Name: 若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶリボンシナプスの免疫標識と計数法。若年および高齢スナネズミ蝸牛を用いて、加齢に伴う聴覚機能のシナプス変性を定量的に評価する手法を解説。自動蛍光消去技術も含む。

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著者らは、Lichun Zhangがイメージング施設の使用のために、この方法とOldenburgのCarl von Ossietzky University of Oldenburgの蛍光顕微鏡サービスユニットの確立を支援したことを認めている。この研究は、ドイツの卓越性戦略-EXC 2177/1の下でドイツ研究財団(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました。

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
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著者は宣言する利益相反を持っていません。

このプロトコールに概説されている方法を用いると、若年成人および高齢のスナネズミ由来の蝸牛におけるIHCおよびシナプス構造を免疫標識し、シナプス前およびシナプス後要素の共局在化によって推定された機能的シナプスを同定し、それらを個々のIHCに割り当て、それらの数、体積、および位置を定量することができる。このアプローチで用いた抗体はまた、外側有毛細胞(OHC;myoVIIa)およびそれらのシナプス前リボンを標識した。さらに、IHCsとOHCの両方の免疫標識のための実行可能な代替手段は、オトフェリンに対する抗体であり、OHCはIHCよりもはるかに薄く見える。
灌流は、2つの異なるセットアップを使用して行うことができる。1) 市販のドリップラインに給餌する単一のボトルを、動物の約1.5m上のプーリーホイールに吊り下げる重力給餌ドリップラインシステム。流体は、上部で開いているボトルを下げた後に連続して導入される。2)デジタル可変速ペリスタルティックポンプを用いたシステムであって、一方の端に細くて長いチューブを開いて流体を取り込み、もう一方の端に簡単に取り付けることができる針を備えたシステム。ど...

加齢性難聴は、65歳以上の世界人口の3分の1以上が罹患する世界で最も普及している疾患の1つです1。根本的な原因はまだ議論中であり、積極的に調査中ですが、内部有毛細胞(IHC)と求心性聴覚神経線維2をつなぐ特殊なシナプスの喪失が含まれる可能性があります。これらのリボンシナプスは、神経伝達物質グルタミン酸で満たされた小胞がそれにつながれたシナプス前構造、ならびにシナプス後α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)グルタミン酸受容体3,4,5を含む。スナネズミでは、〜20個の求心性聴覚神経線維が1つのIHC6、7、8に接触する。モディオラスに面したIHC上の線維は大きなシナプスリボンに対向し、IHCの柱側で接続する線維は小さなシナプスリボンに対向している(すなわち、ネコ9、スナネズミ7、モルモット10、およびマウス3、11、12、13、14)。さらに、スナネズミでは、シナプス前リボンおよびシナプス後グルタミン酸パッチのサイズは正の相関がある7,14。IHCのモディオラー側の大きなリボンに対向する繊維は口径が小さく、自発速度が低く、閾値が高い15。低自発速度繊維は、IHCs15の柱側に位置する高自発的低閾値繊維よりも、騒音曝露10および耳毒性薬物16に対してより脆弱であるという証拠がある。
リボンシナプスの喪失は、蝸牛神経加齢性難聴における最も初期の変性事象であるが、螺旋状神経節細胞およびその求心性聴覚神経線維の喪失は17,18に遅れをとっている。電気生理学的相関は、聴覚脳幹応答17および化合物活動電位8の記録を含み;しかし、これらはシナプス損失の微妙さを反映していない、なぜなら低い自発速度繊維はこれらの尺度に寄与しないからである16。より有望な電気生理学的測定基準は、質量電位誘導神経指数19および刺激周囲時間応答20である。しかしながら、これらは、動物が聴覚神経線維喪失を超えて、残りの聴覚神経線維8の活動に影響を及ぼす他の蝸牛病理を有していない場合にのみ信頼できる。さらに、スナネズミにおける行動学的に評価された閾値は、シナプス数21と相関していなかった。したがって、生存しているリボンシナプスの信頼できる定量化、したがって、機能的な聴覚神経線維の数は、蝸牛組織の直接検査によってのみ可能である。
モンゴルのスナネズミ(Meriones unguiculatus)は、加齢性難聴を研究するのに適した動物モデルです。それは短い寿命を有し、ヒトに似た低周波聴力を有し、維持が容易であり、加齢性難聴に関連するヒト病理との類似性を示す2,22,23,24。スナネズミは、生後36ヶ月に達すると老化したとみなされ、平均寿命の終わり近くになります22。重要なことに、リボンシナプスの加齢に伴う喪失は、静かな環境で飼育され老化したスナネズミで実証されている8,21。
ここでは、若年成人から加齢までの異なる年齢のスナネズミからの蝸牛を免疫標識、解剖、および分析するためのプロトコールが提示される。シナプス前部(CtBP2)、シナプス後グルタミン酸受容体パッチ(GluA2)、およびIHC(myoVIIa)の成分に対する抗体が使用される。老化した蝸牛のバックグラウンドを減少させ、蛍光シグナルをそのまま残す自己蛍光消光剤が適用されます。また、感覚上皮と線条体血管の両方を調べるために蝸牛を解剖する方法について説明する。蝸牛の長さは、特定の最良の周波数25に対応する別個の蝸牛位置の選択を可能にするために測定される。シナプス数の定量化は、自由に入手可能なソフトウェアImageJ26を用いて行われる。個々のHC内のシナプスボリュームと位置の追加定量化は、Matlabで書かれたソフトウェアカスタムで実行されます。このソフトウェアは、著者が専門的なドキュメントとサポートを提供するためのリソースが不足しているため、一般に公開されていません。

