Name: オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 学ぶオリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化法。サリチルホスホロクロリジットとピロリン酸を用い、RNA・DNA・非天然L-RNAなど任意の配列・長さ・骨格化学に対応可能。固相合成後のカラム上で反応を行い、リボザイム触媒反応への応用も示される。

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著者らは、化学的三リン酸化反応のベストプラクティスに関する有益な議論をしてくれたGreg Springsteen、Natasha Paul、Charles Olea, Jr.、Jonathan Sczepanski、Katrina Tjhung、およびGerald Joyceに有益なコメントを寄せて感謝している。この研究は、国立科学財団からの助成金MCB 2114588によって支援されました。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明するトリリン酸化手順は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチド合成と広く適合性がある。ヌクレオシドホスホロアミダイトは、亜リン酸エステル上の標準β-シアノエチル、および核酸塩基の環外アミン上のイソブチリル、ジメチルホルムアミジル、アセチル、フェノキシアセチル、または4-イソプロピルフェノキシアセチル基を含む、AMA39における迅速な脱保護と相溶する塩基不安定性保護基を有するべきである。リボース2'-ヒドロキシル基は、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)またはトリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)40,41のいずれかのシリル保護基によって保護されるべきである。塩基不安定性ピバロイルオキシメチル(PivOM)基はまた、化学的三リン酸化30と相溶性であることが報告されている。
合成オリゴヌクレオチド28、29、30、31、32、33、34、35の化学的三リン酸化について複数の方法が記載されている。我々は、ルートヴィヒ・エクスタイン試薬37を用いた三リン酸化が最もアクセスしやすいものの1つであり、試薬の特殊な合成や特殊な装置を必要としないことを発見しました。この方法で調製されたオリゴヌクレオチド5'-三リン酸は、この「ミラーイメージ」核酸の鋳型依存的な合成および複製を達成するために酵素的にアクセスできないL-RNAオリゴヌクレオチド三リン酸の使用を含む、RNAリガーゼリボザイムの基質として日常的に使用されている14,16,17,18.この方法は、脊椎動物における自然免疫応答の強力な活性化因子である小さな5'-トリリン酸化ステムループRNAの調製にも適している6,7。
ルートヴィヒ・エクスタイン試薬であるサリチルホスホロクロリダイト37は、水に対する反応性が高く、オリゴヌクレオチドカラムにロードする前に試薬を溶解するときに導入された水を効果的に除去します。しかし、この時点以降、5'-ホスフィチル化オリゴヌクレオチドは、ピロリン酸よりも系に導入された水と優先的に反応し、後処理後に5'-H-ホスホネート副生成物を形成する28,37,38。トリリン酸化試薬とトリリン酸化反応チャンバの慎重な調製は、この副生成物が形成されないようにします。溶媒乾燥のために、タイプ4 Åモレキュラーシーブは、ほとんどのオリゴヌクレオチド合成試薬会社によって、さまざまなブランド名でほとんどの有機溶媒と互換性のあるテフロン(登録商標)バッグにあらかじめ包装されて販売されています。無水雰囲気下でグローブボックス内で三リン酸化を行うなどの追加の予防措置は、一般に必要ではない。
5'-ホスフィチル化オリゴヌクレオチドとTBAPとの反応は、環状5'-トリメタホスファイト中間体を形成し、次いで、オリゴヌクレオチド合成酸化剤溶液(水/ピリジン/THF中のヨウ素)を用いて環状5'-トリメタリン酸に酸化される。市販の酸化剤溶液は様々な量のヨウ素を使用するので、三リン酸への完全な酸化を確実にするために高い0.1 Mヨウ素濃度を使用することが不可欠であることに留意すべきである。環状生成物は、同じ溶液37中で最終的な直鎖状5'-三リン酸に加水分解され、水以外の求核剤による線状化が望まれる場合、代替の無水酸化剤溶液を使用しなければならない(用途については下記参照)33。しかしながら、残留環状トリメタリン酸は、オリゴヌクレオチドのその後のアルカリ脱保護中に線形化される。環状5'-トリメタリン酸の加水分解は、分枝状の三リン酸37,46ではなく、直鎖状のもののみを生じる。
オリゴヌクレオチドの脱保護は、典型的には、5'-トリリン酸化を収容するように修飾される必要はないが、いくつかの予防措置がとられるべきである。三リン酸はアルカリ性条件への短時間の曝露に対して比較的安定であるが、三リン酸を必要以上に長くAMAに曝露しないように注意すべきである。アンモニアまたはAMA中で65°Cで10分以上長時間処理する必要がある保護基は避けるべきです。室温でアンモニア中で2時間などのより穏やかな処理は、他のホスホロアミダイト保護基と相溶する場合に許容される。シリル保護合成RNAオリゴヌクレオチドの一般的で高速な脱保護方法は、トリエチルアミン三フッ化水素塩および高温を使用する47;しかし、RNAの5'-三リン酸を調製する際には、長時間の酸性条件が三リン酸加水分解を促進することが判明しているため、これは避けるべきである31,32。
分取PAGEは、5'-トリリン酸化オリゴヌクレオチドの脱保護後精製のための最も簡単で信頼性の高い方法であることが証明されています(図3および図4)。しかしながら、分取逆相HPLCは、トリリン酸化生成物を精製するためにも使用することができる。5'-二リン酸および5'-一リン酸生成物の存在は、質量分析によって三リン酸化を検証する際に日常的に観察される。我々は、特に装置がオリゴヌクレオチドの分析に最適化されていない場合、化学合成または転写によって調製された高純度材料からの質量分析中に5'-三リン酸断片化を観察した。それにもかかわらず、RP-LC分析は、5'-二リン酸側生成物の10%〜20%が、より長い5'-トリリン酸化オリゴヌクレオチド中に存在することをしばしば示している(図4)。トリブチルアンモニウムピロホスフェートの市販の調製物は、20%のモノホスフェートで汚染される可能性があり、トリリン酸化中に副生成物として5'-二リン酸を生成する30,31。この試薬を社内で慎重に調製することにより、はるかに純粋なTBAPストック31を産出することができる。しかしながら、我々は、TBAPの市販供給源を用いてトリリン酸化されたオリゴヌクレオチドが、in vitro転写によって調製された物質と比較して、酵素反応において基質として使用された場合(図5B)に依然として同等以上の反応性を示すことを見出した。
