Name: ブロイラーチック胚からの前駆脂肪細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶブロイラーチック胚から前駆脂肪細胞を単離する方法。高生存率と分化能を持つ細胞を取得し、Oil Red O染色で脂肪形成能を評価します。鶏とヒトの両方の研究に応用可能なモデルです。

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著者らは、このプロトコルを支援し最適化してくれたUT AgResearchと動物科学科に感謝する。この作業はUSDAの助成金によって資金提供されました。

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著者らには開示するものは何もありません。

いくつかのよく記載されたプロトコールが前駆脂肪細胞14、15、16、17の単離を報告しているが、胚性前駆脂肪細胞に対する単離は最適化されており、これはブロイラーひよこの初期脂肪の成長および発達の機能分析に使用することができる。このプロトコールは、高い分化能を有する高い生存率胚性脂肪細胞前駆細胞を生じる。さらに、前駆脂肪細胞を単離するための提示された手順は、胚に限定されず、孵化後のひよこにおいて使用することができる。しかし、それはE16胚での使用に最適化されており、孵化後のひよこからの収量は、ひよこが急速に成長するにつれて結合組織の相対量の増加による可能性が高い(表1)。
細胞単離の成功は、最終的に、付着した細胞の形状および数を観察することによって評価される(<strong class="xfig...

肥満は、成人と子供の両方にとって世界的な健康上の脅威です。太りすぎまたは肥満の子供は、成人として肥満になる可能性が約5倍高く、心血管疾患、糖尿病、および他の多くの併存疾患のリスクが著しく高くなります。2〜5歳の米国の子供の約13.4%が肥満1を有しており、過剰な体脂肪を蓄積する傾向が人生の非常に早い段階で動き出すことができることを示している。非常に異なる理由から、過剰な脂肪組織の蓄積はブロイラー(肉型)鶏にとって懸念事項です。現代のブロイラーは信じられないほど効率的ですが、生理学的に必要であるよりも多くの脂質を蓄積します2,3。この傾向は孵化直後に始まり、筋肉の成長から離れて割り当てることによって、最も高価な生産成分である飼料を効果的に無駄にします。したがって、子供とブロイラー鶏の両方にとって、非常に異なる理由にもかかわらず、脂肪組織の発達に影響を与える要因を理解し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する必要があります。
脂肪細胞は、前駆脂肪細胞から形成され、成熟した脂質貯蔵脂肪細胞を発達させるために分化を受ける脂肪組織由来幹細胞である。したがって、インビトロでの脂肪前駆細胞は、肥満研究のための貴重な実験モデルである。これらの細胞は、脂肪デポーの間質血管画分から単離され、脂肪細胞の分化および代謝を制御する分子経路の基本的な理解を提供することができる4、5。ひよこ胚は、卵を所望のスケジュールで培養すると、母親の犠牲を払わずに胚を取得して胚の一連の発生段階を観察できるため、実験操作が容易になるため、発生研究において好ましい実験モデルである。さらに、より大規模な動物モデルと比較して胚を得るために、複雑な外科的処置および長い期間を必要としない。したがって、ひよこ胚は、脂肪組織発達の初期段階から前駆脂肪細胞を得る機会を提供する。皮下脂肪組織は、胚期12日目(E12)の周りのひよこにおいて、大腿部の周囲に位置する明確に定義されたデポーとして見えるようになる。このデポーは、成熟脂肪細胞を形成するための発達の手がかりの下で積極的に分化を受ける高度に増殖性前駆脂肪細胞に富んでいる6,7。脂肪生成分化のプロセスは、ニワトリとヒトの間で同等である。したがって、ひよこ胚から単離された前駆脂肪細胞は、ヒトおよび家禽に関連する研究のための二重目的モデルとして使用することができる。しかし、前駆脂肪細胞の収量は、細胞が成熟脂肪細胞に成長するにつれて加齢とともに低下する5。
本プロトコールは、ブロイラーニワトリ胚において脂肪生成分化および脂肪細胞肥大がピークとなる段階(E16−E18)における脂肪組織からの前駆脂肪細胞の単離を最適化する8。この手順は、鶏の食事療法などの ovoにおいて発達中の胚が曝露される因子が脂肪細胞の発生および エキソビボでの脂肪生成可能性に及ぼす影響を評価することができる。また、脂肪形成に対する様々な操作(例えば、低酸素、栄養素添加、薬理学的アゴニスト、およびアンタゴニスト)または脂肪細胞前駆細胞の様々な'omes(例えば、トランスクリプトーム、メタボローム、メチローム)への影響を試験することもできる。脂肪形成の初期段階の表現として、このプロトコルを使用して得られた細胞は、家禽およびヒトに関連する研究のための貴重なモデルである。

