Name: バルクヒドロゲルの断片化と生物医学的応用のための粒状ヒドロゲルへの加工 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶバルクヒドロゲルの押出し破砕によるマイクロゲル製造法。低コストで簡便なこの技術は、生物医学応用向け粒状ヒドロゲルのイノベーションを促進し、多くの研究室で実装可能です。

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この研究は、UPenn MRSECプログラム(DMR-1720530)および大学院研究フェローシップ(V.G.M.およびM.E.P.へ)および国立衛生研究所(R01AR077362からJ.A.B.)を通じて国立科学財団によって支援されました。

著者らは競合する金銭的利益を持っていない。

本明細書には、押出断片化ミクロゲルおよび遠心分離または真空駆動濾過のいずれかによるパッキングを用いて顆粒状ヒドロゲルを製造する方法が記載されている。他のミクロゲル作製方法(すなわち、マイクロフルイディクス、バッチエマルジョン、エレクトロスプレー、フォトリソグラフィー)と比較して、押出フラグメンテーションミクロゲル作製は非常に迅速で、低コストで、容易にスケーラブルであり、多種多様なヒドロゲル系に順応可能である。さらに、このプロトコルは、バッチ間の変動性を最小限に抑えて高い再現性であり、これは前の作業39で特徴付けられた。
このプロトコルは、ノルボルネン修飾ヒアルロン酸(NorHA)を使用して、光媒介チオールエン反応を使用してバルクヒドロゲルを製造する。NorHAの合成のための詳細な手順は、他の場所38に記載されている。しかしながら、バルクヒドロゲルをシリンジのバレル内に形成することができる場合、多くのヒドロゲル化学は、本明細書に記載の方法を用いて断片化されたミクロゲルを作製するために使用す...

顆粒状ヒドロゲルは、ヒドロゲル粒子(すなわち、ミクロゲル)のパッキングを介して製造され、生物医学的用途のための多くの有利な特性を有する生体材料の刺激的なクラスである1、2、3。その粒子状構造のために、粒状ヒドロゲルは剪断減粘および自己修復性であり、押出印刷(バイオ)インク、埋め込み印刷のための粒状支持体、および注射可能な治療薬4、5、6、7、8、9としての使用を可能にする。さらに、ミクロゲル間の空隙空間は、細胞移動および分子拡散のためのマイクロスケールの多孔性を提供する8、10、11。さらに、複数のミクロゲル集団を単一の製剤に組み合わせて、強化された同調性および材料機能性8、10、12、13を可能にすることができる。これらの重要な特性は、近年の粒状ヒドロゲル開発の急速な拡大を動機付けている。
顆粒状ヒドロゲル製造に向けてミクロゲルを形成するために利用可能な方法の範囲があり、それぞれに独自の長所と短所がある。例えば、ミクロゲルは、しばしば、液滴マイクロフルイディクス4、11、13、14、15、16、17、バッチエマルジョン7、18、19、20、21、22、またはエレクトロスプレー6、23を用いて油中水型エマルジョンから形成され、24,25。これらの方法は、均一な(マイクロ流体)または多分散(バッチエマルジョン、エレクトロスプレー)直径のいずれかを有する球状ミクロゲルを得る。これらの油中水型エマルジョン製造方法には、潜在的に低スループットの生産、低粘度ヒドロゲル前駆体溶液の必要性、およびセットアップのための高いコストとリソースなど、いくつかの制限があります。さらに、これらのプロトコルは、処理ステップを追加する手順を使用してミクロゲルから洗浄しなければならない過酷な油および界面活性剤を必要とする可能性があり、多くのラボでの生物医学的用途のための滅菌条件に変換することは困難であり得る。油中水型エマルジョンの必要性を排除するために、(フォト)リソグラフィーも使用することができ、そこでは、ヒドロゲル前駆体溶液1,26,27からのミクロゲルの硬化を制御するためにモールドまたはフォトマスクが使用される。マイクロ流体学と同様に、これらの方法は生産スループットが制限される可能性があり、これは大量が必要な場合に大きな課題です。
これらの方法の代替として、バルクヒドロゲルの機械的断片化が、不規則なサイズ19、28、29、30、31、32を有するミクロゲルを製造するために用いられてきた。例えば、バルクヒドロゲルを予め形成し、続いてメッシュまたはふるいに通して断片化されたミクロゲルを形成することができ、このプロセスは、ミクロゲル鎖33、34内の細胞の存在下でも行われてきた。バルクヒドロゲルはまた、乳鉢および乳棒による粉砕などの技術を用いて、または市販のブレンダー35、36、37の使用を介して機械的破壊を伴うミクロゲルに加工されている。また、ヒドロゲル形成中の機械的攪拌を用いて、断片化されたミクロゲル(すなわち、流体ゲル)を製造する者もいる31。
本明細書の方法は、これらの機械的断片化技術を拡張し、光架橋性ヒアルロン酸(HA)ヒドロゲルを例として使用して、押出断片化を有するミクロゲルを作製するための単純なアプローチを提示する。押出フラグメンテーションは、シリンジおよび針のみを使用して、広範囲のヒドロゲル19,32に適した低コスト、高スループット、および容易にスケーラブルな方法で断片化されたミクロゲルを作製する。さらに、これらの断片化されたミクロゲルを粒状ヒドロゲルに組み立てる方法は、遠心分離(低パッキング)または真空駆動濾過(高パッキング)のいずれかを用いて記載されている。最後に、これらの断片化された粒状ヒドロゲルの適用が、押出印刷インキとして使用するために議論される。このプロトコルの目標は、多種多様なヒドロゲルに適応可能であり、粒状ヒドロゲルに関心のある事実上あらゆる実験室で実施することができる簡単な方法を導入することである。

