Name: カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶ、Caenorhabditis elegansを用いた48種類の細菌分離株のハイスループットスクリーニング法で、酸化熱ストレス耐性を評価し宿主健康への微生物の影響を解明する手法です。

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我々は、寄生虫株を提供してくれたCGCミネソタ州(米国マディソン、NIH - P40 OD010440)と、ここに描かれているすべての環境微生物分離株を提供してくれたOP50およびPr. Hinrich Schulenburg(CAU、キール、ドイツ)に感謝する。この研究は、ABへのUKRI-BBSRC助成金(BB / S017127 / 1)によって資金提供されました。JMは、ランカスター大学FHM博士号奨学金によって資金提供されています。

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著者は開示するものは何もありません。

C. elegansは、その小型、透明性、迅速な開発、短寿命、安価、取り扱いの容易さにより、一度に複数の実験パラメータを迅速にスクリーニングするための多くの利点を提供します。そのかなり単純なゲノム、ボディプラン、神経系、腸、およびマイクロバイオームでありながら、複雑で人間と十分に類似しているため、生物活性の有効性または毒性をテストしながらメカニズムの洞察を得ることができる強力な前臨床モデルになります。疾患8,9,34,35に対する微生物介入の開発への関心が高まっているため、このような前臨床モデルを利用してプロバイオティクスを迅速に調査することは、微生物のほとんど未開発でほぼ無制限の治療の可能性を備えた魅力的な選択肢です34。ここで説明するプロトコルは、環境細菌がC.エレガンスの健康に与える影響を研究す...