<table><tbody><tr><td>Albumin Fraction V biotin-free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td><td>Molecular Probes Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>抗ミオシンVIIa (IgGポリクローナルウサギ)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>ブレードホルダー &ブレーカー - フラットジョーズ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>ボン動脈ハサミ - ボールチップ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップの厚さ 1.5H、24 x 60 mm</td><td>カールロス</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て外科用ブレード</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチウサギ (IgG)-AF647</td><td>ライフテクノロジーズ-モレキュラープローブ</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#5 - ファイン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン #5SF 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、絶対99.8%</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック12468750</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>カールロス</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>エクセル</td><td>マイクロソフトコーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェザーダブルエッジブレード</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 カニューレ</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウス (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>フィジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol、液浸油 518F</td><td>カールツァイス</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic、150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Ismatec</td><td></td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>実体顕微鏡用</td></tr>光源 <tr><td>ライカ アプリケーション スイート X</td><td>ライカ マイクロシステム CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 system</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メイヨーハサミタングステンカーバイドToghCut</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14512-17</td><td></td></tr>ミニ<tr><td>-100オービタル-魔神</td><td>科学産業</td><td>SI-M100</td><td>寒冷環境での使用</td></tr><tr><td>のためにナルコレン(ペントバルビタール)</td><td>ベーリンガーインゲルハイムVetmedicaGmbH</td><td></td><td></td></tr>ニ<tr><td>コンエクリプスNi-Ei</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NISエレメント</td><td>ニコンヨーロッパB.V.さん</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>カールロス</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>通気口のないシャー</td>レ<td>アバントVWR390-1375</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>AppliChemA1046</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>カールロス</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>カール・ロス</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ容器</td><td>サルスタット</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>学生広告鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>学生ハルステッド・モスキート止血</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト接着顕微鏡スライド</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscin 自家蛍光 Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 春はさみ、3mm</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 退色防止 取り付け Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 ディッシュ アタッチメントVibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (実体顕微鏡)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>はもう利用できません</td></tr></tbody></table>