ルートヴィヒ・エクシュタイン試薬を用いたオリゴヌクレオチド三リン酸化の注目すべきさらなる使用の1つは、環状トリメタホスファイト中間体33を利用する。無水条件下でのオリゴヌクレオチド酸化によく使用されるヘキサン中で 1Mt-ブチルパーオキサイドを用いてその後の酸化工程を行うと、開環加水分解することなく亜リン酸の酸化が起こり、環状トリメタリン酸を生じる。次いで、この中間体を第一級アミンまたはアルコール求核剤と反応させて、γリン酸で修飾した5'-三リン酸塩を生成することができる。これらの修飾には、ホスホラミデート結合によって連結された親油性タグの付加が含まれ、これはRP−LCによる迅速な三リン酸特異的精製を容易にし、続いて三リン酸33からのタグの酸性加水分解を含む。γリン酸位置における蛍光修飾はまた、リボザイム触媒ライゲーション反応15、33のためのリアルタイム蛍光レポーターとして使用するために導入され得る。

RNAの5'-トリリン酸化型は、生命のすべてのドメインにおけるRNA転写および多くのRNAウイルスのライフサイクル中のRNA複製によって生成されるため、生物学において遍在している。これらの三リン酸は、真核生物における7-メチルグアニル酸キャップ付きmRNAの形成のための基質として働き、したがって、タンパク質発現において不可欠な役割を果たす1。対照的に、三リン酸は細菌およびウイルスに保持される。したがって、RNA 5'-三リン酸は、真核生物2、3、4、5、6、7の自然免疫応答調節因子によって認識される。生物学の外では、RNAリガーゼリボザイムのホストは、インビトロ8で5'-三リン酸を使用するように進化し、診断アッセイ9、10、11、12、13、14、15で使用するために修飾されています。そのようなリボザイムの1つは、小さなL−RNAオリゴヌクレオチド5'−三リン酸16,17,18からの天然D−RNAの非生物学的「鏡像」鏡像異性体であるL−RNAの鋳型依存的合成に使用することができる。様々な配列および骨格組成のトリリン酸化オリゴヌクレオチドの日常的な調製は、これらの系を調査するために不可欠である。
実験室でRNA 5'-三リン酸を調製するための最も一般的でアクセス可能な方法は、in vitro転写によるものです。しかしながら、この方法により産生されるRNAは、RNAポリメラーゼ酵素のプロモーターや基質要件によって配列やサイズに制限がある。T7 RNAポリメラーゼおよび特殊化誘導体は、この目的に使用される最も一般的なポリメラーゼである19、20、21、22。これらの酵素で調製されたインビトロ転写RNAは、5'末端プリンで開始されなければならず、最初の10ヌクレオチド23,24のプリン体に強く偏っている。さらに、塩基または骨格修飾ヌクレオチドの酵素的組み込みは、せいぜい非効率的であり、天然ポリメラーゼではよりしばしば不可能であり、天然D-RNA以外のものからなるオリゴヌクレオチド5'-三リン酸を生成する機会を制限する。もう一つの制限要因は、インビトロ転写によって生成されたRNAが実質的な5'-および3'-不均一性を含み得、20nt 23,24,25,26,27より短いときに非常に不均一な産物として産生されることである。
対照的に、固相ホスホロアミダイト合成28、29、30、31、32、33、34、35によって調製されたオリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化は、任意の配列の3〜50nt長のオリゴヌクレオチド5'−三リン酸を調製するために使用することができる。さらに、ホスホロアミダイト合成にアクセス可能な膨大な数の核酸修飾を、5'-三リン酸化14,15,16,17,18,29,36の前にオリゴヌクレオチドに付加することができる。これらの方法の多くは、モノヌクレオシド37の溶液相三リン酸化のためにルートヴィヒとエクシュタインによって開発された亜リン酸ホスホロクロリダイトを使用する。この試薬によるオリゴヌクレオチドの三リン酸化は、オリゴヌクレオチド5'-ヒドロキシルのホスフィチル化、ピロリン酸との反応および酸化による三リン酸への変換、続いて固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断、脱保護、および精製のための標準的な手順によって固相上で達成される(図1)28。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> 図1:合成オリゴヌクレオチドの三リン酸化のスキーム。第1工程では、オリゴヌクレオチド5'-ヒドロキシルをSalPClでホスフィチル化する。次のステップでは、5'-サリチルホスファイトをTBAPと反応させて環状メタホスファイトを形成し、次いで第3工程で酸化してDNA/RNA合成機酸化溶液(0.1 M ヨウ素/ピリジン/H2 O/THF)中で環状5'-トリメタリン酸を生成し、これを急速に加水分解して同じ溶液中の直鎖状5'-三リン酸を生成する28,33、37。その後の固体CPG担体からのアルカリ切断および水性MeNH2/アンモニア中でのオリゴヌクレオチドの脱保護は、残留環状トリメタリン酸を直鎖状形態に加水分解する。略語:SalPCl=サリチルホスホロクロリダイト;TBAP = トリブチルアンモニウムピロホスフェート;THF=テトラヒドロフラン;CPG = 制御された細孔ガラス;MeNH2=メチルアミン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
この方法を用いた早期に発表された報告は、しばしば収率の悪さおよび望ましくない副産物28,37,38に苦しんだが、無水条件の慎重な維持は、日常的に高い収率を得るために必要なすべてである。これは、試薬の慎重な調製と、標準的なプラスチック部品から組み立てられた簡単な反応装置の使用によって達成することができる。ここでは、試薬の調製、反応チャンバーの組み立て、トリリン酸化反応、およびその後のトリリン酸化オリゴヌクレオチドの脱保護および精製を含む、オリゴヌクレオチドの化学的トリリン酸化のための適切なステップを実証する。また、天然のD-RNAおよび非生物的L-RNA骨格を有するより大きな核酸産物を合成するためのリガーゼリボザイムの基質としての5'-トリリン酸化オリゴヌクレオチドの代表的な使用も含まれる。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mポリエーテルスルホンシリンジ</td><td>フィルターMilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>粉砕されたポリアクリルアミドゲル粒子を除去するためのシリンジフィルター(セクション5)</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m PTFEシリンジフィルター</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLLG013SL</td><td>CPG樹脂除去用シリンジフィルター (セクション5)</td></tr><tr><td>1 mLプラスチックシリンジ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>トリホスホシル化装置のコンポーネント(セクション2&ndash;4)</td></tr><tr><td>1,4-ジオキサン、無水</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>トリリン酸化溶媒(セクション2&ndash;4)</td></tr><tr><td>2-クロロ-4H-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン、サリチルホスホロクロリダイト(SalPCl)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>324124</td><td>トリリン酸化試薬(セクション2&ndash;4)</td></tr><tr><td>30 