人体には、主に腸、皮膚、粘膜環境に見られる推定10〜100兆個の生きた微生物細胞(細菌、古細菌)が生息しています1。健康な状態では、これらはビタミン産生、免疫系の成熟、病原体に対する自然免疫応答および適応免疫応答の刺激、脂肪代謝の調節、ストレス応答の調節など、宿主に利益をもたらし、成長と発達、疾患の発症、および老化に影響を与えます2,3,4,5.腸内細菌叢も生涯を通じてかなり進化します。最も劇的な進化は乳児期と幼児期に起こりますが6、ビフィズス菌の存在量の減少やクロストリジウム、ラクトバチルス、腸内細菌科、 エンテロコッカス種の増加など、年齢とともに大きな変化も起こります7。ライフスタイルは腸内微生物の組成をさらに変化させ、腸内細菌叢症(有益な細菌の喪失、日和見細菌の異常増殖)を引き起こし、炎症性腸疾患、糖尿病、肥満などのさまざまな病状を引き起こす可能性があります5だけでなく、アルツハイマー病やパーキンソン病にも寄与します8,9,10,11。
この認識は、腸生理学(現在はその中の微生物を含む)と神経系の間の相互作用が動物の代謝と生理学的機能の主要な調節因子と考えられている腸脳軸(GBA)の概念の洗練に大きく貢献しています12。しかし、腸脳シグナル伝達における微生物叢の正確な役割とそれに関連する作用機序は完全には理解されていません13。腸内細菌叢が健康的な老化の重要な決定要因であるため、細菌が老化プロセスをどのように調節するかは、激しい研究と論争の対象となっています6,14,15。
回虫Caenorhabditis elegansが、他の種と同様に、バクテロイデス、ファーミキューテス、および放線菌によって優勢な正真正銘の腸内細菌叢を宿主としていることの実証により16,17,18,19,20、宿主と腸の共生相互作用を研究するための実験プラットフォームとしての急速な台頭21,22,23,24、25,26は、調査兵器26,27,28,29を大幅に拡大しました。特に、C.エレガンスが遺伝子-食事、遺伝子-薬物、遺伝子-病原体などの相互作用を研究するために利用できるハイスループット実験アプローチを適応させて、細菌分離株とカクテルがC.エレガンスの健康と老化にどのように影響するかを迅速に調査することができます。
本プロトコルは、健康の代理として C.エレガンスの ストレス耐性への影響についてマルチウェルプレートにセットされた細菌分離株または混合物のアレイを一度にスクリーニングするための実験パイプラインを説明し、プロバイオティクスを同定するために使用することができる。蛍光プレートリーダーを使用した自動ストレス耐性分析のためにワームを処理する前に、大規模なワーム集団を増殖させ、96ウェルおよび384ウェルプレートフォーマットで細菌アレイを処理する方法について詳しく説明します(図1)。このアプローチは、死に至る線虫が死の時間を特定するために使用できる青色蛍光のバーストを生成する死の蛍光31 の現象を利用するラベルフリー自動生存アッセイ(LFASS)30に基づいています。青色蛍光は、 C.エレガンス 腸顆粒(リソソーム関連オルガネラの一種)に貯蔵されたアントラニル酸のグルコシルエステルによって放出され、死亡時に線虫腸内で壊死カスケードがトリガーされると破裂します31。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63860/63860fig01.jpg"> 図1: ストレスに対するC.エレガンスの 耐性に影響を与える細菌分離株のハイスループットスクリーニングのための実験ワークフロー 。 (A)ワームとバクテリアのメンテナンスとアッセイのセットアップのタイムライン。(B)96ウェル細菌プレートアレイのセットアップと取り扱い。(C)384ウェルウォームプレートのセットアップ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63860/63860fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>直径10cmのプレート(通気なし)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10720052</td><td>細菌培養には通気は必要ありません</td></tr><tr><td>直径15cmのプレート(通気)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルの黒く透明な平底プレート</td><td>コーニング</td><td>3712または3762</td><td>高速ストレスアッセイに無菌であることは必須ではありません</td></tr><tr><td>直径6cmのプレート(通気)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>150288</td><td>低酸素</td></tr>症の<tr><td>96ウェル透明プレート(Biolite)</td><td>Thermo</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Agar(<4% 灰分)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102218041</td><td>良質の寒天は、ワームの穴を掘るのを避けるために、培養培地の構造的完全性にとって重要です</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1356</td><td></td></tr><tr><td>アバンティ遠心分離機 J-26 XP</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>ハネウェル</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td> シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5415 R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810 R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>Difco</td><td>240110</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>Invitrogen</td><td>12795084</td><td></td></tr><tr><td>LoBindチップ</td><td>VWR</td><td>732-1488</td><td>Lo-bindは、転送中のワームの損失を低減</td></tr><tr><td>LoBindチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M/1100/53</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー-無限 M nano+</td><td>Tecan</td><td></td><td>モノクロメーターのセットアップにより、蛍光チューニングが可能になりますが、適切なフィルターベースのセットアップを使用することができます</td></tr><tr><td>プレートリーダー-スパーク</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウムモノベーシック</td><td>ハネウェル</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S/3160/63</td><td></td></tr><tr><td>Transillumination Base</td><td>Leica</td><td>MZ6、またはM80</td><td>0.6-0.8倍から40-60倍までの倍率が必要であり、コントラストを調整するための変形可能、滴定可能、またはスライド可能なミラーを備えた高品質の透過照明ベース</td></tr>が必要です <tr><td>t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>透明な接着剤シール Nunc</td><td>Fisher Scientific</td><td>101706871</td><td>透明であり、アッセイに関与する温度に耐えることができることが重要です。</td></tr><tr><td>トリプトファン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1278-7099</td><td></td></tr>酵母<tr><td>抽出物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Caenorhabditis elegansは、サイズが小さく、寿命が短く、遺伝学が容易なため、微生物分離株が宿主生理機能に与える影響を研究するための便利なプラットフォームを提供します。また、死ぬと青色に蛍光を発し、死を特定する便利な手段を提供します。この特性を利用して、ハイスループットラベルフリーのC.エレガンス生存アッセイ(LFASS)を開発しました。これらには、マルチウェルプレートにセットされた線虫集団のタイムラプス蛍光記録が含まれ、そこから集団死亡時間の中央値を導き出すことができます。本研究では、LFASSアプローチを採用して、複数の微生物分離株を一度にスクリーニングし、 C.エレガンス 重度の熱および酸化ストレスに対する感受性。このような微生物スクリーニングパイプラインは、特にプロバイオティクスをプレスクリーニングするために使用でき、宿主の健康の代理として重度のストレス耐性を使用することがここで報告されています。このプロトコルでは、C. elegans腸内細菌叢分離コレクションと同期線虫集団の両方をマルチウェルアレイで増殖させてから、アッセイのためにそれらを組み合わせる方法を説明しています。提供された例は、2つのストレスアッセイを並行して行う2つのワーム株に対する47の細菌分離株と1つの対照株のテストをカバーしています。ただし、アプローチパイプラインは容易に拡張可能であり、他の多くのモダリティのスクリーニングに適用できます。したがって、C.エレガンスの健康に影響を与える生物学的および生化学的条件のマルチパラメトリックランドスケープを迅速に調査するための汎用性の高いセットアップを提供します。