若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

内有毛細胞と求心性聴覚神経線維をつなぐリボンシナプスの喪失は、加齢性難聴の原因の一つと考えられています。リボンシナプスの喪失を検出する最も一般的な方法は、個々の蝸牛のいくつかの鼻トピック位置からの定量的サンプリングを可能にするため、免疫標識である。しかし、関心のある構造は骨の蝸牛の奥深くに埋もれています。スナネズミは加齢性難聴の動物モデルとして使用されています。ここでは、固定、スナネズミ蝸牛全体マウントの免疫標識、共焦点画像化、およびリボンシナプス数および体積の定量化のための日常的なプロトコールが記載されている。さらに、貴重な高齢の個人から良好な材料を得ることに関連する特定の課題が強調される。 
スナネズミは安楽死させられ、心臓血管に灌流されるか、鼓膜水疱が頭蓋骨から慎重に解剖されます。蝸牛は頂点と基部で開き、固定液に直接移されます。最初の方法に関係なく、蝸牛は後固定され、続いて脱灰される。次いで、組織は、シナプス前およびシナプス後構造および有毛細胞に対する一次抗体で標識される。次に、蝸牛を、それぞれの一次抗体に対して特異的な二次蛍光タグ付き抗体と共にインキュベートする。その後、老化したスナネズミの蝸牛を自己蛍光消光剤で処理して、高齢動物の組織の典型的に実質的なバックグラウンド蛍光を減少させる。 
最後に、蝸牛を6〜11個のセグメントに解剖する。蝸牛全体の長さは、特定の蝸牛の位置が個人間で確実に決定されるように再構築される。連続して取得される共焦点画像スタックは、選択された位置の有毛細胞およびシナプスを視覚化するのに役立つ。共焦点スタックは畳み取り解除され、シナプスはImageJを使用して手動でカウントされるか、またはシナプス構造のより広範な定量化がMatlabでカスタム記述された画像解析手順で実行されます。

蝸牛は、動物全体の固定液による心血管灌流後に採取するか、または動物を安楽死させて浸漬固定した後に急速に解剖した。後者の方法では、IHCは解剖中に所定の位置にとどまり、一方、灌流が失敗し、したがって組織が十分に固定されていない場合、感覚上皮はしばしば破壊された。著者らは、経心経脈灌流後の蝸牛の固定が不十分である一方で、脳の固定がまだ十分であった症例に遭遇したことに留意されたい。劣った灌流からの組織は、蝸牛の頂点と基部に穴を開け、4%PFAに2日間浸漬することによって蝸牛を後固定することによって、依然として保存することができた。
蝸牛全体の長さ決定は、明確な特性周波数に相当する特定の蝸牛位置におけるIHCおよびそれらのシナプスを評価するために、Müller25に従って実施された(表1)。このために、所望の蝸牛位置を、蝸牛基底からの脳底膜長の百分率として計算した。若年成人スナネズミ由来の13蝸牛の蝸牛長の中央値は11.3mm(四分位範囲:11.02〜11.52mm)であった。老化したスナネズミ由来の24蝸牛...

求心性シナプス構造および有毛細胞を免疫標識し、加齢組織における自己蛍光を消光し、蝸牛の長さを解剖および推定し、共焦点イメージングで得られた画像スタック中のシナプスを定量することによって、若年成人および加齢スナネズミ蝸牛を処理するためのプロトコールが提示される。

