Name: 滑膜関節バイオメカニクス、メカノバイオロジー、物理調節の研究のための摩擦試験バイオリアクター装置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ摩擦試験バイオリアクター装置を用いた滑膜関節のバイオメカニクスとメカノバイオロジー評価法。生体軟骨と滑膜の機械的・生物学的応答を解析し、関節健康維持の新たな戦略開発に貢献します。

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この研究は、整形外科科学研究財団、NIH 5R01 AR068133、NIH TERC 5P41EB027062、およびNIGMS R01 692 GM083925(Funder ID:10.13039/100000057)の支援を受けた。

著者らには開示するものは何もありません。

軟骨が圧縮力、引張力、および剪断力、ならびに静水圧および浸透圧44,45にさらされるため、関節内に動的機械的環境が存在する。軟骨は関節の主な耐荷重組織であるが、滑膜はまた、軟骨表面および組織が折り畳まれる領域におけるそれ自体との摩擦相互作用を受ける。軟骨と滑膜との間の物理的相互作用は、細胞を転移させ、間葉系幹細胞を関節環境に放出する原因である可能性が高く、(限られた)関節軟骨修復機構に寄与する潜在的な細胞源を提供する37,38,39,40。軟骨と滑膜の両方の摩擦特性は、組織の摩耗による関節の維持と変性に重要な意味を持つ13。関節の恒常性と疾患の進行の原因となる機械的および機械的および機械的プロセスを研究するために、相互の...

