Name: デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶ デジタル液滴PCRを用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミー測定法。マウス卵母細胞や初期胚細胞などの哺乳類細胞で正確な定量が可能となり、ミトコンドリア機能と疾患研究に広く応用されます。

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液滴生成PCRデータの統計解析に関するアドバイスをくださったL Bozhilova博士に感謝します。図 3C および 図4Bのデータを生成するために使用される卵母細胞を提供してくれたH.Zhang博士に感謝します。この研究は、ケンブリッジ大学の医学研究評議会ミトコンドリア生物学ユニット(MC_UU_00015/9)のSPBによって実施され、PFCが保有するウェルカムトラストプリンシパルリサーチフェローシップ(212219 / Z / 18 / Z)によって資金提供されました。

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<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G%26T-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li>
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<li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li>
<li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).</li>
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<li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative%2C+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).</li>
</ol>

開示する利益相反はありません。

ここで説明するプロトコルは、上記以外にも幅広い細胞タイプおよび種に適用できますが、以前に検証されたプライマー/プローブの組み合わせから離れる際にメソッドの精度と再現性を維持するには、新しいアッセイデザインの慎重な最適化が重要です。単一細胞を扱う場合、得られた結果が個々の細胞の結果を真に反映していることを確認するために、サンプル収集が可能な限り正確に実行されるようにすることが重要です(たとえば、FACSで細胞を選別する際に厳格な単一細胞パラメータを使用するなど)、また、汚染が発生するリスクを減らすために、すべての準備作業がクリーンなPCR前エリアで実行されるようにします。効率的な細胞溶解は、mtDNAコピーを別々の液滴にうまく区分できるようにするためにも重要です。ただし、これは、高濃度の洗剤を使用する場合に液滴の形成を妨げるリスクとバランスをとる必要があります。
アッセイの設計と溶解のステップはプロトコルで最も重要であるため、これらはトラブルシューティングが必要になる可能性が最も高いステップでもあります。陽性および陰性の液滴の十分に分離された集団を最初に生成しないプライマー/プローブ...

哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、ミトコンドリアマトリックスに存在する小さな(約16.5 Kb)環状DNAゲノムであり、2つのrRNA、22のtRNA、および13のタンパク質コード遺伝子で構成される37の遺伝子をコードしています1。細胞ごとに各遺伝子のコピーが1つ(一倍体)または2つ(二倍体)含まれる核ゲノムとは異なり、mtDNAは各細胞のミトコンドリアに複数のコピーとして存在し、数十コピー(成熟精母細胞など)から数十万コピー(卵母細胞など)の範囲で存在します2,3。このマルチコピーの性質の結果、一塩基多型(SNP)、欠失、または重複として存在する可能性のあるmtDNAゲノムの変異が、任意の細胞にさまざまなレベルで存在し、細胞の総mtDNA集団の0%から100%を占める可能性があります。同じ細胞内に野生型および変異型mtDNAゲノムが存在することはヘテロプラスミーと呼ばれ、病原性ヘテロプラズマmtDNA変異はミトコンドリア病の主な原因であり、いくつかの一般的な神経学的症候群が根底にあるヘテロプラスミックmtDNA変異に関連しています4。
ヘテロプラズマmtDNA変異が臨床疾患を引き起こす可能性に寄与する2つの重要なパラメータは、ヘテロプラスミーレベルとmtDNAコピー数です。多くのヘテロプラスミック変異は閾値効果を示し、生化学的および臨床的表現型は特定のヘテロプラスミーレベル(通常は約80%5)を超えてのみ明らかになり、その後、ヘテロプラスミーがさらに増加するにつれて悪化します4。ただし、細胞内に存在するmtDNAのコピー数は、特定のヘテロプラスミーレベルで存在する野生型(つまり「正常」)mtDNAゲノムの数に影響を与えるため、考慮することも重要です。ミトコンドリア病患者を対象とした研究では、ヘテロプラスミーとコピー数5,6の間のこの相互作用の重要性が強調されており、Filogranaらは最近、ミトコンドリア病のマウスモデルで異形質変化にもかかわらず症状を緩和するmtDNAコピー数の増加を報告しました7。
近年、mtDNAヘテロプラスミーによって引き起こされる疾患の病因と伝染の理解を深めるために多くのことが行われていますが、この研究のほとんどは細胞ではなく組織のレベルで行われており、バルク組織生検と血液サンプルから得られた平均組織ヘテロプラスミーレベルとコピー数測定値を比較しています。レーザーキャプチャマイクロダイセクションなどのいくつかの確立された技術は、細胞レベルでのそのような測定を可能にします8,9;しかし、近年のハイスループットシングルセル解析法、いわゆる「シングルセルオミクス」10の爆発的な増加により、これらの重要なmtDNAパラメータをシングルセルレベルで正確に測定できる方法が求められています。
液滴生成PCR法は、マイクロ流体技術の最近の進歩を利用して、サンプルDNA中の特異的標的アンプリコンのPCR増幅を介して未知のDNA濃度を定量する既存の方法を改良する11。サンプルDNAが単一の反応で増幅され、PCR産物の相対蓄積速度が読み出しとして機能するqPCRとは異なり、この方法は最初のサンプルを数千の個々の液滴に分割し、サンプルDNA分子を空間的に分離した反応に区画化します12。その後のPCR反応は個々の液滴で進行し、PCR産物は標的DNAを含む液滴にのみ蓄積します。この反応の結果は、標的DNAおよび増幅PCR産物のコピーを含むか、または標的DNAを含まない液滴のプールの形でデジタル出力される。蛍光DNAプローブまたは二本鎖(ds)DNA結合色素を使用して、増幅産物を含む液滴をカウントし、「陽性」液滴と「陰性」液滴の比率を使用して、初期サンプルに存在したDNAコピーの絶対数を計算できます。qPCR反応から得られる相対的な測定値とは対照的に、この絶対測定は、この方法論を単一細胞のmtDNAコピー数とヘテロプラスミーの正確な測定に使用できる重要な要素であり11、最近のいくつかの研究はすでにこの目的のために液滴生成PCR技術を利用しています13,14.この記事では、ヒトとマウスの両方の組織からの単一細胞におけるmtDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを測定する方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>50% Tween-20 solution</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>自動液滴発生オイル&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1864110</td><td>オイル/液滴エマルジョンの生成に使用される市販のオイル製剤 (プロトコル ステップ 4.1 で使用)</td></tr> <tr><td>ディープウェル ブロック付き C1000 PCR マシン</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1851197</td><td>ディープウェル加熱ブロックを装備した PCR サーモサイクラー、細胞溶解 (プロトコル ステップ 2.1.2) および PCR サイクリング (プロトコル ステップ 5)</td></tr> <tr><td>収集プレート冷却ブロック</td><td>バイオ・ラッド</td><td>12002819</td><td>液滴生成中にサンプルを冷やしておく冷却ブロック(プロトコルステップ4.3で使用)</td></tr><tr><td>ddPCR 96ウェルプレート&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>96 ウェルプレートピペットチップは、QX200 AutoDG 液滴発生器で使用するよう設計されており、サンプル調製 (プロトコルステップ 3.4) および液滴収集 (プロトコルステップ 4.3)</td></tr> <tr><td>ddPCR 液滴リーダーオイル&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>液滴リーダーで使用される市販の油製剤 (プロトコル ステップ 6.1 で使用)</td></tr><tr><td>プローブ用 ddPCR Supermix (dUTP なし)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>プローブを使用した ddPCR 実験で使用するための市販の Supermix (プロトコル ステップ 3.3 で使用)</td></tr><tr><td>DG32 自動液滴発生器カートリッジ&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド バイオ・ラッド</td><td>1864108</td><td>QX200 AutoDG 液滴発生器でオイル/液滴エマルジョンを生成するために使用されるマイクロ流体カートリッジ (プロトコル ステップ 4.3 