<table><tbody><tr><td>1 mLピペット</td><td>Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>シングルチャンネルピペット、100 - 1000 &micro;L</td></tr><tr><td>1 mL ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL フラスコ</td><td>パイレックス</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353046</td><td>組織培養処理</td></tr>済み<tr><td>96ウェルアッセイプレート</td><td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート、ブラックボトム</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>組織培養処理</td></tr><tr><td>済みアディポレッド</td><td>ロンザ</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップワイパー(キムテックワイパー)</td><td>キンバリークラーク</td><td>34155</td><td></td></tr>ベ<tr><td>タジン</td><td>アップ&アップ</td><td>NDC</td><td>1167300334 20%ワーキングソリューション</td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>コーニング</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー、40&マイクロ;m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>チキン血清</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>円錐形遠心分離管、15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>円錐形遠心分離管、50 mL</td><td>ファルコン</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子、100 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>湾曲した外科用ハサミ、115 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>ミリポア</td><td>SYNSV0000</td><td>必要に応じて</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% ワーキングソリューション</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>蛍光プレートリーダー</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Foil</td><td>Reynolds</td><td></td><td>Reynolds Wrap ヘビーデューティ アルミ ホイル、125 平方フィート</td></tr><tr><td>冷凍容器</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>ミリポア</td><td>4055</td><td>2% ワーキングソリューション</td></tr><tr><td>血球計算量計(計数チャンバー)</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>0.1 mm 深さ</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>器具滅菌器</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>リノール酸-オレイン酸酸-アルブミン</td><td>Σ</td><td>L9655</td><td>1x ワーキングソリューション</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>12チャンネルピペッター、30 - 300 &micro;L</td></tr><tr><td>Na2HPO4Σ</td><td></td> <td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Σ</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッド O</td><td>Σ</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ステプトマイシン (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x Working Solution</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, 60 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Plate Shaker</td><td>VWR</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>ロシュ</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>試薬予約</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>小型ビーカー、100mL</td>パイ<td>レックス</td><td>1000-100</td><td></td></tr>分光<tr><td>光度計プレートリーダーBiotek</td><td></td>シ<td>ナジーH1</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>マッケソン</td><td>762703</td><td></td></tr><tr><td>ストレート鉗子、120mm</td><td>ロボズサージカル</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>ストレートハサミ、140 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Tissue Culture-treated</td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Strainer、250 & micro;m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0.1% Working Solution</td></tr><tr><td>Tweezers, 110 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Bath Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Whatman グレード 1 濾紙</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

ブロイラーチック胚からの前駆脂肪細胞の単離

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞の分化と代謝を制御する分子経路を理解するための貴重な実験系です。ニワトリ胚は、脂肪発生の初期段階から前駆脂肪細胞を単離する機会を提供する。この初代細胞は、前駆脂肪細胞の増殖および脂肪生成分化に影響を及ぼす因子を同定するために使用することができ、小児肥満および家禽における過剰な脂肪沈着の制御に関連する研究のための貴重なモデルとなる。出生後の脂肪組織の急速な成長は、ブロイラー鶏の筋肉成長から離れてそれを割り当てることによって効果的に飼料を無駄にします。したがって、脂肪組織発達の初期段階を理解する方法は、この傾向を調節し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する手がかりを提供する可能性がある。本研究は、市販のブロイラー(肉型)ニワトリ胚の発生脂肪組織から単離された前駆脂肪細胞の単離、初代培養、および脂肪生成分化のための効率的な方法を開発するために設計された。この手順は、高い生存率(〜98%)および成熟脂肪細胞への分化能力の増加を有する細胞を産生するように最適化されている。胚性前駆脂肪細胞の単離、培養、および分化のこの簡単な方法は、早期の脂肪の成長と発達の機能解析をサポートします。