mLガラス瓶</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>トリホスホリル化溶媒およびTBAP溶液を調製するためのボトル(セクション2)</td></tr><tr><td>3ウェイストップコック、ポリカーボネート/ポリプロピレン</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリ</td>ーズ <td>7328103</td><td>トリホスホリル化装置のコンポーネント(セクション2&ndash;4</td></tr><tr><td>)40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液、19:1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>For PAGE(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>アセトニトリル、無水、100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>トリリン酸化溶媒(セクション2&ndash;4)</td></tr><tr><td>アンモニア中和トラップ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 および ANS121</td><td>Speedvac DNA130 用 (セクション 5)</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>アクリルアミド重合用触媒 PAGE 用 (セクション 5&ndash;7)</td></tr><tr><td>アンモニア水溶液、28%</td><td>ミリポアシグマ</td><td>338818</td><td>AMA脱保護試薬の調製用(セクション5)</td></tr><tr><td>メチルアミン水溶液、40%</td><td>TCIアメリカ</td><td>TCI-M0137</td><td>AMA脱保護試薬の調製用(セクション5)</td></tr><tr><td>自動DNA/RNAオリゴヌクレオチドシンセサイザー</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA/RNAシンセサイザー</td><td>カラムベースのシンセサイザーはどれでも可 (セクション1)</td></tr><tr><td>ビーズ捕捉磁石</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>ストレプトアビジンビーズ捕捉用 (セクション 7)</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>PAGE 尿素ローディングバッファー用 (セクション 5)</td></tr><tr><td>深真空オイルポンプ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>凍結乾燥機用 (セクション 5)</td></tr><tr><td>ドライエライト乾燥剤、10-20 メッシュ</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>トリホスホリル化化学物質および機器を保管するための乾燥剤(セクション1&ndash;2)</td></tr><tr><td>D-RNA 27.3t クロスキラルポリメラーゼ</td><td>自社で調製18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&PRIME;</td><td>クロスキラルリボザイム反応の場合(セクション7)</td></tr><tr><td>D-RNA CPGソリッドサポート、1,000&Aring;、パッケージ済み1&マイクロ;モル合成カラム</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>代表, D-RNAオリゴヌクレオチド合成用 (セクション1)</td></tr><tr><td>D-RNA TOM-保護ホスホロアミダイト</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>代表, D-RNAオリゴヌクレオチド合成用 (セクション1)</td></tr><tr><td>Empty Expedite Synthesis Columns, 1&micro;m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Expedite DNA/RNAシンセサイザーで使用する合成カラム(セクション1)</td></tr><tr><td>EPPS、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N&prime;-(3-プロパンスルホン酸)、固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td>リ<td>ボザイム反応バッファーコンポーネント(セクション6)</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>さまざまなバッファーで使用するための二価金属イオンキレート剤(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>Expedite合成カラム用フィルター</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Expediteスタイルの合成カラムフィルター、空の合成カラムで使用するため(セクション1)</td></tr><tr><td>蛍光/リン光ゲルスキャナーCytiva</td><td></td><td>Amersham Typhoon RGB、29187193</td><td>分析PAGEの視覚化用(セクション6&ndash;7)</td></tr><tr><td>ホルムアミド、脱イオン</td><td>VWRライフサイエンス</td><td>97062</td><td>PAGEホルムアミドゲルローディングバッファー用(セクション6&ndash;7)</td></tr><tr><td>ゲル画像定量ソフトウェア</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>スキャンゲル画像の定量化用(セクション6)</td></tr><tr><td>ガラスデシケー</td><td>ターMilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>トリリン酸化溶媒保存(セクション2)</td></tr><tr><td>L-RNA