LFASSアッセイは、ストレス耐性や老化に寄与する多数の遺伝的および微生物叢パラメータのスクリーニングなど、複数の試験条件の堅牢でハイスループットかつ迅速なスクリーニングを一度に提供します。実験が複数のテスト条件の広範なデータセットを取得するのに2〜3週間しかかかりません。L4 + 36時間の成体野生型ワーム集団は、48腸内微生物分離株で36時間培養した後、42°Cの熱ストレスと7% t-BHP誘発酸化ストレスにさらされました。アッセイは4回実施され、各条件は各アッセイで4回複製された。テストされたすべての条件にわたって、死亡時間の中央値は、熱ストレスアッセイで40〜130分、 t-BHP誘発酸化ストレスアッセイで90〜240分の間で変化しました。成人期初期の熱ストレスアッセイは、通常、酸化ストレスアッセイよりも一貫性のある結果を示し、日中および日中の変動が少なく、その後の寿命のより良い予測因子です30。異なる微生物食を与えられたワームの死亡時間の中央値の違いは、腸の共生が宿主のストレス耐性にどのように影響するかを決定的に例示しています。 <strong...

腸内微生物は、特定のまたは保存されたメカニズム を介して 宿主の健康にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります。 カエノラブディティスエレガンスは 、そのような微生物をスクリーニングするための便利なプラットフォームです。本プロトコルは、線虫の健康状態の代理として使用される、線虫ストレス耐性への影響についての48の細菌分離株のハイスループットスクリーニングを記載している。