初代前駆脂肪細胞は形態学的に線維芽細胞に類似しており、不規則で星のような形状と中心核を有する(図2A-C)。細胞は組織培養プラスチックに容易に接着し、付着後すぐに増殖し始める。それらは、培地中に脂肪酸を供給されると、脂質滴(図3D)を急速に分化し、蓄積する。ここで表わされる単離物において報告された生存率(色素排除に基づく98%)は典型的である。細胞はかなり堅牢ですが、単離中の積極的な取り扱いは細胞の損傷につながり(図3E)、付着が悪く増殖に失敗する細胞を生成します。微生物汚染を防ぐために組み込まれた手順にもかかわらず、非滅菌材料の移送が起こり得る(図3F)。それらの急速な増殖速度のために、ひよこ胚前駆脂肪細胞は、培地中のグルコースを高い速度で消費する。メディアは、エネルギーの供給を維持するために48時間ごとに交換する必要があります。<...

本プロトコールは、ブロイラー胚における脂肪組織から前駆脂肪細胞を単離するための簡単な方法を記載する。この方法は、高収率での単離、初代培養、および前駆脂肪細胞の脂肪生成分化を可能にする。オイルレッドO染色および脂質/DNA染色は、分化培地で誘導された単離細胞の脂肪生成能力を測定しました。

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞代謝を制御する分子経路を理解するための貴重な実験系である。ニワトリ胚は、脂肪細胞発生の初期段階から前駆脂肪細胞を単離する機会を提供する。この方法は、高い生存率および成熟脂肪細胞への分化能力の増加を有する細胞を産生するように最適化されており、これは、ひよこの初期脂肪成長および発生胚の機能解析に使用することができる。脂肪生成分化のプロセスは、ニワトリとヒトの間で非常に匹敵します。したがって、単離された前駆脂肪細胞は、ヒトおよび家禽に関連する研究のための二重提案モデルとして使用することができる。胚体を70%エタノールで綿棒で拭き取り始める。次いで、消化後の後の工程での濾過中の干渉を防ぐために、滅菌ガーゼで皮膚表面を穏やかにこすり、羽毛を除去した。次に、脚と腹部との間の皮膚を切り取り、一対の大腿骨脂肪貯蔵所を明らかにする。片手で湾曲した鉗子を使用して脚の周りの皮膚を保持し、大腿骨皮下脂肪を優しく除去します。もう一方の手で。その後、湾曲した鉗子を使用して、デポを脚から静かに引き離します。5ミリリットルの収集媒体を含む15ミリリットルのチューブに組織を移し、脂肪パッドの反対側に対して解剖を繰り返す。次に、回収した脂肪パッドを滅菌液を入れた60ミリメートルのシャーレに移し、ディッシュを数回旋回させて短時間すすぎます。次いで、脂肪パッドをPBSを含む60ミリメートルのシャーレに移して滅菌溶液をすすいでください。プレートを静かに渦巻き、もう一度PBSで洗ってください。脂肪組織の消化のために、予め温めた酵素溶液を含む15ミリメートルチューブにそれらを移す。その後、チューブに一対の長いまっすぐなはさみを浸し、最後に溶液中の脂肪組織をできるだけ小さく細かく刻む。ミンチ組織および酵素溶液を25ミリリットルのオートクレーブ処理フラスコに移す。フラスコをパラフィンフィルムで包み、消化のためにフラスコを摂氏37度のオービタルシェーカーインキュベーターに入れます。消化後、軽く上下にピペットでよく混ぜる。その後、ピペッティングによって250マイクロメートルの組織ストレーナーを通して15ミリリットルのチューブに濾過することによって、未消化組織および破片のビットを除去する。次に、フラスコを4ミリリットルの成長培地ですすぎ、細胞懸濁液を同じ15ミリリットルのチューブにろ過して、フラスコに付着した細胞を除去します。次に、成長培地を再度ピペッティングしてストレーナーをすすぎ、フィルターに捕捉された細胞をすべて除去します。室温で5分間300倍Gで遠心分離して細胞画分をペレット化し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引した。ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に穏やかに再懸濁し、ピペッティングによりよく混合し、室温で5分間インキュベートする。次に、細胞を含むチューブに5ミリリットルの成長培地を加えて細胞を希釈し、ピペッティングによって穏やかに混合する。次に、細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーにピペットで固定し、新しい50ミリリットルのチューブにろ過します。次いで、さらに5ミリリットルの成長培地でストレーナーをすすぎ、室温で7分間300倍Gで遠心分離することによって細胞をペレット化する。上清を慎重に吸引する。残りの細胞ペレットをピペッティングにより1ミリリットルの成長培地に再懸濁し、細胞密度および生存率を決定するために、ピペッティングにより各サンプルの10マイクロリットルをトリパンブルーに混合する。混合物の10マイクロリットルを血球計数器にロードし、細胞を数える。24、48、および72時間後の前駆脂肪細胞の分析は、正常な細胞形態および数を示した。前駆脂肪細胞のアジポジェニック誘導は、脂肪滴の急速な分化および蓄積を示した。単離中の前駆脂肪細胞の積極的な取り扱いは、細胞損傷および低い細胞数をもたらした。予防措置を講じているにもかかわらず、微生物汚染を観察することができます。オイルレッドOによる脂質染色は、前駆脂肪細胞が脂肪生成誘因下で脂肪滴を急速に発達し始め、蓄積が24、48、および72時間で観察されるように経時的に進行することを示した。細胞数に対する脂質蓄積を、脂質およびDNA染色剤を用いて定量した。脂質蓄積および細胞増殖の両方が、時間の経過とともに増加した。低い細胞数または損傷した細胞は、組織画分があまりにも長く消化されるときに観察され得る。したがって、1時間半の消化を超えないようにすることをお勧めします。単離された前駆脂肪細胞は、遺伝子発現研究に使用することができる。cDNA合成およびそれに続くqPCRまたはRNAseqに使用するのに十分なRNAを得ることができる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、単離するための方法および培養ウズラやニワトリHH14を提供します...