<table><tbody><tr><td>15 mLプラスチック円錐形遠心分離機チューブ</td><td>コーニング</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>30 G NTプレミアムシリーズディスペンシングチップ</td><td>Jensen Global</td><td>JG30-0.5HPX</td><td>ここに記載されているカタログ番号は、30 G、0.5インチ針用です。様々なサイズをご用意しております。</td></tr><tr><td>BDディスポーザブルシリンジ(ルアーロックチップ付き)(3 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td>ここに記載されているカタログ番号は3 mLシリンジ用です。さまざまなサイズが利用可能です(14-823-XXX)。</td></tr><tr><td>黒いフォルダー</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジおよびディスペンシングマシンで使用するための使い捨てプローブ針 (18 g、0.5インチ)</td><td>グレインジャー</td><td>5FVH5</td><td>ここに記載されているカタログ番号は、18 G、0.5インチの針用です。様々なサイズをご用意しております。</td></tr><tr><td>シリンジおよび分注機(23 g、0.5インチ)との使用のための使い捨て可能な調査の針 (23 g、0.5 ")</td><td>Grainger</td><td>5FVJ3</td><td></td></tr><tr><td>シリンジおよび分注機械(27 g、1.5 ")</td>との使用のための使い捨て可能な<td></td>プローブ針 <td>Dulbecco</td><td></td></tr><tr><td>のリン酸塩緩衝された生理食塩水</td><td>フィッシャー科学的な</td><td>14190-250</td><td>ここにリストされているカタログ番号は10 x 500 mLのびんの場合のためのものである。</td></tr><tr><td>デュラポアメンブレンフィルター、0.22 &micro;m</td><td>ミリポア</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>マイクロゲルや粒状ハイドロゲルを可視化するために</td></tr><tr><td>エッペンドルフ スナップキャップ マイクロ遠心分離機 セーフロックチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>押出プリンター</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>その他、市販のバイオックスなどの押出プリンターも使用できます。</td></tr><tr><td>フィルターアダプターフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>05-888-107</td><td>ここに記載されているカタログ番号は、複数のサイズのセット用です。各種サイズをご用意しております(05-888-XXX)。</td></tr><tr><td>フィルターフラスコ</td><td>各種ベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン (2 MDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52471</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>各種ベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>国立衛生</td><td></td>研究所<td>「粒子の分析」情報リンク: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html</td></tr><tr><td>ラップトップ</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックチップキャップ</td><td>統合されたディスペンシンg ソリューション</td><td>9991329</td><td></td></tr><tr><td>金属ヘラ</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>最大18,000 x g</td></tr><tr><td>Microscoft Execl</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td>その他のプログラムは、Googleスライドなどの使用することができます。</td></tr><tr><td>OmniCure S2000 スポットUV硬化システム</td><td>Excelitas Technologies</td><td>S2000</td><td>必要に応じて、バルクハイドロゲルの製造に異なる光システムを使用することも可能です。</td></tr><tr><td>固定穴あきプレート付き磁器ブフナー漏斗</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB966C</td><td>カタログ番号ここに記載されているのは、直径56mmのプレート用です。様々なサイズをご用意しております。</td></tr><tr><td>ラジオメーター</td><td>各種ベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repetier Host</td><td>Hot-World GmbH & Co. KG</td><td></td><td>3Dプリンティングソフトウェア</td></tr><tr><td>スクリュー式押出プリンター</td><td>各種ベンダー</td><td></td><td>この研究では、カスタム改造された3D FDMプリンター(Velleman K8200)を使用しました。多くの選択肢があります。</td></tr><tr><td>Solidworks/CADソフトウェア</td><td>Dassault Syst&egrave;mes SolidWorks Corporation</td><td></td><td>BlenderやTinkerCADなどの他のプログラムを使用できます。</td></tr><tr><td>フィルターフラスコを真空ラインに接続するためのチューブ</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVアイプロテクション(つまり、安全メガネ)</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