で使用)</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>適格なウシ胎児血清</td></tr><tr><td>ホイル プレート カバー&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1814040</td><td>液滴生成後に液滴収集プレートを密封するために使用されるホイルプレートカバー (プロトコルステップ4.6で使用)</td></tr><tr><td>HEK 293T細胞</td><td>宝</td><td>632180</td><td>形質転換ヒト胚性腎臓細胞株HEK 293の商業サブクローン、SV40 Large-T抗原</td></tr><tr><td>を発現 HeLa細胞</td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>ヒト子宮頸部上皮癌細胞</td></tr><tr><td>高グルコースDMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4.5g / L D-グルコース、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>ヒトサイブリッド マイアミ</td><td></td><td></td><td></td>大学</tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞&nbsp;</td><td>ニューカッスル大学</td><td>C57Bl/6マウス</td><td></td>から不死化</tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>アンビオン</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCRプレートシール</td><td>ピアス</td><td>SP-0027</td><td>透明な粘着プレートシール、液滴発生前の使用のみ(ホイルシールはステップ4.6で使用する必要があります)</td></tr><tr><td>ピペットチップ廃棄物ビン</td><td>バイオラッド</td><td>1864125</td><td>QX200 AutoDG液滴発生器(プロトコルステップ4.3で使用)で廃棄されたチップを収集するために使用される使い捨て収集ビン</td></tr><tr><td>AutoDGシステム用ピペットチップ&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1864120</td><td>QX200 AutoDG液滴発生器(プロトコルステップ4.3で使用)で使用するために設計されたろ過されたピペットチップ</td></tr> <tr><td>一次ヒト皮膚線維芽細胞</td><td>ニューカッスルバイオバンク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プライマー/プローブ</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>正確なプライマー/プローブ配列はアッセイに依存します。この研究で使用されるプライマーとプローブは、表1に示されています</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK 20 mg / mL溶液</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCRプレートシーラー</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>液滴生成後にddPCRサンプルプレートにホイルシールを適用します(プロトコルステップ4.6で使用)</td></tr><tr><td>QXマネージャーソフトウェア</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>液滴リーダーのセットアップおよび分析ソフトウェア(プロトコルステップ6および7で使用)</td></tr><tr><td>QX200 AutoDG液滴発生器</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>自動マイクロ流体液滴発生器(プロトコルステップ4で使用)</td></tr><tr><td>QX200 液滴リーダー</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>液滴リーダー(プロトコルステップ6で使用)</td></tr><tr><td>Trizmaプリセットクリスタル pH 8.3</td><td>Σ</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアdnaコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、電子伝達鎖の13サブユニットをコードする、小さな環状の二本鎖ミトコンドリア内DNA分子です。二倍体核ゲノムとは異なり、ほとんどの細胞にはmtDNAのコピーが多く含まれており、細胞の種類に応じて100コピー未満から200,000コピーを超える範囲です。MtDNAコピー数は、多くの加齢に伴う変性状態や疾患のバイオマーカーとしてますます使用されているため、mtDNAコピー数の正確な測定は、研究と診断の両方の設定において重要なツールになりつつあります。mtDNAの変異は、一塩基多型(SNP)または欠失として発生することが多く、細胞内のmtDNAのすべてのコピーに存在するか(ホモプラスミーと呼ばれる)、変異したmtDNAコピーとWTmtDNAコピーの混合物として存在する可能性があります(ヘテロプラスミーと呼ばれます)。ヘテロプラズマmtDNA変異は、希少疾患またはパーキンソン病などの一般的な遅発性疾患の増加のいずれかにおいて、臨床ミトコンドリア病理の主な原因です。細胞内に存在するヘテロプラスミーのレベルを決定することは、まれなミトコンドリア病の診断およびミトコンドリアが役割を果たす可能性のある一般的な遅発性疾患を理解することを目的とした研究において重要なステップです。MtDNAコピー数とヘテロプラスミーは、従来、定量的(q)PCRベースのアッセイまたはディープシーケンシングによって測定されてきました。しかし、ddPCR技術の最近の導入は、両方のパラメータを測定するための代替方法を提供しました。絶対mtDNAコピー数を測定する能力や、低いコピー数でも単一細胞から正確な測定を行うのに十分な感度など、既存の方法に比べていくつかの利点があります。ここでは、ddPCRを使用した単一細胞のmtDNAコピー数の測定を説明する詳細なプロトコル(以下、液滴生成PCRと呼びます)と、mtDNA欠失のある細胞のヘテロプラスミーを同時に測定するオプションを紹介します。mtDNA SNPを有する細胞のヘテロプラスミーを測定するためにこの方法を拡張する可能性についても議論されています。