鳥類胚弁膜前駆細胞の単離と培養

このビデオは、ニワトリの胚からの腫瘍担持性絨毛膜の分離を示しています。収穫されたCAMは、さらなる下流のアプリケーションに使用できます。...

ひよこ絨毛尿膜の収穫:鶏卵から腫瘍移植片含有絨毛膜を単離する方法

細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。...

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離

この報告書は、新生児マウスからの原発性褐色および白色の前突細胞の同時分離のためのプロトコルを記述する。単離された細胞は培養中に増殖させ、完全に成熟した白および褐色のアディポサイトに分化するように誘導することができる。この方法は、培養中の一次脂肪細胞の遺伝的、分子的、機能的特徴付けが可能となる。...

新生児マウスからの白色および褐色の前読細胞の分離と分化

これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。...

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in...

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

ここでは、鳥類の排卵前卵胞で卵黄、顆粒膜細胞、およびテカ細胞を分離するためのプロトコルについて説明します。この精密な取り扱いにより、生殖機能におけるこれらの層の役割に関する重要な調査が可能になり、卵胞の発生、ホルモン調節、および農業収量と生物医学的洞察を向上させるための疾患研究の理解に役立ちます。...

ダウンストリームアプリケーションのための鳥類の排卵前卵胞顆粒膜およびテカ細胞層の分離

発生中にニワトリの胚を見てアクセスすることは困難な場合があります。私たちは、シンプルで費用対効果が高く、教室や研究現場で簡単に使用できるex ovo法を開発しました。この方法は、胚発生の後期段階(HH...

最適化された元OVO開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

学ぶブロイラーチック胚から前駆脂肪細胞を単離する方法。高生存率と分化能を持つ細胞を取得し、Oil Red O染色で脂肪形成能を評価します。鶏とヒトの両方の研究に応用可能なモデルです。

ブロイラーチック胚からの前駆脂肪細胞の単離

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