変形性関節症(OA)は、3200万人以上の米国成人が罹患する衰弱性変性関節疾患であり、医療費および社会経済的費用は165億ドルを超えています1。この疾患は、古典的には、関節軟骨および軟骨下骨の分解によって特徴付けられてきた。しかし、滑膜炎がOAの症状および進行に関連しているため、滑膜への変化は最近高く評価されている2,3,4。原発性(特発性)OAでは、加齢に伴う正常な「摩耗と涙」は、軟骨がその耐荷重および潤滑機能を維持する能力を阻害する。関節軟骨層の長時間の摺接またはインプラント材料に対する軟骨の摺接によって生じる応力は、表面下疲労破壊5、6による層間剥離摩耗を促進することが示されている。関節7,8内に動的機械的環境が存在するため、関節軟骨と滑膜の摩擦相互作用は、組織レベルの摩耗および細胞メカノトランスダクションを介して関節の恒常性に影響を与え得る。これらの機械的および機械的プロセスを研究するために、圧縮荷重および摩擦荷重5,6,9,10,11,12,13を厳密に制御して、関節の動きを再現する装置が設計されている。
本プロトコルは、生体組織外植体の接触面に相互の平行移動運動および圧縮荷重を送達する摩擦試験装置を記載する。コンピュータ制御デバイスにより、各テストの所要時間、加えられた負荷、平行移動ステージの可動域、および平行移動速度をユーザーが制御できます。このデバイスはモジュール式で、組織オンティッシュ(軟骨オン軟骨および滑膜オン軟骨)やティッシュオンガラスなど、さまざまなカウンターフェースのテストが可能です。試験者によって得られた機能的測定値に加えて、組織および潤滑浴成分は、所与の実験レジメンによって付与される生物学的変化を評価するために、試験の前後に評価することができる。
軟骨トライボロジーの研究は何十年も前から行われており、軟骨とガラスおよび軟骨上の軟骨との間の摩擦係数を測定するためにいくつかの技術が開発されてきた14,15。異なるアプローチは、関心のあるジョイントおよび/または潤滑機構によって動機付けられる。実験変数の制御と生理学的パラメータの反復との間にはしばしばトレードオフがある。振り子スタイルのデバイスは、1つのジョイント面が第2のサーフェス14,16,17,18上で自由に平行移動する単純な振り子の支点として無傷のジョイントを利用する。無傷の関節を使用する代わりに、摩擦測定は、軟骨外植体を所望の表面14、19、20、21、22、23、24、25上にスライドさせることによって得ることができる。報告された関節軟骨の摩擦係数は、動作条件に応じて広い範囲(0.002〜0.5)にわたって変化している14,26。回転運動23,27,28を複製する装置が作成されている。Gleghorn et al.26は、Stribeck曲線解析を用いて軟骨潤滑プロファイルを観察するためのマルチウェルカスタム摩擦計を開発し、平らなガラスのカウンターフェースに対して軟骨間に線形振動摺動運動を適用した。
この装置は、摩擦応答を単離し、様々な負荷条件下での生体組織の機械生物学を探索することを目的としている。この装置は、純粋な転がり運動における抵抗が関節軟骨29の測定された摩擦係数に対して無視できるという理解のもとに、転がり運動と摺動運動の両方を近似することができる圧縮摺動による関節関節をシミュレートする単純化された試験セットアップを採用している。もともと関節軟骨9の摩擦応答に対する間質液加圧の影響を研究するために構築されたこの試験機は、軟骨10の表面ゾーンを除去する摩擦効果、滑液11の潤滑効果、軟骨摩耗仮説5、6、30、滑膜オン組織摩擦測定13などのトピックを探求するために使用されてきました。.摩擦試験バイオリアクターは、無菌条件下で摩擦実験を行うことができ、摩擦力が生きている軟骨および滑膜のメカノ生物学的応答にどのように影響するかを探る新しいメカニズムを提供する。この設計は、二節骨関節に関連する適用された生理学的負荷に応答して生きている関節組織の物理的調節を研究するための生物模倣バイオリアクターとして使用することができる。
この研究は、さまざまな接触応力および異なる潤滑浴における滑膜軟骨摩擦試験の構成を提示する。ほとんどの関節の関節表面積は、かなりの程度まで、滑膜組織31である。滑膜対軟骨摺動は一次耐荷重面では起こらないが、2つの組織間の摩擦相互作用は依然として組織レベルの修復および細胞メカノトランスダクションに重要な意味を持つ可能性がある。滑膜の内膜層上に存在する線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)は、流体誘発性剪断応力32に応答するメカノ感受性であることが以前に示されている。ストレッチ33、34 および流体誘起剪断応力35 がFLS潤滑剤製造を調節することも実証されている。そのようなものとして、滑膜と軟骨との間の直接摺動接触は、滑膜内の常駐細胞に別の機械的刺激を提供し得る。
滑膜摩擦係数に関する報告はごくわずか31,36件公開されている。Estellら13は、生物学的に関連するカウンターフェイスを利用して、以前の特徴付けを拡大しようとした。摩擦試験装置の生体組織検査能力により、関節関節中の生理学的組織相互作用を模倣し、滑膜細胞機能に対する接触せん断応力の役割と、滑膜と軟骨のクロストークへの寄与を解明することができる。後者は、関節炎および傷害後の滑膜関節炎症の媒介に関与している。軟骨が滑膜および滑液に物理的に近接しているため、軟骨は軟骨形成を含む多能性能力を示す滑膜細胞を含み、滑膜細胞は軟骨の恒常性において役割を果たし、関節表面に生着することによって修復することが仮定される。この文脈において、軟骨−滑膜および滑膜−滑膜の物理的接触および相互剪断は、軟骨損傷の領域への滑膜細胞のアクセシビリティを増加させ得る37、38、39、40。滑膜と軟骨の配置を利用した研究は、関節総組織力学とトライボロジーに関する洞察を提供するだけでなく、関節の健康を維持するための新しい戦略にもつながる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>アルミホイル</td><td>レイノルズグループホールディングス</td><td>レイノルズラップ</td><td>滅菌組織収穫</td></tr><tr><td>アルミフレームアクリルエンクロージャ</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>摩擦試験機部品</td></tr><tr><td>オートクレーブ可能なインスタントシーリング滅菌ポーチ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>01-812-54</td><td>工具の滅菌</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>バクストン</td><td></td><td>工具</td></tr><tr>の滅菌<td>ビーカー (250 mL)</td><td>Pyrex Vista</td><td>70000</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>ベタジン (ポビドン ヨウ素調製液)</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093906</td><td>滅菌ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>Labconco</td><td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 BSC</td><td>Sterile tissue harvest</td></tr><tr><td>Biospy punch</td><td>Steritool Inc.