CPG固体担体、1,000&Aring;、バルク</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10、N-4692-10、N-4693-10、N-4694-10</td><td>L-RNAオリゴヌクレオチド合成(セクション1)</td></tr><tr><td>L-RNAシュモクザメテンプレート</td>は<td>、社内で調製18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>クロスキラルリボザイム反応の場合(セクション7)</td></tr><tr><td></td><td>自社製18</td><td>5&prime;-フルオレセイン-GGCUCGA-3&prime;</td><td>クロスキラルリボザイム反応の場合(セクション7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM保護ホスホロアミダイト</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-RNAオリゴヌクレオチド合成 (セクション1)</td></tr><tr><td>凍結乾燥機/凍結乾燥機</td><td>VirTis</td><td>ベンチトップK</td><td>オリゴヌクレオチドの濃縮用(セクション5)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物、固体</td><td>ミリポアSigma</td><td>M2670</td><td>リボザイム反応用(セクション6&ndash;7)</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド、無水</td><td>ミリポアシグマ</td><td>227056</td><td>トリリン酸化溶媒(セクション2)</td></tr><tr><td>NAP-25脱塩カラム(Sephadex G-25樹脂)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>45000150</td>セ<td>ファデックスG-25樹脂を配合した使い捨て重力流量サイズ排除クロマトグラフィーカラム(セクション5)</td></tr><tr><td>非コアリングステンレス鋼針、20G</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-815-410</td><td>ゴム製のセプタムを突き刺すための針(セクション2&ndash;4)</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド吸光係数計算機</td><td>統合DNA技術</td><td>OligoAnalyzerツール</td><td>最近傍モデル 短いオリゴヌクレオチド260nm吸光係数計算機(セクション5)</td></tr><tr><td>酸化剤溶液、THF /ピリジン/水中の0.1 Mヨウ素</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>トリリン酸化試薬(セクション4)</td></tr><tr><td>PAGEプレート</td><td>Timberrock / CBS</td><td>NGP-250-BOおよびNO</td><td>PAGEの場合(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>PAGE電源</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>For PAGE(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>PAGEスペーサーとコーム(分析用)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725およびVGC-0714</td><td>PAGE用(セクション6&ndash;7)</td></tr><tr><td>PAGEスペーサーとコーム(分取)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025RおよびVGC-3001</td><td>For PAGE(セクション5)</td></tr><tr><td>PAGEスタンド</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>For PAGE(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>三リン酸化装置用ワックスシールフィルム(セクション2&ndash;4)</td></tr><tr><td>PCR サーモサイクラー</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>C1000 タッチサーマルサイクラー</td> クロス<td>キラルリボザイム反応用 (セクション 7)</td></tr><tr><td>PD 10 脱塩カラム (Sephadex G-10 樹脂)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Sephadex G-10 樹脂を含む使い捨て重力流量サイズ排除クロマトグラフィーカラム、オリゴヌクレオチド用 < 15 nt (セクション 5)</td></tr><tr><td>蛍光体スクリーン</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>32P標識RNAの可視化用(セクション6)</td></tr><tr><td>ホスホロアミダイト合成試薬</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52、40-4050-53、40-4012-52、40-4122-52、40-4060-62</td><td>代表、標準的なRNA/DNA合成用(セクション1)</td></tr><tr><td>ポリプロピレン製スクリューキャップシールチューブ</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>1.5 mL微量遠心チューブ、スクリューキャップとシリコンOリング付き、安全なAMA脱保護用(section 5)</td></tr><tr><td>Pyridine, anhydrous</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>トリリン酸化溶媒 (section 2)</td></tr><tr><td>逆相液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析 (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>オリゴヌクレオチドに特化したLC/MSの商用サービス (section 5)</td></tr><tr><td>ラバーセプタム (ID x OD 7.9 mm x 14 