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

このプロトコルは、すべての年齢のスナネズミの蝸牛におけるシナプス完全性の評価を可能にする。これは、特に加齢による聴覚障害の基礎研究にとって重要です。このプロトコルは比較的高速で、蝸牛に沿ったいくつかの場所から定量データを生成します。さらに、自己蛍光消光剤を用いて組織の老化という特定の問題に対処する。シナプスの変性は、蝸牛における機能喪失の最も初期の徴候である。それを定量することは、シナプタパシーのための非侵襲的診断ツールの開発に向けた研究において重要なツールである。蝸牛解剖は練習が必要な最も重要な部分なので、非実験的な蝸牛から始める方が良いです。まず、水疱を取り除くことから始めます。はさみで骨を切るか、鉗子で骨を割って鉗子で取り除き、蝸牛に届きます。マレウス、インカス、半円形の運河を削除します。蝸牛の頂点を覆っている骨を慎重に取り除き、鉗子で蝸牛骨を傷つけて、頂点と基底ターンに小さな穴を開けるか、両方の場所に慎重に穴をあけます。直ちに水疱を少なくとも50ミリリットルの冷たい固定剤に移す。蝸牛を半分に切るには、蝸牛のコイル状の長さよりも長いカミソリの刃を刃のホルダーに入れます。次いで、実体顕微鏡下で蝸牛をシャーレに入れる。カミソリの刃や細かいはさみで余分な組織を切り取ります。蝸牛を細かい鉗子で所定の位置に保持し、モディオラスに沿って半分に切ります。70%エタノールと混合して自家蛍光消光剤の5%溶液を調製する。この溶液にコクリを入れ、シェーカー上で室温で1分間インキュベートした後、1ミリリットルのPBSで3回5分間洗浄した。蝸牛の解剖のために、2つの細かい鉗子、超微細鉗子、バンナ、スプリングハサミ、ブレードホルダー、カミソリの刃を集め、ポリスチロールペトリ皿とその蓋にPBSを充填する。カミソリの刃から破片を折って、2〜4ミリメートルの切断面を得る。組織調製のためのセクションに示すように蝸牛を半分に切る。蝸牛の半分を鉗子で慎重に固定し、切断エッジが上を向くようにします。細かい春のはさみを使って、頂点を覆うヘリコトレマの上の蝸牛の骨を切り取ります。次に、はさみを使用して、モディオラスと聴覚神経とスカラ前庭を切り裂くことによって頂端を分離します。上記の蝸牛骨の両側に2つの切り込みを入れるか、または線条体血管炎がさらなる評価に必要でない場合は、中間回転の線条体血管炎を直接通過させる。カミソリの刃を使って蝸牛の部分を分離します。あるいは、コルティの器官と線条体血管の間に切開する。線条体血管を螺旋靭帯に接続したままにし、鉗子を使用して脱灰した骨を除去する。次に、蝸牛片をPBSで満たされたペトリ皿の蓋に移す。柱とモディオラーの側面の余分な組織を取り除き、マウント全体が後でできるだけ平らにスライドの上に置かれるようにします。大きな蝸牛片、特に基底ターンに由来するものは、2つの部分に切断されるべきである。超微細鉗子でテクトリアル膜を慎重に取り除きます。蝸牛片をスライドの上に置き、マウント媒体の滴に入れ、コルティの器官が上を向くようにします。蝸牛片を矢状面にシフトし、内側の有毛細胞のすぐ近くに螺旋状の縁肢の侵入を探します。この螺旋状の辺縁部の侵入は、中央および基底蝸牛片においてより明確に見ることができる。これらのステップを繰り返して、蝸牛全体と線条体血管全体を顕微鏡スライド上に移します。カバーはスライドを滑り込ませ、シーリングのために端の周りに黒いマニキュアを加えます。暗闇の中で乾燥させ、摂氏4度で保管してください。BioVoxxelプラグインがロードされたImageJソフトウェアで、デコンボリューションされたスタックのコピーを開きます。チャンネルを分割するには、「画像」、「カラー」、「チャンネルの分割」の順にクリックします。画像、カラー、チャンネルのマージをクリックして、異なる色を割り当てて、それらをマージします。[画像]をクリックして画像をRGBスタックに変換し、[色]に移動して[RGBにスタック]をクリックします。明るさとコントラストを調整するには、[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト]の順にクリックします。自動またはスライダーを使用して、シナプス前後の構造と内側の有毛細胞ラベルが背景と区別されるようにします。テキストツールで5つの内側の有毛細胞にラベルを付け、スタック内の目的の位置をクリックします。次に、[分析]、[ツール]の順に選択し、[ROI マネージャー] を選択します。チェックボックスのラベルにチェックを入れて、ポイントに数字のラベルを付けます。目的の内側の有毛細胞を拡大します。ポイントツールを右クリックしてマルチポイントモードを選択します。Z次元をスクロールし、シナプス後グルタミン酸パッチに並置されたシナプス前リボンによって識別される機能的なリボンシナプスを数える。目的の構造をすべて選択したら、[ROIマネージャの追加]をクリックし、任意の名前をクリックして[名前の変更]を選択します。ハンドツールで、次の内側の有毛細胞を完全に表示するように画像を調整します。マルチポイントツールからポイントツールに変更して、以前に保存したデータに句読点を追加しないようにします。次の内側の有毛細胞内の目的の構造をクリックし、マルチポイントツールに変更します。すべての内側有毛細胞が評価されるまで、ROI Managerで機能的なリボンシナプスを追加し続けます。ROI マネージャーでデータセットをクリックし、[測定] をクリックします。測定されたデータポイントを一覧表示する新しいウィンドウが表示されるのを待ち、[ファイル]と[名前を付けて保存]をクリックして、このリストをスプレッドシートとして保存します。ROI マネージャーで [すべて表示] を有効にして、画像を保存します。[平坦化]をクリックしてポイントラベルをスタックに永続的に追加し、[同意する]をクリックして変更を保存して閉じます。生後10ヶ月の若いスナネズミの蝸牛からのZスタック突起は、ここで白い破線で輪郭を描かれたミオシン7A標識内有毛細胞が背景と鋭く対照的であったことを示している。シナプス前リボンは緑色で示した2つの抗CtBP2で標識され、一方シナプス後グルタミン酸パッチは赤色で示された抗GluA2で標識された。生後38ヶ月の老齢スナネズミ由来の蝸牛を自己蛍光消光剤で処理し、シナプス前後構造がはっきりと見える明確な内部有毛細胞を示した。免疫標識の安定性を試験するために、若いスナネズミ由来の同じ蝸牛片を、3ヶ月後および29 1/2ヶ月後に画像化した。信号対雑音比が低下したにもかかわらず、機能的なシナプスは明瞭で定量化可能であった。切断が失敗した場合でも、残りの組織片を取り付けて、後で蝸牛の全長を最も正確に推定します。このプロトコルからのデータは、電気生理学的または心理物理学的聴力検査に先行し、その後個別に相関している場合、特に貴重です。