バルクヒドロゲルの断片化と生物医学的応用のための粒状ヒドロゲルへの加工

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

顆粒状ヒドロゲルは、ヒドロゲル微粒子(すなわち、「ミクロゲル」)の詰まった集合体である。生体材料の分野では、粒状ヒドロゲルは、複数のミクロゲル集団を混合することによる注射性、マイクロスケールの多孔性、および同調性を含む多くの有利な特性を有する。ミクロゲルを製造する方法は、油中水型エマルジョン(例えば、マイクロフルイディクス、バッチエマルジョン、エレクトロスプレー)またはフォトリソグラフィーに依存することが多く、これは資源およびコストの面で高い要求を提示する可能性があり、多くのヒドロゲルと適合しない可能性がある。この研究は、押出断片化を使用してミクロゲルを製造し、それらを生物医学的用途(例えば、3D印刷インク)に有用な粒状ヒドロゲルに加工するための単純でありながら非常に効果的な方法を詳述する。まず、バルクヒドロゲル(例として光架橋性ヒアルロン酸(HA)を使用)を、連続してより小さい直径を有する一連の針を通して押し出し、断片化されたミクロゲルを形成する。このミクロゲル製造技術は、迅速で低コストで、拡張性が高い。遠心分離および真空駆動濾過によってミクロゲルを粒状ヒドロゲルに詰まらせる方法が記載されており、ヒドロゲル安定化のための任意の後架橋を伴う。最後に、断片化されたミクロゲルから製造された顆粒状ヒドロゲルは、押出印刷インキとして実証される。本明細書に記載の実施例は3D印刷に光架橋性HAを使用するが、これらの方法は、多種多様なヒドロゲルタイプおよび生物医学的用途に容易に適応可能である。

これらのプロトコルからの代表的な結果を図 3 および 図6に示す。押出フラグメンテーションにより、直径10~300μmのギザギザの多角形形状のミクロゲルが得られます(図3)。さらに、円形度は0.2(円形ではない)からほぼ1(真円)までの範囲であり、アスペクト比は1〜3の範囲である(図3)。これらのパラメータは、フラグメンテーションプロセスによって形成される不規則でギザギザのミクロゲル形状を記述する。
遠心分離または真空駆動濾過のいずれかを用いて一緒に充填すると、組み立てられた粒状ヒドロゲルは、前の作業39で説明したように、剪断減粘および自己修復である。さらに、断片化された顆粒状ヒドロゲルは、 図6に押出印刷される高さ2cmの中空シリンダーの...