mm)、白色</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>トリホスホリル化溶媒およびTBAPを調製するためのセプタム(セクション2)</td></tr><tr><td>自己複製器リボザイムE</td>は<td>、社内で調製14</td><td>5&PRIME;-GGAAGUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&PRIME;</td><td>自己複製リボザイム反応の場合(セクション6)</td></tr><tr>自己<td>複製子A</td>は<td>、社内で調製14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>自己複製リボザイム反応(セクション6)</td></tr><tr><td>自己複製基質B、転写</td><td>社内で調製14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>自己複製リボザイム反応の場合(セクション6)</td></tr><tr><td>小型乾燥トラップ、4&Aring;モレキュラーシーブ</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>DNA/RNAシンセサイザーホスホアミダイトおよびトリホスホシル化試薬用乾燥トラップ(セクション1&ndash;2)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)、固体</td><td>ミリポアSigma</td><td>S7653</td><td>塩、さまざまなバッファー(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)、固体</td><td>ミリポアSigma</td><td>S8045</td><td>塩、さまざまなバッファー(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>統計データフィッティングソフトウェア</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>分析PAGEから速度論モデルへのデータフィッティング用(セクション6)</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>クロスキラルリボザイム反応におけるビオチン標識RNAの捕捉用(セクション7)</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ミリポアSigma</td><td>84097</td><td>PAGE尿素ローディングバッファー用(セクション5)</td></tr><tr><td>TBEランニングバッファー、10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Scientific AAJ62788K3</td><td>PAGE(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>フッ化テトラブチルアンモニウム、テトラヒドロフラン中の1.0 M溶液</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>2-prime;-silyl保護基の除去用 (セクション 5)</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>1610801</td><td>PAGE用アクリルアミド重合用 (セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>トリブチルアミン</td><td>ミリポアΣ</td><td>90781</td><td>トリリン酸化試薬 (セクション 2)</td></tr><tr><td>ピロリン酸トリブチルアンモニウム (TBAP)</td><td>ミリポアSigma</td><td>P8533</td><td>トリリン酸化試薬 (セクション 2)</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>ミリポアΣ</td><td>T6666</td><td>各種バッファーで使用するための緩衝剤 (セクション 5&ndash;7)</td></tr><tr><td>TWEEN20ポリソルベート洗剤</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td>磁気<td>ビーズで使用するための中性洗剤(セクション7)</td></tr><tr><td>尿素</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>ページおよびゲルローディングバッファー用(セクション5&ndash;7)</td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>オリゴヌクレオチド濃度の測定用(セクション5)</td></tr><tr><td>真空遠心分離機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 真空濃縮器</td><td>AMAおよびTHFの除去用(セクション5)</td></tr><tr><td>キシレンシアノール</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>PAGE尿素ローディングバッファー用(セクション5)</td></tr></tbody></table>

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

5'-三リン酸は、すべての生命を通して見られる必須の核酸修飾であり、バイオテクノロジーおよび合成生物学におけるオリゴヌクレオチドの機能修飾としてますます使用されている。オリゴヌクレオチド5'-三リン酸は、歴史的に酵素的方法によって インビトロで 調製されてきた。しかしながら、これらの方法は天然RNAオリゴヌクレオチドに限定され、強い配列選好を有し、そして不均一な産物を産生する傾向がある。化学的三リン酸化の新しい方法は、ホスホロアミダイト化学による自動オリゴヌクレオチド合成のコスト削減と、現在利用可能な多様なヌクレオチド修飾の両方を補完します。したがって、任意の配列および長さのオリゴヌクレオチド三リン酸の合成、および任意選択で様々な非天然修飾を含む、現在アクセス可能である。
この論文では、サリチルホスホロクロリダイトおよびピロリン酸を用いたオリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化のための適切な方法および技術を提示する。この方法は、市販の試薬を使用し、標準的な固相合成法によって調製されたほとんどのオリゴヌクレオチドと適合性があり、脱保護および精製の前に、オリゴヌクレオチド合成後2時間で完了することができる。非生物学的L-RNA三リン酸からのハンマーヘッドリボザイムの鏡像版の合成を含む、触媒RNA酵素の基質としての化学的に三リン酸化されたオリゴヌクレオチドの2つの使用が実証されている。

オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイトおよび自動DNA/RNA合成装置に適した標準プロトコールを使用して合成し、元のプラスチック合成カラムで固体支持体から生成物オリゴヌクレオチドを抜き去り、5'末端ジメトキシトリチル基を除去して遊離の5'-ヒドロキシルを得る(セクション1)。この実証で使用したすべてのオリゴヌクレオチドは、固体支持体として1,000 Å制御細孔ガラス(CPG)樹脂を使用して調製し、0.2または1 μmoleスケールで実施しました。シンセサイザーカラム、樹脂、試薬、およびホスホロアミダイトの代表例は、 材料の表に提供される。より大規模な反応の場合、後続のステップで使用される量と時間を調整する必要があるかもしれません。