液滴の生成後、各ウェルの油相の上に透明な液滴の透明な層が浮かんでいるのが見えます(図1B)。液滴形成は、単一細胞で実験を行う際の投入ライセート中の界面活性剤の存在によって悪影響を受ける可能性があります。2.1.2.に記載されている溶解プロトコルを使用すると、最終サンプルに少量のTWEEN-20が残っているにもかかわらず、推奨レベルの10,000を超える液滴収率が日常的に達成されます(図1C)。しかし、バッファーRLT Plusなどの他の溶解バッファーでは、形成される液滴の数が劇的に減少し(図1C)、コピー数測定の精度に悪影響を与える可能性があります。
PCRと液滴の読み取りに続いて、各サンプルウェルに使用される各チャネルで陽性と陰性の液滴の明確に分離された集団が見られ(図2A)、NTCウェルには陰性の液滴のみが含まれています。結果の分析時に発生す...

ここでは、単一細胞における絶対ミトコンドリア(mt)DNAコピー数とmtDNA欠失ヘテロプラスミーレベルを測定するためのプロトコルを紹介します。

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

このプロトコルは、個々の細胞に存在するミトコンドリアDNAのコピー数と特定のタイプのミトコンドリアDNA変異のレベルを正確に測定するために使用できます。以前の方法では、多くの細胞を含む組織サンプルでこれらの測定を正確に行うことができました。この手法の主な利点は、単一セルで同じ測定を行うことができることです。この方法は、ミトコンドリアを研究する人に特に有用であり、この分野で幅広い用途があります。単一細胞の効果的な単離と溶解は、この技術の鍵です。シングルセルソーティングの経験は非常に役立ちます。まず、本文に記載されているように、氷上でサンプルDNAを使用せずにPCR用のマスターミックスを準備します。短時間ボルテックスした後、調製したマスターミックスの必要量を液滴生成PCR96ウェルプレートの各ウェルに分配し、サンプルをフルカラムに配置する。次に、マスターミックスを不完全な列の空のウェルに追加して、テンプレート以外のコントロールとして使用します。次に、入力DNAを各ウェルに追加して、各ウェルの総容量を22マイクロリットルにします。プレートを粘着プレートシールで密封し、2000RPMで1分間シェーカーに置きます。次に、プレートを摂氏4度で1分間1000倍Gで遠心分離してから、氷上に置きます。液滴を生成するには、まず液滴発生器の電源がオンになっていることを確認し、液滴発生オイルのボトルが計器デッキの位置Eにロードされているかどうかを確認します。次に、タッチスクリーンの[サンプルプレートの構成]をクリックします。サンプルまたはブランクを含むサンプルプレートのすべての列を選択したら、[OK]をクリックしてプレートの構成を確認します。次に、液滴発生器カートリッジを計器デッキのBの位置Bにロードして、すべてのライトが緑色に変わるようにし、空のチップ廃棄物トラフを位置Cに配置します。次に、サンプルプレートを計器デッキの位置Fにロードする前に粘着シールを取り外して、ライトが緑色に変わるようにします。また、空の液滴コレクション96ウェルプレートを、摂氏マイナス20度で予め冷却された位置Gのクールブロックに入れ、ライトが緑色に変わるようにロードします。機器のタッチスクリーンで[液滴生成の開始]をクリックすると、液滴発生器の蓋が自動的に閉じます。液滴の生成が完了したら、サンプル収集プレートを目視で確認して、液滴エマルジョン層が各ウェルの油相の上に存在することを確認します。次に、プレートシーラーの電源を入れ、温度を摂氏180度に設定し、シール時間を5秒に設定します。機械が動作温度に達するまで待ちます。次に、サンプル収集プレートをプレートシーラーのプレートホルダーに置き、赤い線を上に向けてプレートの上部に新しいホイルシールを置きます。プレートシーラーが動作温度に達したら、機器のタッチスクリーンでイジェクトを押します。プレートホルダーをプレートシーラーの引き出しに入れた後、シールを押して引き出しを閉じます。シーリングが完了すると、引き出しが自動的に開きます。密封されたプレートを取り外し、コールドブロックの上に置きます。次に、プレートシーラーをオフにします。PCRを実行するには、密封された液滴収集プレートを96ディープウェルブロックを備えたPCRマシンに入れます。PCRが完了したら、ドロップレットリーダーと接続されているコンピューターの電源を入れます。PCR後のサンプルを含むプレートをドロップレットリーダープレートホルダーにロードします。サンプルプレートのホイル蓋をしたまま、カバーをホルダーの上部に置き、黒いロッククリップで所定の位置に固定します。次に、ドロップレットリーダーの蓋を開くには、開閉ボタンを押します。次に、サンプルプレート付きのドロップレットリーダープレートホルダーをリーダーチャンバーにロードし、磁気ベースにしっかりと置きます。もう一度開閉ボタンを押して蓋を閉じます。解析ソフトウェアインターフェースを開きます。[プレートの追加] タブを選択し、[プレートの追加]、[プレートの構成] の順にクリックします。[プレート情報]タブで、プレート名を入力し、[Supermix]ドロップダウンメニューから[プローブ用Supermix]、[DUTPなし]を選択し、[ウェル選択]タブ As.In[データファイルの保存]にファイル名を入力し、分析するウェルをハイライト表示して、[選択したウェルを含める]をクリックします。次に、[井戸情報]タブで、注釈を付ける井戸を選択します。[実験タイプ]ドロップダウンメニューから[直接定量]を選択します。次に、サンプルの説明、サンプルタイプ、ターゲット名ボックスに入力し、必要に応じてウェルノートやプレートノートを追加します。次に、[適用] をクリックします。プレートの構成が完了したら、[実行の開始] をクリックします。結果分析を行うには、[データ分析]タブを選択し、[マイデータファイル]メニューから分析するファイルを開きます。次に、単色実験の場合は「1D 振幅」タブ、2 色実験の場合は「2D 振幅」タブをクリックします。次に、閾値化が必要なウェルを選択します。しきい値ラインモードツールを使用して、振幅プロット上の正と負の集団の間の空きスペースにしきい値を手動で適用し、4つの液滴集団が明確に分離されるように十字線が配置されるようにします。すべてのサンプルにしきい値が適用されたら、[データ テーブル] タブの [インポート/エクスポート] をクリックし、[表示データを CSV にエクスポート] を選択して、結果を csv ファイルとしてエクスポートし、さらに分析します。適切なファイル名を入力し、[保存] をクリックします。このプロトコルで使用されたPCRおよび液滴読み取り手順は、ファムチャネルとヘキサチャネルの両方で、陽性および陰性の液滴の明確に分離された集団の存在を示しました。両方のプローブに対して陽性のミトコンドリアDNA集団も、単一細胞溶解物と区別することができた。この方法はまた、ミトコンドリアDNAに欠失を有する試料について、二重陽性の液滴およびDNAの非欠失部分のみについて陽性の液滴の混合集団が存在することを示した。この方法は、マウス卵母細胞や初代マウス胚細胞を含むさまざまな哺乳類細胞の細胞あたりのミトコンドリアDNAコピー数をカウントするために成功裏に使用されています。さらに、高欠失ヘテロプラスミーを有する細胞では、単一プローブに対して陽性の集団は、二重陽性集団よりも有意に大きいことがわかった。しかし、低欠失ヘテロプラスミーを有する細胞では、両方の集団は同様のサイズであった。したがって、正確な結果は、液滴の生成が成功し、1Dまたは2D振幅ビューを使用して閾値が適切に適用されていることを常に保証します。未使用のライセートは、一塩基多型ヘテロプラスミーを測定できるパイロシークエンシングなどの他のシングルセルアッセイに使用できます。この技術の開発により、これまで不可能だった個々の細胞のミトコンドリアDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを正確に測定できるようになりました。

