液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩
July 20th, 2022
ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。
液体電子顕微鏡への関心は、ナノスケールのリアルタイムプロセスで視覚化できるようになったため、近年急上昇しています。これらの柔軟な構造に関する知識の向上は、SARS-CoV-2などの新興病原体と戦うための新しい試薬の開発に役立ちます。流動的な環境でタンパク質を見ることは、生物学的システムを模倣するのに役立ち、より動的な方法でタンパク質を見る機会を与えてくれます。
また、この実験では、ガラス質の氷と液体の両方の環境でタンパク質を使用および視覚化する方法に関する新しい技術を紹介します。最近の結果には、液体で画像化された抗体ベースの治療法におけるワクチン候補の動的な洞察が含まれています。相関液体およびクライオEMアプリケーションは、分子動力学を視覚化する能力を向上させ、人間の健康と病気に独自のコンテキストを提供します。
従来のTEMまたはクライオEM技術を採用している読者は、液体EMワークフローを実装して、現在の戦略を補完する方法でサンプルの新しい動的観察を提供することを検討できます。市販の液体EMシステムは、多くのリアルタイムイメージングアプリケーションに不可欠な流量、混合、電気化学的刺激、および温度制御を提供できます。ここで紹介するマイクロチップサンドイッチ法は、in situ実験のためのより複雑な商用システムに飛躍する前に、最初に液体中の試料を見るための簡単なエントリーレベルの方法を示しています。
まず、各チップを150ミリリットルのアセトン中で2分間インキュベートし、続いて150ミリリットルのメタノール中で2分間インキュベートすることにより、窒化ケイ素マイクロチップを洗浄します。層流で切りくずを乾燥させます。アルゴンガスを使用して標準条件下で45秒間動作するグロー放電装置を使用して、乾燥したチップをプラズマ洗浄します。
次に、ドライベースマイクロチップを試料ホルダーの先端に装填し、約0.2マイクロリットルのサンプルをベースチップに加えます。1〜2分間インキュベートした後、サンプルを含むウェットベースチップ上にトップチップを置きます。アセンブリを一緒に植えて、3本の真ちゅう製のネジで機械的に所定の位置に保持された密閉されたエンクロージャを形成します。
ターボポンプ式ドライポンプ場を使用して、先端を10からマイナス6トルまでポンプで送ります。これで、ホルダーをTEMに挿入する準備が整いました。プラズマは、グロー放電装置を使用してマイクロチップとカーボングリッドを45秒間洗浄します。
そして、ゲルパックの上に置かれたグロー放電マイクロチップに約2マイクロリットルのサンプルを加える。ろ紙またはピペットを使用して余分な溶液を取り除き、1〜2分間インキュベートします。次に、グロー放電されたカーボングリッドをサンプルを含む湿ったマイクロチップに追加します。
室温で単一の傾斜試験片ホルダーを使用してアセンブリを一緒に植え、密閉されたエンクロージャを形成します。または、オートローダーグリッドクリップを使用して、サンドイッチアセンブリを下部のCクリップに配置します。上部のクリップをアセンブリの上に置き、標準のクランプツールを使用してアセンブリを一緒にシールします。
これで、試料をTEMに挿入する準備が整いました。低温条件下または室温でオートローダーに入れたサンプルを調べます。液体EMイメージングの場合は、フィールドエミッションガンを備えたTEMに試料ホルダーをロードし、200キロボルトで動作します。
ガンの電源を入れ、ワブラー機能を使用して試料に対する顕微鏡ステージのユーセントリック高さを調整し、カラム内でサンプルをマイナス15度からプラス15度に傾けます。この手順は、サンプルの厚さに合わせてステージをZ方向に調整し、画像記録中に正確な倍率を確保するのに役立ちます。シリアルデータ収集ソフトウェアパッケージを使用して、長いフレームムービーまたは個々の画像として画像を記録し、自動イメージングルーチンを実装します。
低線量条件下で、28, 000倍から92, 000倍の範囲の倍率と毎秒40フレームの画像を取得します。試料へのビーム損傷を最小限に抑えるために露光時間を調整し、指定された倍率でマイナス1〜4マイクロメートルの焦点ずれ範囲を使用します。濃厚な溶液が検出された場合は、より高い焦点ぼけ値を使用するか、別の関心領域を選択します。
気泡が形成されるまでデータ収集に使用されない犠牲領域に電子ビームを集中させることにより、イメージングセッション全体を通して溶液がサンプルに存在することを確認します。RELION-3.0.8プログラムまたはその他の画像処理ソフトウェアを使用して、SARS-CoV-2粒子の動画を分析します。MotionCor2プログラムを使用してモーション補正を実行します。
修正したら、プログラムソフトウェアパッケージの自動ピッキングツールを使用してパーティクルを抽出します。一般的な箱のサイズは、液体試料の場合は330ピクセル、氷試料の場合は350ピクセルです。C1対称性を使用して、プログラムの3D初期モデルルーチンとデータ処理ソフトウェアパッケージのab initioモデルオプションを使用して初期再構成を計算します。
次に、データ処理ソフトウェアで絞り込みプロトコルを実行します。分子構造解析ソフトウェアパッケージを使用して、動的変化を評価しながら結果を確認します。アデノ随伴ウイルスサブタイプ3またはAAVにおける液体EM構造とクライオEM構造の比較を以下に示します。
代表的な画像は、溶液中および氷中のAAVの構造を示しています。液体および氷構造から抽出されたAAV VP1サブユニットの回転図をここに示します。これらの画像は、分子構造解析ソフトウェアのモルフマップ機能を使用して生成された液体構造の動的値を表しています。
複数のウイルス集合体の平均構造は、EMデータを使用して測定されたほぼ5%の直径変化を伴う構造変化を示しています。COVID-19患者の血清画分から分離されたSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリの画像がここに示されています。これらの白い泡は、サンプル中の液体の存在を示しています。
これらのサブウイルスアセンブリのEM再構成は、マップ全体で5ナノメートルスライスの色付き放射密度でここに示されています。代表的な画像は、マイクロチップサンドイッチ技術を使用してガラス質氷中で調製されたロタウイルス二重層粒子の分析を示しています。液体EMイメージングでは、洗剤、グリセロール、ポリエチレン、グリコール、および高レベルの糖の使用を最小限に抑えるか、避ける必要があります。
これらの試薬は、アーティファクトを導入し、ビーム損傷により過度のバブリング、加水分解生成物、およびフリーラジカルを生成する可能性があります。これらのプロトコルを使用することで、科学者は動的プロセスを原子の詳細で研究できるようになります。そして、これは医学、ライフサイエンス、材料研究を含む科学の複数の分野にまたがっています。
ここで紹介するプロトコルでは、最先端のツールが新しい目を通して生体高分子を視覚化するためのエキサイティングな手段をどのように提供できるかを説明しています。液体電子顕微鏡の分野は、人間の健康に脅威を与えるこれらの新しいウイルスの研究方法を向上させ、おそらくパンデミック対策に貢献することさえあります。
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概要
この記事では、液体電子顕微鏡法（liquid-EM）およびクライオ電子顕微鏡法（cryo-EM）解析に適したウイルス組立体の調製プロトコルについて説明します。これらの方法は透過型電子顕微鏡法を用いて詳細な画像化を達成します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 電子顕微鏡法
背景
- ウイルス組立体は様々な生物学的研究において重要な役割を果たします。
- 透過型電子顕微鏡法は高解像度の画像化を可能にします。
- 液体電子顕微鏡法およびクライオ電子顕微鏡法はナノスケール解析の高度な技術です。