</td><td>50162</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>ボックスカッター</td><td>アメリカンセーフティカミソリ</td><td>カンパニー94-120-71</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>サーキュラーアクリルシリコンポスト(滑膜)</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>培養培地</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>DMEM(カタログ番号11-965-118;Gibco) に 50 &mu;g/mL L-プロリン (Cat.番号P5607;シグマ)、100 &mu;g/mL ピルビン酸ナトリウム (Cat.番号S8636;シグマ)、1% ITS(Cat.番号354350;コーニング)、および1%抗生物質&ndash;抗真菌薬(Cat.No. 15-240-062, Gibco)</td></tr><tr><td>シアノアクリレート(ロックタイト420クリア)</td><td>ヘンケル</td><td>135455</td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>デッドウェイト</td><td>オーハウス</td><td></td><td>ノーマルロード</td></tr><tr><td>エタノール200プルーフ</td><td>デコンラボ株式会社</td><td>2701</td><td>70 %に希釈</td></tr> 固定<tr><td>ベース</td><td>ThorLabs, Inc.</td><td>SB1T</td><td>摩擦試験機用</td></tr><tr><td>部品 鉗子(滑膜採取)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11019-12</td><td>組織採取</td></tr><tr><td>用鉗子(滑膜装着)</td><td>エクセルタ</td><td>3C-S-PI</td><td>組織装着</td></tr><tr><td>水平リニアエンコーダ(並進ステージ用)</td><td>RSF Electronics, Inc.</td><td>MSA 670.63</td><td>摩擦試験機コンポーネント、システム分解能1 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>ホットグルーガン&グルー</td><td>FPC Corporation</td><td>Surebonder Pro 4000A</td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>LabVIEW&nbsp; 2010</td><td>摩擦試験プログラム</td></tr><tr><td>ロードセル</td><td>JR3社</td><td>20E12A-M25B</td><td>摩擦試験機コンポーネント; 0.0019 lbs 分解能 (x&y、0.0038ポンドの解像度(z)</td></tr><tr><td>ローディングプラテン</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>Oリング</td><td>パーカー</td><td>S1138AS568-009</td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (60mm)</td><td>ファルコン</td><td>351007</td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>PivotLokワークポジショナー(脛骨ホルダー)</td><td>インダストリーデポ、ピボットロック</td><td>PL325</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>取り外し可能なベース</td><td>ThorLabs, Inc.</td><td>SB1B</td><td>摩擦試験機部品</td></tr><tr><td>リングスタンド</td><td></td><td></td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>メス刃</td><td>株式会社ハベルズ</td><td>FSC22</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>No. 4</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>ドライバー</td><td>ヴェラ</td><td>3334</td><td>ティッシュハーベスト</td></tr><tr><td>ステージ</td><td>JMAR</td><td></td><td>摩擦試験機</td></tr><tr><td>ステッピングモーター</td> (<td>株) オリエンタルモーター</td><td>PK266-03B</td><td>摩擦試験機部品</td></tr><tr><td>サクションツール</td><td>Virtual Industries, Inc.</td><td>PEN-VAC 真空ペン</td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>サポートロッド</td><td>オーダーメイド</td><td></td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-09</td><td>ティッシュマウント</td></tr><tr><td>滑液(ウシ)</td><td>Animal Technologies, Inc.</td><td></td><td>摩擦試験浴</td></tr><tr><td>試験浴</td> プロテアーゼ阻害剤を含む<td>カスタムメイド</td><td></td><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS):0.04%イソチアゾロン塩基殺生物剤(Proclin 950 Cat.番号46878-U;Sigma)および0.1%プロテアーゼ阻害剤 - 0.05 Mエチレンジアミン四酢酸、EDTA(Cat.番号0369;Sigma)</td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>Sterile culture</td></tr><tr><td>垂直リニアエンコーダ(ローディングステージ用)</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A</td><td>摩擦試験機コンポーネント; 20 nm</td></tr><tr><td>分解能 ボイスコイルアクチュエータ</td><td>H2W Technologies</td><td>NCC20-15-027-1RC</td><td>摩擦試験機コンポーネント</td></tr></tbody></table>