トリリン酸化反応は、材料表に記載されている標準的な市販の成分を使用して、特注の反応チャンバ(図2、セクション3)でオンカラムで実施され、図1(セクション4)28に示されているスキームに従います。トリリン酸化中は条件を厳密に無水に保ち、すべての溶媒と試薬を事前にモレキュラーシーブで調製し、使用前に完全に乾燥させることが不可欠です(セクション2)。トリリン酸化が起こるのに通常2時間かかり、その後、洗浄および乾燥されたカラムは、標準的なオリゴヌクレオチドの脱保護および精製手順に従って処理することができる(セクション5)。
脱保護後、オリゴヌクレオチド三リン酸を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって精製し、ゲルから切り出して溶出することができるUVバックシャドウイングによって単一の主要な生成物バンドを示す。 図3A、BにDNAトリヌクレオチド5ʹ-三リン酸、pppAAAおよびpppCCC、およびL-RNAトリヌクレオチド5ʹ-三リン酸pppGAAについて示されているように、5'-三リン酸生成物は、短いオリゴヌクレオチドの反応側生成物から容易に分離される。AAAおよびCCC DNA三量体の5'-ヒドロキシルおよび5'-三リン酸生成物の両方を摘出し、質量分析によって同定し、それに対応して 図3Aに標識した。追加のバンドは、AAA DNA三量体について見られるように、一般に、回収および同定するのに十分な物質を含まない。しかしながら、これらのバンドの存在は、以下で説明するように、典型的には5'-二リン酸、一リン酸、およびH-ホスホネート副生成物を表す未精製反応生成物(図3C)中の追加の生成物質量と相関する。
PAGE精製後、より大きなオリゴヌクレオチドを、破砕および浸漬法42 およびそれに続くエタノール沈殿を用いて溶出することができる。しかしながら、15nt未満のオリゴヌクレオチドはエタノールで効率的に沈殿させることができず、したがって、ゲル溶出のための修飾手順を必要とする(ステップ5.11.3)。 材料表 に記載されている使い捨てサイズ除外欄は、10 ntより長いオリゴヌクレオチドでの使用についてのみ評価されています。しかし、三量体ほど短いオリゴヌクレオチドは、製造業者の推奨プロトコルを使用して効果的に脱塩できることを見出した。それにもかかわらず、短いオリゴヌクレオチドを脱塩する場合(ステップ5.6および5.11.3のように)、カラム溶出液をフラクションで収集し、製品フラクションをUV-Vis分光光度計を使用した260nmの吸光度で同定することが推奨されます。より短いオリゴヌクレオチド用に最適化されたサイズ除外カラムは、代替選択肢として 材料表 に用意されています。精製後のオリゴヌクレオチド合成の1μmoleスケールからの最終収率は50〜300nmolである。
トリリン酸化は質量分析によって確認することができ、トリリン酸化生成物は5'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドよりも質量+239.94Da大きいが、5'-ジリン酸および一リン酸(+159.96および+79.98Da)に対応する物質の存在がしばしば観察される。5'-OH質量から質量+63.98Daの5'-H-ホスホネート副生成物も観察される可能性があり、この生成物の高レベルは、トリリン酸化中の状態が十分に無水ではなかったことを示している。精製の前に、脱保護されたオリゴヌクレオチドは通常、これらすべての生成物(図3C)を示すが、精製された物質は、5'-ジおよびモノリン酸とともに5'-三リン酸生成物に対応するピークを示す(図3D、E)。
質量分析法だけでは、イオン化の微分速度およびイオン化中の三リン酸の断片化のために、典型的には5'-三リン酸純度の厳密な測定値は得られない。最終生成物の純度を測定するには、特に長いオリゴヌクレオチドの場合、逆相液体クロマトグラフィーおよびタンデムESI-MS(RP-LC/ESI-MS)を推奨します。RP-LC/ESI-MS による D-RNA 5'-三リン酸 pppACGAGG および pppGAGACCGCAACUUA の分析 (それぞれ図 4A,B) は、より長いオリゴヌクレオチド上に存在する場合、これら 2 つの種を分離することが困難であるため、20% の 5'-二リン酸を含む典型的な最終生成物純度を示しています。
合成5'-三リン酸オリゴヌクレオチドは、典型的には、生化学的研究において酵素的に調製された材料と同程度またはそれ以上に機能する。セクション6では、例として、合成またはインビトロ転写によって調製された5'−三リン酸14nt RNA基質を、RNA触媒自己複製反応14、15、43、44、45において比較した。リボザイムEは、基質AとBの接合を触媒し、指数関数的成長が可能な自己触媒反応においてEの新しいコピーを生成する(図5A)。Eおよび32P標識A成分をインビトロ転写によって調製し、そしてトリリン酸化基質Bを、上述のように合成的に、またはインビトロ転写によって調製した14。自己複製反応の進行は、変性PAGEによって分析され、蛍光/燐光ゲルスキャナを介して定量された定期的なサンプルを採取することによってモニターされた。得られたデータは、ロジスティック成長関数に適合し、転写された基質または合成B基質のいずれかが指数関数的成長を支持するが、合成Bはわずかに多くの生成物を与えることを明らかにした(図5B)。この結果は、in vitro転写によって調製されたRNAの5'末端における組成の不均一性を反映している可能性がある23,24。
化学的三リン酸化はまた、 インビトロ または細胞内で生物学的に調製することができないオリゴヌクレオチド三リン酸の合成を可能にする。セクション7では、セクション1〜5のように調製された天然D-RNAの鏡像異性体であるL-RNAからなる非生物学的オリゴヌクレオチド三リン酸を、短いL-RNAオリゴヌクレオチド5'-三リン酸からのより長いL-RNA産物の鋳型指向重合を配列一般の様式で触媒するD-RNA「クロスキラル」ポリメラーゼリボザイム27.3t(図6A)の基質として使用した。一例として、リボザイムはハンマーヘッド自己切断モチーフのL-RNAバージョンを合成することができる(図6B)18。精製されたL-RNAトリヌクレオチド三リン酸をフルオレセイン標識L-RNAプライマーおよびL-RNAテンプレート(図6C)と組み合わせ、クロスキラルリガーゼと反応させた。反応の過程でサンプルをPAGEで分析し、蛍光/燐光ゲルスキャナーを使用して画像化し、テンプレートによってコードされたハンマーヘッドリボザイムのL-RNAバージョンの合成を実証しました(図6D)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> 図3:トリヌクレオチド5'-三リン酸の精製 (A)DNAトリヌクレオチドトリデオキシアデノシン(AAA、青)およびトリデオキシシチジン(CCC、赤)のトリリン酸化のPAGE分析(UVバックシャドーイングによって視覚化)は、マイナーな副産物を視覚化するために意図的に過負荷をかける。5'-三リン酸生成物(ppp)および5'-ヒドロキシル(OH)出発物質の両方を切除し、MALDI-MSによって同定した。(B)L-RNAトリヌクレオチドGAAのトリリン酸化の分取PAGEを、主要産物バンドを切除し、ESI-MSによって5ʹ-三リン酸(ppp)として同定した。