ベンチトップレオメーターを使用した気道粘液の迅速な粘弾性特性評価

粘液閉塞性疾患は、気道粘液の異常な粘度によって特徴付けられる。このプロトコルは、レオロジーを使用して粘液粘度を定量化し、データを分析して粘液標的治療をテストする方法を示しています。粘液レオロジーは、特異的な定量的バイオマーカーを提供する。

ベンチトップデバイスを使用すると、ヒトの喀痰サンプルなどの臨床検体中のこれらのバイオマーカーを測定するための物流が大幅に簡素化されます。粘液レオロジーを閉塞性疾患の診断ツールとして使用することは依然として課題です。増え続ける証拠は、レオロジー特性、炎症、および細菌感染の間に強い相関関係を示しています。

粘液は、それが潤滑し、保護役割を果たす身体界面に常に存在する。粘液レオロジーは、胃腸および生殖器トラックのような他のシステムに適用することができる。正確な測定値を得るためには、サンプルの正しい取り扱いと配置が重要です。

視覚的なデモンストレーションは、このアッセイの精度を高めることができます。この手順を実証するのは、航空研究所の研究技術者であるKendall Shafferです。採取した気道喀痰または粘液を滅菌標本カップに選別することから始めます。

喀痰の場合は、採取後すぐにサンプルから余分な唾液を除去してください。輸送のためにサンプルを氷の上に置きます。輸送時間を 4 時間未満に制限します。

採取時にサンプルを分析します。正の変位ピペットで3〜5回静かに上下にピペッティングして粘液を均質化します。または微量遠心チューブに直接ピペットを差し込む。

処理されるまでサンプルを摂氏80度で保存します。実験に十分な容量を確保するために、500マイクロリットル以上の容量で保存するためのサンプルをアリコートします。分注する前に、新鮮で凍結した喀痰または粘液を直接ピペットでピペットするか、検体を均質化します。

繰り返し測定と治療に必要なアリコートを修復します。測定前に、試験するアリコートを摂氏37度で少なくとも5分間インキュベートする。薬理学的薬剤を試験するには、サンプルの希釈を防ぐために高濃度のストック溶液を使用してください。

1%~10%容量の所望の試薬を試料に直接加える。コンパウンドの滴がチューブの側面にとどまらないようにしてください。化学反応を可能にするために、必要な時間、37°Cでサンプルをインキュベートする。

粘液サンプルと試薬を混合するには、2分ごとに微量遠心チューブの底をフリックして、ムチンネットワークを損なうことなく粘液サンプルへの試薬の漸進的な浸透を可能にします。複数の薬剤試薬を比較する場合は、インキュベーション時間が類似していることを確認してください。マシンの電源を入れ、ソフトウェアを初期化します。

新しい測定値を選択します。続行するには、[メジャー ID] にサンプル ID 番号を入力し、[測定者] に測定者の名前を入力します。[コメント] に追加情報またはコメントを入力します。

ジオメトリセットを選択し、大小のプレートを慎重に検査して、プレートが清潔で完璧な状態であることを確認します。大きな版を下の説教壇にしっかりと差し込みます。上の説教壇に小皿をそっと差し込み,カチッという音がするまでわずかに回転させて版をロックします。

なお、上板の自由振動は正常である。温度が37°Cの目標値に達するまで待ちます。次に、ソフトウェアの指示に従って自動キャリブレーションを開始します。

容積型ピペットを用いて、大きな底板の中央に250〜500マイクロリットルのサンプルの間でゆっくりとピペットをピペットする。プレート上に堆積すると、粘性サンプルはドーム形状を採用するが、弾性の高いサンプルは物理的な切断を必要とする可能性がある。ソフトウェアを介して小板を運ぶ測定ヘッドを下げ、サンプルを観察します。

底板に適切に装填されると、サンプルは接触し、2つのプレート間の中心に配置されます。サンプルがギャップを埋めるようにするには、サンプルが両凹形状にならなくなるか、プレートの端に揃わなくなるまで、ギャップ縮小機能を使用します。ギャップ低減機能は、測定エッジを0.1ミリメートル刻みで下げ、7段階に制限されています。

7 段階経ってもギャップが残っている場合は、[インストールのやり直し] をクリックして初期位置に戻り、サンプルの位置とボリュームを調整します。ギャップが非常に減少した場合は、上部プレートの端に沿って円を描くようにして、余分なサンプルをヘラで取り除きます。せん断応力を避けるために、余分なサンプルを慎重にトリミングします。

振動中に汚染された液体が誤って投影されないように、保護カバーを下げてください。測定を開始するには、[解析の開始]をクリックします。サイクル全体には4〜7分かかります。

サイクルの全期間にわたって、大声で話したり、デバイスやベンチに触れたりしないでください。最初の2分間は静かな環境が重要です。サイクルが完了したら、[次へ]をクリックして測定ヘッドを上げ、サンプル分析レポートを生成します。

測定ヘッドが完全に引っ込められたら、保護カバーを持ち上げます。サンプルを捨て、プレートを慎重に取り外します。温水と石鹸を使ってプレートをきれいにし、消毒してください。

8メガダルトンPEOの粘弾性特性を5つの濃度で測定し、評価されたベンチトップレオメーターと従来のバルクレオメーターとを直接比較しました。PEO溶液とは対照的に、状態喘息粘液は、低ひずみでは固体のような弾性優勢な挙動を表し、高ひずみではクロスオーバーを特徴とする。また、1.5%PEO溶液および臨床アッセイ粘液サンプルで行った3連の測定により、生体サンプルから得られた値に対して線形粘弾性特性が高い再現性があることを確認した。

粘液溶解剤による処理後の粘液の粘弾性特性の変化を測定した。アッセイ粘液粘弾性に対するTCEP効果を、ベンチトップレオメーターを用いて臨床現場で試験した。粘液溶解処理の結果、複素弾性率が4.6倍、弾性率が5.1倍、粘弾性率が1.9倍、クロスオーバーひずみが3.3倍、クロスオーバー降伏応力が5.7倍減少し、減衰比が2.8倍増加した。

ペースの速い臨床環境で気道粘液粘弾性を測定することは、ケースバイケースで患者の治療を調整するのに役立ち、新規薬理学的化合物を試験するための標準化されたプロトコルを提供することができます。この技術は、現在、嚢胞性線維症喀痰に対する非常に効果的なCFTRモジュレーターの効果を調べ、粘液特性を変えることを目的とした様々な薬物の効力を試験するために使用されている。