- ウイルス構造の理解は治療法開発に役立ちます。
研究目的
- ウイルス組立体の調製のための詳細なプロトコルを提供すること。
- 高度な画像化技術を用いてウイルス構造の理解を深めること。
- ウイルス学および関連分野の研究を促進すること。
使用方法
- ウイルス組立体の調製。
- 液体電子顕微鏡法の適用。
- ナノスケール解析のためのクライオ電子顕微鏡法の利用。
- 画像化のための透過型電子顕微鏡法。
主要な結果
- 電子顕微鏡解析に適したウイルス組立体の成功的な調製。
- ナノスケールでの効果的な画像化技術のデモンストレーション。
- ウイルスの構造的特性への洞察。
- 将来の研究のために複製可能なプロトコル。
結論
- 概説されたプロトコルはウイルス組立体調製の信頼できる方法を提供します。
- 高度な画像化技術は構造解析を大幅に向上させることができます。
- この研究はウイルス構造の広範な理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution liquid-EM and cryo-EM imaging of virus assemblies enables direct visualization of nanoscale dynamics critical for antiviral and vaccine R&D. Integrating dynamic and static structural data enhances predictive confidence in molecular behavior under physiologically relevant conditions. This capability supports risk-adjusted decisions at key inflection points in biologics and vaccine discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of viral assembly dynamics informs mechanistic de-risking and target validation.
- Correlative imaging clarifies conformational flexibility relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Dynamic structural insights support prioritization of candidate targets for further development.
Screening & Assay Development
- Preparation of well-defined virus assemblies enables reproducible assay development for compound screening.
- Quantitative imaging outputs facilitate standardization and benchmarking across screening platforms.
- Dynamic observation of molecular assemblies supports robust evaluation of candidate reagents.
Translational & Preclinical Research
- Imaging in liquid environments provides disease-relevant context for translational biomarker alignment.
- Structural continuity from discovery to preclinical validation is enhanced by correlative EM workflows.
- Dynamic data informs risk-adjusted advancement of vaccine and antibody-based therapies.
Pipeline & Workflow Integration
These imaging protocols bridge early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative assessment of viral assemblies in both static and dynamic states.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through real-time nanoscale visualization.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of conformational changes and structural heterogeneity across conditions.
- Translational Research: Aligns molecular imaging with disease-relevant environments for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable imaging capability for diverse viral and protein assemblies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing dynamic structural evidence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biologics and vaccine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM sample preparation and data analysis software (e.g., RELION, MotionCor2).
- Access to advanced TEM instrumentation with liquid and cryo capabilities is essential.
- Standardization of protocols across teams ensures reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different virus types or protein assemblies.
- Minimizing use of certain reagents (e.g., detergents, glycerol) is critical to avoid imaging artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:43
Loading the Specimen Holder for Liquid-EM
2:47
Production of Microchip Sandwich Assemblies
3:51
Imaging Specimens Using a Transmission Electron Microscope
5:15
Analysis of SARS-CoV-2 Sub-Viral Assemblies in Liquid
6:09
Results: Representative structures of AAV, SARS-CoV-2 Sub-Viral Assemblies and Rotavirus DLPs Prepared in Liquid and Vitreous Ice Using the Microchip Sandwich Technique
7:24
Conclusion