滑膜関節バイオメカニクス、メカノバイオロジー、物理調節の研究のための摩擦試験バイオリアクター装置

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

原発性変形性関節症(OA)では、加齢に伴う正常な「摩耗と涙」は、軟骨がその耐荷重および潤滑機能を維持する能力を阻害し、有害な物理的環境を助長する。関節軟骨と滑膜の摩擦相互作用は、組織レベルの摩耗および細胞メカノトランスダクションを介して関節の恒常性に影響を与える可能性がある。これらの機械的および機械的プロセスを研究するために、関節の動きを複製することができる装置が記載されている。摩擦試験装置は、2つの接触する生物学的対向面への相互平行移動運動および通常の荷重の送達を制御する。この研究は滑膜軟骨構成を採用し、摩擦係数測定はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または滑液(SF)浴中で実施された試験のために提示される。試験は、高負荷下でのSFの潤滑特性を強調し、接触応力の範囲に対して実施された。この摩擦試験装置は、二節骨関節関節に関連する適用された生理学的負荷に応答して生きている関節組織の物理的調節を研究するための生体模倣バイオリアクターとして使用することができる。

滑膜軟骨上の構成を、若年ウシ外植体の摩擦試験に使用した。滑膜は、内膜層が下層の軟骨と接触するように、直径10mmのアクリルローディングプラテンに取り付けられた。軟骨対面として脛骨帯を用いた(図6A)。脛骨ストリップは、約1.4mmの深さおよび10mm x 30mmのサイズで切断された。サンプルを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)浴またはウシ滑液(SF)浴中で37°Cで1時間試験した。SF浴は、PBSとウシSFの50/50混合物から構成されていた。ステージ加速度は100mm/s2、ステージ速度は1mm/s、ステージパス距離は2.5mm6,9,42であった。デッドウェイトを使用してさまざまな法線荷重を適用し、180、230、および300 kPa11,43の接触応...

