液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。

液体電子顕微鏡への関心は、ナノスケールのリアルタイムプロセスで視覚化できるようになったため、近年急上昇しています。これらの柔軟な構造に関する知識の向上は、SARS-CoV-2などの新興病原体と戦うための新しい試薬の開発に役立ちます。流動的な環境でタンパク質を見ることは、生物学的システムを模倣するのに役立ち、より動的な方法でタンパク質を見る機会を与えてくれます。

また、この実験では、ガラス質の氷と液体の両方の環境でタンパク質を使用および視覚化する方法に関する新しい技術を紹介します。最近の結果には、液体で画像化された抗体ベースの治療法におけるワクチン候補の動的な洞察が含まれています。相関液体およびクライオEMアプリケーションは、分子動力学を視覚化する能力を向上させ、人間の健康と病気に独自のコンテキストを提供します。

従来のTEMまたはクライオEM技術を採用している読者は、液体EMワークフローを実装して、現在の戦略を補完する方法でサンプルの新しい動的観察を提供することを検討できます。市販の液体EMシステムは、多くのリアルタイムイメージングアプリケーションに不可欠な流量、混合、電気化学的刺激、および温度制御を提供できます。ここで紹介するマイクロチップサンドイッチ法は、in situ実験のためのより複雑な商用システムに飛躍する前に、最初に液体中の試料を見るための簡単なエントリーレベルの方法を示しています。

まず、各チップを150ミリリットルのアセトン中で2分間インキュベートし、続いて150ミリリットルのメタノール中で2分間インキュベートすることにより、窒化ケイ素マイクロチップを洗浄します。層流で切りくずを乾燥させます。アルゴンガスを使用して標準条件下で45秒間動作するグロー放電装置を使用して、乾燥したチップをプラズマ洗浄します。

次に、ドライベースマイクロチップを試料ホルダーの先端に装填し、約0.2マイクロリットルのサンプルをベースチップに加えます。1〜2分間インキュベートした後、サンプルを含むウェットベースチップ上にトップチップを置きます。アセンブリを一緒に植えて、3本の真ちゅう製のネジで機械的に所定の位置に保持された密閉されたエンクロージャを形成します。

ターボポンプ式ドライポンプ場を使用して、先端を10からマイナス6トルまでポンプで送ります。これで、ホルダーをTEMに挿入する準備が整いました。プラズマは、グロー放電装置を使用してマイクロチップとカーボングリッドを45秒間洗浄します。

そして、ゲルパックの上に置かれたグロー放電マイクロチップに約2マイクロリットルのサンプルを加える。ろ紙またはピペットを使用して余分な溶液を取り除き、1〜2分間インキュベートします。次に、グロー放電されたカーボングリッドをサンプルを含む湿ったマイクロチップに追加します。

室温で単一の傾斜試験片ホルダーを使用してアセンブリを一緒に植え、密閉されたエンクロージャを形成します。または、オートローダーグリッドクリップを使用して、サンドイッチアセンブリを下部のCクリップに配置します。上部のクリップをアセンブリの上に置き、標準のクランプツールを使用してアセンブリを一緒にシールします。

これで、試料をTEMに挿入する準備が整いました。低温条件下または室温でオートローダーに入れたサンプルを調べます。液体EMイメージングの場合は、フィールドエミッションガンを備えたTEMに試料ホルダーをロードし、200キロボルトで動作します。

ガンの電源を入れ、ワブラー機能を使用して試料に対する顕微鏡ステージのユーセントリック高さを調整し、カラム内でサンプルをマイナス15度からプラス15度に傾けます。この手順は、サンプルの厚さに合わせてステージをZ方向に調整し、画像記録中に正確な倍率を確保するのに役立ちます。シリアルデータ収集ソフトウェアパッケージを使用して、長いフレームムービーまたは個々の画像として画像を記録し、自動イメージングルーチンを実装します。

低線量条件下で、28, 000倍から92, 000倍の範囲の倍率と毎秒40フレームの画像を取得します。試料へのビーム損傷を最小限に抑えるために露光時間を調整し、指定された倍率でマイナス1〜4マイクロメートルの焦点ずれ範囲を使用します。濃厚な溶液が検出された場合は、より高い焦点ぼけ値を使用するか、別の関心領域を選択します。

気泡が形成されるまでデータ収集に使用されない犠牲領域に電子ビームを集中させることにより、イメージングセッション全体を通して溶液がサンプルに存在することを確認します。RELION-3.0.8プログラムまたはその他の画像処理ソフトウェアを使用して、SARS-CoV-2粒子の動画を分析します。MotionCor2プログラムを使用してモーション補正を実行します。

修正したら、プログラムソフトウェアパッケージの自動ピッキングツールを使用してパーティクルを抽出します。一般的な箱のサイズは、液体試料の場合は330ピクセル、氷試料の場合は350ピクセルです。C1対称性を使用して、プログラムの3D初期モデルルーチンとデータ処理ソフトウェアパッケージのab initioモデルオプションを使用して初期再構成を計算します。

次に、データ処理ソフトウェアで絞り込みプロトコルを実行します。分子構造解析ソフトウェアパッケージを使用して、動的変化を評価しながら結果を確認します。アデノ随伴ウイルスサブタイプ3またはAAVにおける液体EM構造とクライオEM構造の比較を以下に示します。

代表的な画像は、溶液中および氷中のAAVの構造を示しています。液体および氷構造から抽出されたAAV VP1サブユニットの回転図をここに示します。これらの画像は、分子構造解析ソフトウェアのモルフマップ機能を使用して生成された液体構造の動的値を表しています。

複数のウイルス集合体の平均構造は、EMデータを使用して測定されたほぼ5%の直径変化を伴う構造変化を示しています。COVID-19患者の血清画分から分離されたSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリの画像がここに示されています。これらの白い泡は、サンプル中の液体の存在を示しています。

これらのサブウイルスアセンブリのEM再構成は、マップ全体で5ナノメートルスライスの色付き放射密度でここに示されています。代表的な画像は、マイクロチップサンドイッチ技術を使用してガラス質氷中で調製されたロタウイルス二重層粒子の分析を示しています。液体EMイメージングでは、洗剤、グリセロール、ポリエチレン、グリコール、および高レベルの糖の使用を最小限に抑えるか、避ける必要があります。

これらの試薬は、アーティファクトを導入し、ビーム損傷により過度のバブリング、加水分解生成物、およびフリーラジカルを生成する可能性があります。これらのプロトコルを使用することで、科学者は動的プロセスを原子の詳細で研究できるようになります。そして、これは医学、ライフサイエンス、材料研究を含む科学の複数の分野にまたがっています。

ここで紹介するプロトコルでは、最先端のツールが新しい目を通して生体高分子を視覚化するためのエキサイティングな手段をどのように提供できるかを説明しています。液体電子顕微鏡の分野は、人間の健康に脅威を与えるこれらの新しいウイルスの研究方法を向上させ、おそらくパンデミック対策に貢献することさえあります。