された。MRIまたはCTは、腫瘍応答の正確な測定として腫瘍体積を追跡するために使用された。回腸骨接合部から離れ、盲腸キャップから離れて腫瘍を解剖することは、真の腫瘍重量および免疫および分子分析を捕捉するために重要である。
GIST内では、このモデルは腫瘍微小環境の調査と免疫療法を可能にしました。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この原稿はKit V558Δ/+マウスモデルについて説明し、マウス標本の解剖と処理の成功のための技術を概説しています。このプロトコルは、この免疫能のあるモデルを使用して胃腸間質腫瘍（GIST）のトランレーショナル研究を促進することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- トランレーショナル研究
背景
- Kit V558Δ/+マウスモデルは、現在GISTの唯一の免疫能のあるモデルです。
- GISTの従来の治療法は、標的分子療法を含みます。
- このモデルは免疫療法のテストを可能にします。
- 適切な解剖と標本処理は研究の正確性にとって重要です。
研究の目的
- Kit V558Δ/+マウスモデルの繁殖と維持を説明すること。
- 解剖と標本処理の詳細なプロトコルを提供すること。
- GISTの理解を深め、研究方法を改善すること。
使用された方法
- Kit V558Δ/+マウスモデルの繁殖と維持。
- 器具の滅菌と無菌領域の維持。
- 70%エタノールによる切開部位の準備。
- 詳細な解剖と標本処理技術。
主な結果
- このプロトコルは標本の解剖と処理の成功を保証します。
- 将来の研究でKit V558Δ/+モデルの使用を促進します。
- GISTの免疫療法のテストのための基礎を提供します。
結論
- Kit V558Δ/+マウスモデルはGIST研究のための貴重なツールです。
- 適切な解剖と処理技術は信頼できる結果を得るために不可欠です。
- この研究は将来のGISTのトランレーショナル研究をサポートすることを目的としています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The KitV558Δ/+ genetically engineered mouse model provides an immunocompetent, disease-relevant system for translational research in gastrointestinal stromal tumor (GIST). This model enables rigorous evaluation of both targeted molecular and immune therapies, addressing the limitations of xenograft models and supporting predictive confidence in preclinical oncology pipelines. Its alignment with human GIST histology and immune microenvironment enhances mechanistic de-risking and informs portfolio advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of KIT-driven oncogenic pathways in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by recapitulating human GIST immune infiltrate and histology.
- Facilitates mechanistic de-risking for both molecular and immunologic therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated tumor and lymphoid tissues for downstream molecular and immunologic assays.
- Enables reproducible preparation of single-cell suspensions for flow cytometry and quantitative analysis.
- Supports assay standardization and scalability for compound and immunotherapy screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical findings with human disease biology, enhancing translational biomarker relevance.
- Enables longitudinal imaging and quantitative tumor response assessment via MRI or CT.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapies and targeted agents in GIST.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation for GIST, supporting robust hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and immune microenvironment analysis in KIT-mutant GIST.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for molecular and immunologic assays.
- Analytics: Enables measurement of tumor volume, immune cell populations, and pathway activation markers.
- Translational Research: Provides a platform for biomarker alignment and preclinical efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, immunocompetent model for ongoing GIST research and therapeutic evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in GIST research.
- Operational Value: Standardizes specimen processing and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel GIST therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetically engineered mouse model breeding and maintenance.
- Demands access to sterile surgical instrumentation and advanced imaging modalities.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for integration with diverse molecular and immunologic assay platforms.
- Model lifespan and tumor progression rates must be considered in experimental design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
KitV558Δ/+ Mouse Organ Harvest
2:26
Single-Cell Suspension of Mesenteric Lymph Node
3:09
Single-Cell Suspension of GIST
4:22
Single-Cell Suspension of Cecum
6:06
Results: Investigation of Therapeutics in an Immunocompetent Mouse Model
6:49
Conclusion