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

このプロトコルでは、48の細菌分離株上の2つのC.elegans株において、C.elegans酸化熱ストレス耐性に影響を与える細菌を並行してスクリーニングする方法について説明しています。このアプローチは用途が広くスケーラブルです。これは、健康に対するC.elegansに影響を与える複数の状態の迅速なスクリーニングを提供し、健康と病気のメカニズムの研究に適用できます。ストレス耐性を健康の代用として使用するこのパイプラインは、線虫変異体、ノックダウン、トランスジェニック、および疾患モデルでの薬物、制吐薬、およびプロバイオティクスの前臨床スクリーニングに容易に適用できます。多くの条件を並行してテストする能力は、関与し、生理学的プロセスに役立つ複雑な相互作用の研究を可能にします。これらには、宿主微生物の相互作用、代謝障害、ストレス処理、および老化が含まれます。全体を通して汚染を避けることが重要です。ワームが食物を使い果たさないようにし、ワームが必要な段階に達したらすぐに重要な手順を実行してください。濃縮大腸菌OP50細菌培養物の調製から始め、1リットルのリゾジェニーブロスボトル4本にそれぞれ2ミリリットルのOP50スターター培養液を接種します。次に、ボトルを摂氏37度と160 Gで6時間振とうインキュベーターに入れ、続いて細菌を3057 Gと摂氏20度で15分間ペレット化します。その後、上清を廃棄し、ペレットを6ミリリットルのOP50培地で再懸濁します。濃縮培養物を滅菌50ミリリットルの円錐管に集める。1株あたり8枚の6センチメートルNGMプレートに、プレートあたり摂氏37度で一晩増殖させた100マイクロリットルの飽和OP50培養液を接種します。その後、プレートを摂氏20度に2日間保管してから使用してください。次に、メスを使用して、最近飢えたNGMプレートからのワームで0.5センチメートルの正方形の寒天チャンクを切り取り、接種された8つの6センチメートルのNGMプレートのそれぞれに移します。これらのプレートを摂氏20度で3日間インキュベートします。次に、P1000ピペットを使用して6センチメートルのNGMプレートに最大3ミリリットルの滅菌Mナインバッファーを加えてワームを再懸濁し、1つの15ミリリットルのコニカルチューブで1株あたり8つのプレートすべてからワーム溶液を回収します。次に、摂氏4度で142倍Gで2分間遠心分離し、P5000ピペットまたは滅菌パスツールピペットまたはチップを備えたウォーターポンプを使用して上清を慎重に除去します。その後、10ミリリットルの滅菌M 9バッファーを加えて、ワームペレットを洗浄します。次に、上清を取り除き、ピペットを使用して濃縮OP50を添加した15センチメートルのOP50接種NGMプレートにワームを移します。直径15センチメートルのNGMプレート上で、摂氏15度で3〜4日間、毎日0.5ミリリットルの濃縮OP50をワームに再給餌することにより、各ワーム株を増殖させます。M nineバッファーを採取して洗浄した後、各ワーム株培養物をより多くのNGMプレートに移し、人口の95%が妊娠した成虫になるまで摂氏20度でワームを繁殖させます。次に、標準的な卵の準備方法に従って妊娠した成虫を漂白し、卵を播種していない2つの15センチメートルのNGMプレートに摂氏15度で24時間移して、すべてのL1幼虫が孵化し、後続のステップで同期して成長できるようにします。まず、6センチメートルのLB寒天プレート上で以前に増殖したすべての細菌塊を収集し、1ミリリットルのMナインバッファーを含むラベル付きの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、細菌ペレットが完全に再懸濁されるまで、マイクロ遠心チューブをボルテックスします。次に、室温で5分間9, 300倍Gでスピンダウンし、700マイクロリットルの上清を除去します。再びボルテックスによって細菌ペレットを再懸濁する。続いて、各細菌懸濁液200マイクロリットルを空の滅菌96ウェルプレートの単一ウェルに移す。このプレートから、マルチチャンネルピペットを使用して8枚の96ウェルNGMアガロースプレートに10マイクロリットルの細菌溶液を接種し、蓋をした状態で摂氏25度で24時間インキュベートします。その後、96ウェルのサスペンションプレートを清潔な粘着天井フィルムで密封し、摂氏15度で最大5日間保管します。まず、プレートを見て、同期したワーム集団の発生段階を評価します。ワームの90%以上がL 4段階に達したら、15ミリリットルの円錐形チューブに最大10ミリリットルの滅菌M 9溶液でワームを収集します。次に、摂氏4度で2分間142倍Gでスピンダウンし、各洗浄の間に10ミリリットルの新鮮な滅菌Mナインを加えてOP50細菌を取り除き、ワームを4回広範囲に洗浄します。その後、上清を除去し、ワームペレットを10ミリリットルのM 9に再懸濁する。50マイクロリットルのワーム溶液を、950マイクロリットルのM nineを含む1.5または2ミリリットルの低表面結合チューブに移します。ワームの沈降を避けるためにチューブの内容物を穏やかに混合した後、濡れた低結合ピペットチップをすばやく使用して、3〜4個の別々の10マイクロリットルの滴をスライドガラスまたはNGMプレートに移します。16倍の倍率の実体顕微鏡下で、ワームの数を数え、3〜4滴のカウントを平均して、ワーム溶液中のマイクロリットルあたりのワームの数を決定します。15ミリリットルの円錐管でワーム濃度をマイクロリットルあたり15ワームに調整します。次に、マルチチャンネルピペットまたはリピートピペットを使用して、8マイクロリットルのワーム溶液を8つの96ウェルNGMアガロースプレートの各ウェルに移します。36時間後、30マイクロリットルのM 9を96ウェルプレートの各ウェルに分注する。次に、低保持チップを使用して、設定されたレイアウトに従ってワームを384ウェルプレートに移し、プレートリーダーが正しくセットアップされていることを確認します。その後、384ウェルプレートにさらにM nineを補充し、熱ストレスアッセイ用に40マイクロリットルのM nineを、TBHP誘発酸化ストレス用に6マイクロリットルのTBHPに34マイクロリットルのM nineを追加することで、ウェルあたり60マイクロリットルの最終容量を目指します。