immunolabeling-counting-ribbon-synapses-young-adult-aged-gerbil

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、...

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。...

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

哺乳類の蝸牛の内有毛細胞のリボンシナプスにおける聴覚神経線維の樹状突起からのホールセルパッチクランプ記録。...

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

このビデオでは、マウス蝸牛の特定の領域にあるリボンシナプスを評価する方法を示します。免疫染色と共焦点イメージング技術を利用して、各蝸牛回転の異なる周波数領域にわたる機能的なシナプスを同定します。...

マウス蝸牛の特定の周波数領域におけるリボンシナプスの評価

タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。...

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

このビデオ記事は、同じ組織切片内の成体海馬ニューロン新生のすべての段階を検出し定量化するための包括的なプロトコルを示しています。私たちは、異なる宿主種からの適切な抗体が利用できない場合に生じる間接的な多重免疫蛍光の限界を克服する方法を詳しく説明しました。...

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。...

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

嗅覚ニューロンは、種々の軸索選別分子を発現して適切な神経回路を確立する。このプロトコルは、嗅覚ニューロンの軸索末端における軸索ソーティング分子のコンビナトリアル発現を視覚化する免疫組織化学的染色方法を記載している。...

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。...

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。...

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

蝸牛全体を画像化してデジタル化するために、ライトシート顕微鏡が開発されました。...

ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

学ぶリボンシナプスの免疫標識と計数法。若年および高齢スナネズミ蝸牛を用いて、加齢に伴う聴覚機能のシナプス変性を定量的に評価する手法を解説。自動蛍光消去技術も含む。

若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

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