この研究は、押出断片化を伴うミクロゲルを製造し、ミクロゲルを注射可能な顆粒状ヒドロゲルに加工し、顆粒状ヒドロゲルを生物医学的用途のための押出印刷インクとして適用するための、簡単で適応性のある低コストの方法を記述している。

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

粒状ヒドロゲルは、多くの有利な特性を有する刺激的な新しいクラスの生体材料である。私たちの希望は、これらの方法を共有することで、生物医学的用途のための粒状ヒドロゲルへのアクセスと革新を高めることができるということです。この技術は、シンプルで低コストで、多くの化学に容易に適応可能であり、事実上あらゆる実験室で実装することができます。3ミリリットルのシリンジにヒドロゲル前駆体溶液を装填する。空の3ミリリットルのシリンジの背面からプランジャーを取り外し、シリンジバレルの上部にチップキャップを追加します。1,000マイクロリットルのピペットを使用して、ヒドロゲル前駆体溶液をチップキャップ付きのシリンジバレルに移す。ヒドロゲル前駆体溶液を入れたシリンジバレルを片手で持ち、先端キャップを下向きにし、バレルの開放端を上向きにします。シリンジプランジャーをシリンジバレルの背面の開口部に戻します。シリンジバレルの背面の開口部を密閉するのに十分なだけシリンジプランジャーをバレルに静かに押し込み、プランジャーとシリンジバレルを慎重に保持して、シリンジバレルの背面がプランジャーで密閉されるようにします。プランジャーが下を向き、チップキャップが上を向くようにシリンジを反転させます。チップキャップを外し、すべての空気がシリンジから取り除かれるまで、プランジャーをシリンジバレルに静かに押し込みます。先端キャップをシリンジに取り付け直します。ヒドロゲル前駆体溶液がチップキャップ付きの3ミリリットルシリンジ内に固定されていることを確認する。UVランプを点灯させる前に、適切な個人用保護具と安全対策が講じられていることを確認してください。ヒドロゲル前駆体溶液を装填した3ミリリットルのシリンジをUVスポット硬化ランプの下に所望の時間置き、完全に光架橋させる。UVランプを消灯し、シリンジを取り外します。ヒドロゲルがシリンジ内で光架橋されていることを確認します。空の3ミリリットルシリンジの背面からプランジャーを取り外します。先端キャップをルアーロックに固定します。光架橋バルクヒドロゲルを含むシリンジから先端キャップを取り外す。ヒドロゲルシリンジの上部を空のシリンジのバレルの開口部に揃える。バルクヒドロゲルをシリンジ開口部から空のシリンジのバレルに押し出す。押し出されたハイドロゲルを含むシリンジを、先端キャップが下を向き、バレル開口部が上を向くように保持する。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、1.5マイクロリットルのPBSをシリンジバレルに加える。シリンジプランジャーをバレルの開口部に合わせ、シールを作成するのに十分なだけプランジャーをかろうじて押し込みます。プランジャーが下を向き、チップキャップが上を向くようにシリンジを反転させ、プランジャーとシリンジバレルを所定の位置に保持して、ハイドロゲルやPBSが漏れないようにします。断片化したヒドロゲルをPBS添加と混合するために複数回反転させる。先端キャップが上を向き、プランジャーが下を向くようにシリンジを持ちます。先端キャップを取り外します。非常に穏やかに、プランジャーを上に押し上げて、シリンジの内側から空気を取り除きます。断片化されたヒドロゲル溶液を一連の針を通して押し出し、断片化されたミクロゲルを作成する。断片化されたヒドロゲルおよびPBSを含むシリンジの上部に鈍い先端18ゲージ針を固定する。新しい3ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外し、チップキャップを空のシリンジバレルに固定します。