昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

昆虫病原性線虫を維持および増幅するための効率的なプロトコールは、線虫病原性および宿主抗線虫免疫の分子基盤を理解するために不可欠である。このプロトコルにより、昆虫宿主であるガレリア・メロネラを使用して、共生性および軸索性ヘテロラブディティス・バクテリオフォラおよびスタイネルネマ・カルポカプサエIJを大量に産生することができます。まず、ペトリ皿をろ紙で覆い、約10〜15匹のガレリアメロネラ幼虫を追加します。

ピペットを使用して、懸濁液10マイクロリットルあたり約25〜50匹の感染性幼体を含む2ミリリットルの水をワックスワームに分配する。そして、ペトリ皿を室温でキャビネットに保管する。ろ紙の水分に応じて、2日ごとに1〜2ミリリットルの水を加えます。

感染性幼体に感染したワックスワームは、通常48時間以内に死亡する。ワックスワームが感染性幼体に感染してから約10日後にホワイトのウォータートラップを準備します。死んだ昆虫を濾紙の浸されていない部分に慎重に移す。

水道水を使用して底のペトリ皿を満たし、換気用のスペーサーとして15ミリリットルのチューブのキャップを置きます。線虫の凝集を避けるために、脱塩水または脱イオン水の代わりに水道水を使用し、ウォータートラップ内の水位がペトリ皿の高さの約半分に達するようにしてください。小さなペトリ皿の水が線虫のために濁ったら、ピペットを使用して新世代の感染性幼体をT25またはT75細胞培養フラスコに移動します。

その後、40%の容量まで、または適切な密度に達するまで水道水を追加します。線虫の鬱血を避けるために細胞培養フラスコを水平に保管した。感染性幼若体を細胞培養フラスコに移し、感染性幼若体が昆虫の死骸から出現しなくなるまで水を加えて約3〜5日で繰り返す。

接種ループを使用して、Photorhabdus temperata Ret16の凍結培養物のいくつかのフレークをMacConkeyプレート上にこすり取り、単一コロニーのストリークをスジする。プレートを摂氏28度で2〜3日間インキュベートします。インキュベーション後、10ミリリットルのLBブロスに50ミリリットルのチューブでマッコンキー寒天上のコロニーを接種し、振とうインキュベーター内で摂氏28度で一晩培養物をインキュベートする。

インキュベーション後、一晩培養物を50ミリリットルのチューブから新しい微量遠心チューブに移し、次いで、100マイクロリットルの単強度PBSで一晩培養物を100マイクロリットルの遠心分離により洗浄し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブ中で、17,900倍gで洗浄する。上清をデカントする。次に、培養物を単強度PBSで10倍に希釈し、チューブを氷上に放置する。

次に、ワックスワームを70%エタノール溶液に浸します。ペーパータオルで昆虫を乾燥させた後、50ミリリットルのチューブに入れます。チューブを氷の上に20分間置き、ワックスワームを固定化する。

ろ紙を使用して、ペトリ皿の上半分と下半分を覆います。ろ紙で覆われたシャーレの蓋を注射用のベースサポートとして使用します。底のペトリ皿のろ紙にしっとりとし、注入されたワックスワームが回復するのを助けるために氷の上に移します。

パラフィルム片に50マイクロリットルの氷冷細菌をピペットで固定し、22ゲージのリファイナーニードルシリンジを用意し、プランジャーを静かに押して針の先端の空気を除去します。ワックスワームをステレオスコープの下の後端に近づける。細菌培養物を胸郭の背側に注入する。

好ましくは、ワックスワームに平行なキューティクルのすぐ下の2つのセグメント間の接合部で、内部損傷を最小限に抑え、幼虫の体がどのように膨らみ始めるかに注意を払う。次に、注入した昆虫を回収シャーレに移す。そして、すべての昆虫が注入され、回収皿に入れられたら、ペトリ皿を暗闇の中に置きます。

ワックスワームは注射の2日後に屈服し、約3〜4日後にレンガのように赤く見えます。しかし、茶色の昆虫は細菌感染が失敗したことを示している。感染後7日で、特徴的なレンガ - 赤色の昆虫をペトリ皿に並んだ新鮮なろ紙に移し、共生線虫感染性幼体の産生を繰り返す。

表面滅菌を開始するには、遠心分離によって十分な共生性、ヘテロ横紋炎バクテリオフォラおよび候補のアキセン感染性幼体を収集する。1.5ミリリットルの遠沈管でペレットを作るには、各微量遠心管のペレットに500マイクロリットルの5%漂白剤を加え、チューブを反転させます。10分間インキュベートした後、17, 900回gで1分間遠心分離し、上清を除去した。

次いで、ペレットを1ミリリットルの滅菌水で洗浄する。それを遠心分離し、上清を取り除き、この手順をさらに4回繰り返す。グラフは、軸索化を経たヘテロラブディティス・バクテリオフォラ線虫の状態を評価した結果を示す。

ストック培養物からのヘテロラブディティス・バクテリオフォラは、共生フォトラブドゥス・ルミネッセンス細胞を運んだ。しかし、それらに関連するPhotorhabdus luminescens細菌を欠いた線虫は、軸索性であった。実験の再現性を維持するために、常に新鮮なコロニーからの細菌ストック培養物から新鮮なストリークを行い、静止した顔に到達する前に一晩培養物を取り出します。

レンガレッドのガレリアワックスワームをホワイトのウォータートラップにのみ使用し、残りを捨ててください。この手順の後、線虫を使用して昆虫免疫系との相互作用を調べることができる。この技術は、研究者が線虫寄生および宿主抗線虫免疫の分子基盤を探索するための道を開く。