(C)(A)からの脱保護後の粗反応生成物及び(D)精製品のMALDI−MS。5ʹ-三リン酸(ppp;pppAAAは1,119Da、観測値1,118Da;pppCCCは1,047Da、観測値1,046Da);5ʹ-二リン酸(pp)、5'-一リン酸(p)、5'-ヒドロキシル(OH)、および5'-H-ホスホネート(Hp)が標識されている。(e)(B)から単離された5'−三リン酸生成物の直接注入ESI−MSからのデコンボリューションマススペクトル、標識された同定されたピークを有する(予想1,181.6Da、観測された1,181.0Da)。5ʹ-二リン酸(pp)生成物も観察され、三リン酸生成物と二リン酸生成物(+22Da)の両方のナトリウムイオンピークも観察される。一般的な汚染物質ピークは、アスタリスクでラベル付けされています。比較を容易にするために、マススペクトルは各スペクトルで測定された最も高い強度に正規化され、その値に対する百分率として報告される。略語: PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;MALDI-MS = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化;ESI-MS = エレクトロスプレーイオン化質量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> 図4:6 ntおよび14 nt D-RNAオリゴヌクレオチド三リン酸の分析RP-LCである。 (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹおよび(B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ.タンデムESI-MSは、両方の主要なピーク(〜70%)を5'-三リン酸(ppp)と同定し、5'-二リン酸(pp)の量が少ない。略語:RP-LC=逆相液体クロマトグラフィー;nt = ヌクレオチド;ESI-MS = エレクトロスプレーイオン化質量分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> 図5:化学合成またはインビトロ転写によって調製されたオリゴヌクレオチド5ʹ-三リン酸基質の比較(A)自己複製リボザイムEは、RNA Aおよび5'-トリリン酸化RNA Bを連結する。 (B)合成(白丸)またはインビトロ転写(塗り丸)のいずれかで、10μM Aおよび10μM Bを用いた自己複製反応の比較。(B)データはロジスティック成長方程式に当てはまりました:[E] = a / (1 + b e-ct)、ここでaは最終収率、bはシグモイシティの程度、cは指数関数的な成長率です。2つの反応の成長率は1.14時間-1で同じでしたが、合成Bの反応では最終範囲が10%高かった<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">ため、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> 図6:リボザイムによるクロスキラルL-RNA重合(A)L-RNAの鋳型依存的ライゲーションを触媒するD-RNA 27.3tポリメラーゼリボザイム。(b)27.3tで合成されたL-RNA産物がハンマーヘッドエンドヌクレアーゼモチーフの一部を形成している。3tで触媒されるL-RNA重合は、ビオチン化L-RNA鋳型(茶色)、末端標識L-RNAプライマー(マゼンタ)、および4つのL-RNAトリヌクレオチド三リン酸(シアン)を用いて、合成的に調製した。(D)(B)の伸長産物のPAGE分析は、4時間および24時間における、全長産物(黒点)までの各トリヌクレオチドの組み込みを示す。未反応のL-RNAプライマーは、参照マーカーとして含まれる。略語: PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;M = 参照マーカー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

オリゴヌクレオチド5'-三リン酸は、必須の生物学的経路におけるユビキタス成分であり、バイオテクノロジー用途での使用が増加している。ここでは、標準的な自動合成技術によって調製されたオリゴヌクレオチドから出発して、オリゴヌクレオチド5'-三リン酸の日常的な合成および精製のための技術について述べる。

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

三リン酸化は、生物学におけるRNAの遍在的な5'修飾であり、バイオテクノロジー用途でますます使用されている。ここで概説するプロトコールは、標準的な自動合成によって調製された任意のオリゴヌクレオチドの5'トリリン酸化を可能にする。化学的三リン酸化は、RNA、DNA、または非天然核酸を含むオリゴヌクレオチドで作用する。ここで、生体D-RNAの鏡像異性体であるトリリン酸化左巻きL-RNAは、合成精製され、リボソーム反応に用いられる。トリリン酸化は、自動オリゴヌクレオチド合成後および脱保護前に行われる。これらの手順はここでは示されていませんが、研究者は両方の標準的な方法に精通している必要があります。まず、リン酸化のためのワークスペースに少なくとも2本のラインを備えたガスマニホールドがあり、三リン酸化反応はアルゴン下で実行する必要があるため、調整可能な圧力で乾燥アルゴン源に接続されたバブラーがあることを確認してください。次に、1ミリリットルのプラスチックシリンジをラインに取り付けて、反応装置への接続を容易にします。次に、1ミリリットルのプラスチックシリンジ、三方ポリプロピレン活栓、ノンコアリングニードル、1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブ、小さな金属ヘラを含む機器を集め、使用前に少なくとも1日間、室温で乾燥剤を入れた密閉容器またはデシケータに保管してください。アルゴン圧下で、密閉ボトルから30ミリリットルの無水1,4-ジオキサンを抜き取る。乾燥した30ミリリットルのガラス瓶に移し、乾燥トラップを加える。ゴムセプタでシールし、乾燥剤と一緒にデシケーターに保管してください。同様に、30ミリリットルのN,N−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジオキサン3部およびピリジン1部の混合物を体積基準で調製する。原稿に記載されているように、固体トリブチルアンモニウムピロホスフェートとジメチルホルムアミドおよびトリブチルアミンを30ミリリットルのガラス瓶に入れて混合してTBAP溶液を調製する。3 つの描画トラップを追加します。アルゴンの下にゴム製の隔壁でボトルを密封し、アルゴンで30分間泡立てます。DNA/RNA自動合成機を用いて合成カラム上で遊離の5'ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドを調製した後。乾燥した1ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外してチャンバーを準備します。はさみまたはカミソリの刃でシリンジの上部を切り取り、シリンジを合成カラムに取り付けます。シリンジの上部に、三方活栓を取り付け、活栓の上部入口が試薬注入口として機能するように、活栓の側面入口をバブラーで乾燥アルゴン源に取り付けます。