断片化したヒドロゲル溶液を18ゲージの針を通して空のシリンジバレルの背面に押し出す。空のシリンジと針を適切な鋭利な廃棄物の流れに捨てます。ヒドロゲル溶液の押し出しを23ゲージ、27ゲージ、および30ゲージ針で繰り返す。最後の押出工程に際し、断片化したミクロゲル溶液を微小遠心チューブに押し出す。断片化されたミクロゲル懸濁液を洗浄して単離する。微量遠心機を用いて、断片化したミクロゲル溶液を5,000倍gで5分間スピンダウンする。ピペットを使用して上清を除去します。断片化したミクロゲルを含む各微量遠心管に1ミリリットルのPBSを加え、5〜10秒間渦巻きます。20マイクロリットルの断片化ミクロゲル懸濁液と180マイクロリットルのPBSを組み合わせて、希薄断片化ミクロゲル懸濁液を作成する。徹底的に混ぜる渦。50マイクロリットルの希薄断片化ミクロゲル懸濁液をガラス顕微鏡スライドに移す。エピ蛍光顕微鏡を使用して、蛍光標識されたミクロゲルの画像を4倍または10倍ズームで取得します。断片化されたミクロゲルを真空駆動濾過を用いてジャムする。真空駆動ろ過装置を組み立ててテストします。フィルターフラスコの内側にブフナー漏斗を固定します。チューブを使用して、フィルターフラスコを真空ラインに接続します。バックナー漏斗カップにメンブレンフィルターを置きます。ダイヤルバルブを開いて真空ラインをオンにします。約0.5ミリリットルのPBSをメンブレンフィルターにピペッティングして接続をテストし、すべてのPBSがフィルターを通過してフィルターフラスコの底に集まることを確認します。真空ラインをオンにして完全なシールを確認した後、断片化されたミクロゲル溶液を渦巻きます。1,000マイクロリットルのピペットを用いて、断片化したミクロゲル溶液をメンブレンフィルター上に移す。真空がミクロゲル溶液からPBSを引き出すまで約30秒間待つ。真空ラインをオフにします。新鮮な3ミリリットルのシリンジを入手し、プランジャーを取り外します。金属ヘラを使用して、断片化された顆粒状ヒドロゲルをフィルターからすくい取り、空のシリンジバレルの背面に移す。プランジャーをシリンジに戻します。断片化された粒状ヒドロゲルをシリンジに装填すると、使用準備が整いました。先端キャップを外し、お好みの針と交換してください。シリンジを選択した印刷プラットフォームにロードします。準備したGコードファイルを計画段階から3D印刷ソフトウェアにロードします。印刷プレビューパネルに移動し、印刷を押します。印刷堆積が完了したらすぐに、断片化された粒状ヒドロゲル構築物をUV光にさらして、光架橋および安定化を行う。押出フラグメンテーションは、直径10〜300マイクロメートルの範囲のギザギザの多角形を有するミクロゲルを生成する。円形度の範囲は 0.2 ~ ほぼ 1 で、アスペクト比の範囲は 1 ~ 3 です。これらのパラメータは、フラグメンテーションプロセスによって形成される不規則でギザギザのミクロゲル形状を記述する。遠心分離または真空駆動ろ過のいずれかを使用して一緒に充填すると、組み立てられた粒状ヒドロゲルは剪断減粘および自己修復性である。断片化された顆粒状ヒドロゲルは、注射用ヒドロゲルに対して高い形状忠実度および機械的完全性を有する。3Dプリンティングに断片化された顆粒状ヒドロゲルを使用することに加えて、これらのシステムは、インビトロ細胞培養プラットフォーム、ならびに組織修復および薬物送達のための注射可能システムとしても使用することができる。これらのシンプルで低コストの方法は、より多くの研究者に粒状ヒドロゲル生体材料の利点をもたらし、粒状ヒドロゲル製造へのアクセスの増加と生体材料分野における革新を可能にします。

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