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JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、デジタルポリメラーゼ連鎖反応またはdPCRによって標的核酸を検出するための乳化ナノ液滴を生成する手順を段階的に紹介します。...

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction:希少腫瘍変異検出のためのナノDroplet PCR反応作製法

このビデオでは、デュプレックスデジタルPCR(ddPCR)技術を示しています。これは、従来のPCR技術の修正版で、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に検出するのに役立ちます。1つのPCR反応をナノリットルサイズの乳化液滴に分割し、それぞれに増幅し、液滴画分から異なる色の蛍光増幅シグナルを検出することで、標的配列の初期濃度を算出します。...

デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

このビデオは、臨床診断と予後の早期バイオマーカーとして、異なる白血球集団のメチル化DNA領域を同時に定量するためのマルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応技術を示しています。...

白血球におけるDNAメチル化を検出するためのマルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応

色素ベースの化学および液滴デジタルPCR技術を使用した無細胞マイクロRNA定量のための高感度で正確な方法が説明されています。...

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

ここで同時に量的に従うメソッドとアルカリ加水分解とその後 5´ エンド ゲノム DNA の酵素の開裂を組み合わせて単一ヌクレオチド分解能で高度そのまま DNA...

同時マッピングとヒトのミトコンドリア DNA のリボヌクレオチドの定量

ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA...

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。...

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

パイロシーケンシングアッセイは、ヘテロプラズマ細胞または組織におけるミトコンドリアDNA一塩基多型の堅牢かつ迅速なジェノタイピングを可能にします。...

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング

mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。...

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

本研究は、土壌微生物バイオマスおよび菌類と細菌の比率を定量化するための迅速なddPCR法を提示します。ddPCR由来の微生物バイオマス炭素はクロロホルム燻蒸推定値との相関は弱いものの、追加の土壌サンプリングや厳しい手法を用いずに微生物の存在量を評価するための感度が高くスケーラブルな分子アプローチを提供します。...

デジタルドロップレットPCR(ddPCR)を用いた土壌中の微生物バイオマスの測定

学ぶ デジタル液滴PCRを用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミー測定法。マウス卵母細胞や初期胚細胞などの哺乳類細胞で正確な定量が可能となり、ミトコンドリア機能と疾患研究に広く応用されます。

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

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