このオペレータをクランプ付きのスタンドに固定し、すべての上流ジョイントをワックスシーリングフィルムでシールします。次に、注入口が閉じられ、装置がアルゴン源に対して開かれるように活栓を調整します。バブラーを閉じ、低圧のアルゴンがアクションチャンバ内を5分間流れるようにします。バブラーを再度開いた後、合成カラムの底部にシリンジを取り付けます。次に、廃シリンジを使用してアルゴンをカラムに繰り返し引き出し、プランジャーを完全に押し込んだ状態でシリンジを取り付け直します。試薬または溶媒を添加するには、針を乾燥アルゴン源に取り付け、試薬または溶媒ボトルの隔壁に挿入し、針をボトルの内容物に浸さないように注意してください。次に、針で乾いたシリンジを組み立て、ボトルの内容物に浸さずに試薬または溶媒ボトルセプタムに挿入します。その後、注射器をアルゴンで満たし、中隔から針を抜き、アルゴンを排出する。シリンジにアルゴンを充填し、もう一度排出した後、アルゴン圧力下でシリンジに必要な量の溶媒または試薬を充填する。アルゴン源が閉じ、注入ポートが開くように活栓を調整します。装置の停止が迅速に調整されたら、充填されたシリンジと針をソースボトルから取り外し、針の側面または先端に付着した溶媒を拭き取ってから、針を注射口に挿入します。続いて試薬をオペレータの抗チャンバーに排出し、針を取り外し、アルゴン源に装置を再度開放しながら注入口を閉じた。すべての液体が廃棄物シリンジに保持されるように、廃液シリンジを使用して、抗チャンバから合成カラムを通って液体を静かに引き出します。次に、溶液をゆっくりと合成カラムに押し戻し、カラムに気泡がないことを確認します。混合または攪拌するには、廃シリンジで溶液をカラム上で静かに上下に引っ張ります。カラムから試薬または溶媒を除去するには、溶液をゆっくりと廃シリンジに引き込みます。溶液の大部分が廃シリンジに渡されたら、アルゴンを通してカラムから残りの溶媒を洗い流します。次に、廃シリンジ接合部の周囲のワックスシールフィルムを除去する。その後、シリンジを取り外し、廃液を捨てる。その後、廃棄物シリンジを新しいドライシリンジと交換し、ジョイントを再シールします。三リン酸化装置を組み立てた後、前に実証したように200マイクロリットルのピリジンジオキサンを抗チャンバーに添加することによって三リン酸化反応を開始する。しかし、まだ合成カラムにサンプルを引っ張らないでください。原稿に記載されているようにSalPClをジオキサンに溶解した後、それを抗チャンバーに加え、乾燥シリンジを用いて合成カラムにロードした。その後、15分間反応させ、前述のように廃シリンジを使用してSalPCl溶液を取り出して廃棄します。SalPCl溶液を除去した直後に、250マイクロリットルのTBAP溶液を抗チャンバーに加え、合成カラムにロードした。前述のように攪拌して20分間反応させ、廃棄します。その後、カラムを0.5ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミド、次いで0.5ミリリットルのアセトニトリルで洗浄し、各添加後に溶媒を除去した。酸化剤溶液を加えた後、それを除去し、図示と同じ手順を用いてカラムをアセトニトリルで再度洗浄し、装置を分解し、5ミリリットルのアセトニトリルでカラムを洗浄した。その後、カラムを乾燥させます。固体支持体からトリリン酸化オリゴヌクレオチドを切断し、原稿に記載されているように標準的なプロトコールを使用して脱保護する。次に、乾燥した脱保護オリゴヌクレオチドを尿素ローディングバッファーに溶解し、摂氏80度に加熱し、次いでポリアクリルアミドゲル上にロードし、25〜35ワットで1〜2時間実行する。ゲル電気泳動の最後に、ゲルプレートを取り出した後、それを分解し、ゲルをポリ塩化ビニルフィルムで包む。次に、254ナノメートルのUV光でバックシャドーイングして製品バンドを特定し、カミソリブレードを使用して主要な製品バンドを切り取ります。切り出したゲルをプラスチックシリンジを通して押し出すか、機械的に押し出して粉砕する。15ヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドの場合、ゲル体積の3倍のヌクレアーゼ自由水に、攪拌または振とうしながら少なくとも12時間溶出させる。次いで、溶液を0.2マイクロメートルフィルターを取り付けたシリンジに通すことによって固体ゲル片を除去し、凍結乾燥によって濃縮する。濃縮後、使い捨てサイズ排除カラムを使用して残留塩および敬礼を除去し、先に実証したように凍結乾燥によって濃縮する。原稿に記載されているようにポリメラーゼリボザイムとL-RNAプライマー鋳型と三リン酸トリヌクレオチドを含むRNA溶液を10マイクロリットル調製した後、PCRサーモサイクラーで1分間90°Cに加熱し、毎秒0.2°Cで23°Cに冷却してアニールする。RNA溶液を摂氏17度でインキュベートした後、反応が進行するにつれて開始緩衝液の2倍の濃度の10マイクロリットルを加えて反応を停止し、10マイクロリットルのアリコートを取り、pH8で5マイクロリットルの0.5モルEDTAでクエンチし、各サンプルを処理してRNAを単離する原稿に記載されているように。沈殿したRNAを10マイクロリットルのホルマリゼーションゲルローディングバッファーに溶解し、本文に記載されているように未反応末端標識プライマーを調製した。サンプルの準備ができたら、摂氏80度に加熱します。各ウェルに5マイクロリットルのサンプルをロードし、ゲルを40ワットで約40分間実行します。ゲルプレートをスタンドから取り出した後、蛍光または燐光ゲルスキャナーを使用してスキャンし、交差キラルL-RNA伸長産物を視覚化します。ゲル精製後、UVバックシャドーイングは、AAAおよびCCC DNA三量体およびGAA L-RNA三量体について示されるように、単一の主要生成物としての5'三リン酸の存在を明らかにする。5'ヒドロキシル側生成物は、しばしばより遅い遊走バンドとして見え、DNA三量体の質量分析によって単離され同定された。ゲル精製中の追加のバンドは、未精製反応生成物の質量分析において、5'二リン酸、一リン酸、およびH-ホスホネート副生成物と相関する。5'三リン酸生成物は、5'ジおよび一リン酸塊と共に5'三リン酸に対応する一次質量ピークを示す。化学的に三リン酸関連L-RNAトリヌクレオチドを、PAGEで分析したRNA重合反応においてL-RNAプライマーおよびL-RNAテンプレートと共に使用し、蛍光ゲルスキャナーを用いて画像化した。黒丸でマークされた拡張生成物は、テンプレートによってコードされたハンマーヘッドリボザイムのL-RNAバージョンの合成を実証した。三リン酸化中に水にさらされると、収率が低下します。乾燥試薬を調製し、反応装置を慎重に組み立てるための手順に従ってください。シールの破損を避けるために、装置内の流体をゆっくりと移動させます。化学的三リン酸化は、左利きRNAを含む非生物学的オリゴヌクレオチド三リン酸を調製するために不可欠である。これにより、生物学に見られるRNA分子の鏡像バージョンのクロスキラルリボザイム合成が可能になりました。

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

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Bioengineering

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