本プロトコルは、接触する2つの生物学的対向面に同時に相互摺動および通常の荷重を加える摩擦試験装置を記載する。

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

従来、私たちは摩擦係数を計算するために非生体組織を研究するためにテスターを使用してきましたが、生体組織をテストし、生物学的相互作用を評価するためのテスターの能力を大幅に拡大しています。摩擦試験装置は、生体組織外植体の接触面に相互の平行移動運動と圧縮荷重を供給します。このデバイスはモジュール式で、さまざまな生物学的カウンターフェースのテストが可能です。この方法は、摩擦力が生きている軟骨および滑膜の機械的および機械的生物学的応答にどのように影響するかについての洞察を提供し、関節の健康を維持するための新しい戦略につながる可能性がある。幼いウシ滑膜を収穫することから始めます。メス刃を用いて、滑膜関心領域の輪郭をなぞる。鉗子を使用して、滑膜の一端をつかみ、滑膜遠位を下層の骨まで伸ばすように静かに持ち上げます。メス刃を使用して骨から滑膜を除去し、組織を適切な培養培地または試験浴溶液に入れる。その後、調節可能なホルダーに脛骨を固定することによって、若年ウシ軟骨を収穫する。軟骨表面との接触を避けながら、半月板を慎重に取り除きます。脛骨高原の外縁で、ボックスカッターを使用して軟骨に対して垂直に骨に向かって切断します。軟骨を完全に切り取って、まっすぐな縁または側面を作ります。余分な組織を取り除きます。外側の端で、ボックスカッターを使用して、骨と軟骨の間の界面にきれいな切断を行います。プラトー表面から脛骨ストリップを取り外すには、カットの下にマイナスドライバーを静かに挿入し、軟骨下骨から関節軟骨を緩めるように静かに回転させます。サンプルが緩んだら、軟骨ストリップが骨から外れるまでドライバーをゆっくりと前方に押します。ドライバーが軟骨ではなく骨に向かって押し込まれていることを確認します。ボックスカッターを使用して、脛骨プラトー表面を切断し、所望のサイズおよび厚さの長方形サンプルを生成する。組織を適切な培養培地または試験浴溶液に入れる。脛骨帯を底面のカウンターフェースとして使用する場合は、取り外し可能な磁気ベースを取り外し、直径60mmのシャーレを取り外し可能なベースの上面に接着します。シャーレを所定の位置に接着した状態で、取り外したベースを固定ベースに取り付け、ペトリ皿にスライド方向を示すマークを付けます。少量のシアノアクリレートを皿の中央に塗ります。脛骨帯をステージのスライド方向に合わせます。軟骨ストリップを皿に静かに押し付けます。取り外し可能な磁気ベースを摩擦試験機の対になった固定ベースに復元します。ペトリ皿に目的の試験浴溶液を満たします。滑膜を上部のカウンターフェースとして使用する場合は、摩擦試験機からローディングプラテンとサポートロッドを取り外します。滑膜を円形プラテンの上に置きます。滑膜を固定するには、Oリングをその円周上に広げます。鉗子を使用して、滑膜を静かに引っ張り、組織をOリングの下に張り、平らに伸ばします。余分な組織を外科用はさみでトリミングします。ローディングプラテンとサポートロッドを摩擦試験機に復元します。滑膜が底部のカウンターフェースの上に浮かび上がり、試験浴に沈むように、ローディングプラテンの垂直高さを調整します。取り付けた試料を摩擦試験装置に挿入します。アナログデータビルドMF DAQを開きます。プログラムでロード PID を初期化し、動的呼び出し元 Windows をトリガーします。アナログデータビルドMF DAQを実行し、実行ボタンを押してロードPIDウィンドウを初期化します。[動的呼び出し元のトリガー] ウィンドウの [ステッパー] タブに移動します。ユーザー入力ボックスで、翻訳ステージの加速度、速度、および距離を指定します。テスト期間を入力するには、[時間状態]テーブルの右下にある[フォルダを開く]ボタンをクリックし、[ステッパー時間インデックス]ファイルパスを選択します。次に、[ボイスコイル]タブでテスト期間をもう一度指定します。[時間状態]テーブルの右下にある[フォルダを開く]ボタンをクリックしてボイスコイルインデックスファイルパスを選択し、ファイルを選択します。これは、ボイスコイルを使用するかどうかにかかわらず実行する必要があります。通常の荷重を適用します。デッドウェイトを使用する場合は、ローディングプラテンの上にあるリニアベアリングに目的のウェイトを置きます。加えられた荷重にローディングプラテンとサポートロッドの重量を加えたものが、ロードセル定格容量を超えないようにしてください。[ファイルへの権利] ボックスの右側にある [フォルダーを開く] ボタンを使用して、データ ストレージのパスとファイル名を選択します。ファイルを txt 拡張子で保存します。下部のカウンターフェイスを上部のカウンターフェイスの下に中央に配置し、これをゼロ X 位置として設定します。これを行うには、[実行] ボタンを押して [動的呼び出し元のトリガー] ウィンドウを実行します。ステッパータブでホームボタンをクリックして、ステージを最後に保存したゼロX位置に移動します。対向線が整列していない場合は、緑色の左右矢印ボタンをクリックしてステージを移動します。目的の位置に達したら、ゼロボタンをクリックして、現在のステージ位置を新しいゼロX位置として保存します。「動的呼び出し元のトリガー」ウィンドウを停止するには、「停止」ボタンをクリックします。上部と下部のカウンターフェースが中央に配置されたら、ステージの周期的な動きを開始して、サンプルの摩擦試験を開始します。ステージが動いたら、ゆっくりと上部のカウンターフェイスを下部に接触させます。テストを実行し、摩擦テストデータを収集します。希望の試験期間が経過したら、停止ボタンを押し、上部のカウンターフェースを持ち上げて下部のカウンターフェースと接触しないように移動して、試験片をアンロードしてテストを停止します。カスタムコードを使用して、サイクルごとの摩擦係数とヒステリシスを計算します。1 つのフォルダーにすべての関連ファイルが含まれていることを確認します。摩擦サイクルの実行を開きます。m ファイルです。スクリプトの [実行] ボタンをクリックします。分析する生データファイルと目的の保存場所を選択します。摩擦係数プロットとヒステリシスプロットはMATLABによって出力されます。滑膜オン軟骨構成を使用して、滑膜が下層の軟骨と接触するように、滑膜が直径10ミリメートルのアクリルローディングプラテンに取り付けられた幼若ウシ外植体を摩擦試験した。軟骨カウンターフェースとして脛骨ストリップを使用した。各往復サイクルにわたるFTの平均をFNで割った値から実効摩擦係数を計算し、試験期間に対してプロットして摩擦係数対時間プロットを得ました。各試験について、摩擦係数値を試験全体にわたって平均化した。PBS試験槽では、接触応力が増加するにつれて平均摩擦係数値が増加しました。逆に、平均摩擦係数値は、ウシ滑液浴中で接触応力が増加するにつれて類似したままであった。サーフェスを接触させる前に、荷重データの収集を開始することを忘れないでください。これにより、適切な風袋荷重を計算できます。組織および潤滑浴成分は、所与の実験レジメンによって付与される生物学的変化を評価するために試験の前後に評価することができる。

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