その後、TBHPを追加してから2分以内にアッセイを開始します。次に、透明な蓋でプレートを閉じ、384ウェルプレートの端をマスキングテープで密封し、テープが蓋の上やプレートの下に入らないようにします。次に、プレートをプレートリーダーに挿入します。ピークがノイズと有意に異ならない蛍光値を決定し、蛍光変動が上昇する前に減衰する最も早い時点をメモします。次に、最小蛍光値と最大蛍光値がカーブフィットに使用されると予想される時点に注意してください。その後、蛍光ピークの振幅がウェル間で有意に異なるかどうかを確認します。原稿に記載されている式を使用して、さらに分析する前にデータを正規化します。まず、GitHub から LFASS をダウンロードし、MATLAB を起動して LFASS フォルダーに移動します。次に、画面の指示に従って、コマンドウィンドウにfitフォルダーを入力して実行します。フィットフォルダに入力した後、Excelファイルが配置されているデータフォルダの名前をマイデータとして入力します。次に、現在のプロトコルで連続する測定間の時間間隔に2を入力し、ノイズしきい値を入力します。次に、「0.94」と入力して上側公差しきい値を割り当て、「0.06」と入力して下側公差しきい値を割り当てて、シグモイド適合を拘束します。時間間隔を設定して、最大値と最小値を見つけます。収束フィットを視覚的に検査するには、プロンプトが表示されたときにフィット曲線と滑らかな曲線を表示しない場合は、はいの場合はY、いいえの場合はNを入力します。次に、再調整を試みるための新しい時間境界、下限時間、上限時間境界を指定します。再取り付けを試みる場合は、2 と入力します。ただし、再取り付けを受け入れて次のカーブに進む場合は、ゼロと入力します。ノイズとして識別されたカーブを解析するか、適合不良のカーブを再適合するかを選択するには、Yを入力して承認し、Nを入力して拒否します。残りのすべてのカーブに対して再フィットが試行または拒否されると、プログラムは終了します。結果フォルダーから結果ファイルを取得し、ダウンストリーム分析用にドットXLSXとして保存します。熱および酸化ストレス耐性アッセイは、MYB11またはMYB115細菌分離株または大腸菌OP50対照細菌のいずれかを食べさせたブリストルN2つの野生型ワームに対して実施されました。36時間後、成虫の野生型ワーム集団は、摂氏42度の熱ストレスと7%TBHP誘発酸化ストレスにさらされました。死亡時間の中央値は、熱ストレスアッセイでは40〜130分、酸化ストレスアッセイでは90〜240分の間で変化した。ステップ2.5でワームが増殖し、ステップ2.1に最大2時間かかることを確認するには、ステップ4.6で96ウェルプレートから284ウェルプレートにワームを準備するプレートレイアウトを描きます。ステップは追加または置換できます。例えば、宿主ゲノムワイドRNAスクリーニングまたは細菌遺伝子スクリーニングは、それぞれRNIクローンまたは細菌変異体を腸内細菌分離物に置き換えることによって実施することができる。そのため、現在、このアプローチを使用して、新しいプロバイオティクスを特定し、感染症や老化の文脈で宿主のマイクロ相互作用に関与する遺伝子制御ネットワークを明らかにしています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

液体ベースの培養および調剤のための手順...

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

我々は、使用してプロトコルを記述する...

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

出典: アンダーソン、Q.L. 他。 ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、 Caenorhabditis elegans...

C.エレガンスノックダウンをスクリーニングするためのマルチウェル液体ベースのアッセイ

出典: アリ、I.、 他 カ エノラブディティス・エレガン スの健康に影響を与える微生物分離株のハイスループットスクリーニング。 J. Vis. Exp. (2022年)このビデオでは、 Caenorhabditis elegans...

微生物と寄生虫の相互作用を研究するためのハイスループット蛍光アッセイ

モデル生物Caenorhabditis elegansにおけるミトコンドリア阻害剤の影響のin...

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト...

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

ここで急速に線虫成長メディア寒天、ウェルあたりCaenorhhabditis 線虫の一貫性のある数 96...

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール...

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

定量法は識別し、線虫の表現型プロファイリングを自動的に分析することによって化学物質の急性毒性を予測しました。このプロトコルでは、384 ウェル...

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫...

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

学ぶ、Caenorhabditis elegansを用いた48種類の細菌分離株のハイスループットスクリーニング法で、酸化熱ストレス耐性を評価し宿主健康への微生物の影響を解明する手法です。

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

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