Name: 昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ昆虫病原性線虫の培養と増殖法。Heterorhabditis bacteriophoraやSteinernema carpocapsaeをGalleria mellonella宿主で効率的に増殖させ、線虫の病原性と宿主免疫応答の分子基盤を研究する基盤となる手法です。

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ジョージワシントン大学生物科学部のメンバーに、原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。すべてのグラフィカルな図はBioRenderを使用して作成されました。I.E.、J.H.、D.O'H.の研究研究室は、ジョージワシントン大学とコロンビア芸術科学大学によって支援されており、資金と学際的な研究資金を促進しています。

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<li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus%2FPhotorhabdus+occupy+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).</li>
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</ol>

著者らは、競合する利益を宣言していない。

昆虫病原性線虫感染および昆虫抗線虫免疫の分子基盤を理解するには、相互に関連する細菌から寄生虫を分離することが必要である13、15、16。昆虫病原性線虫H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプセは、それぞれグラム陰性菌P.ルミネッセンスおよびX.線虫と共に生息する17。両方の細菌種は、昆虫組織を標的とし、感染中の自然免疫系に対抗することによって病原性を付与する因子をコードすることが以前に示されている18,19。これは、線虫が昆虫宿主と相互作用するように進化した戦略を特定する努力を妨げる。したがって、感染プロセスにも関与する線虫成分の遺伝子ノックダウンによる同定および機能的特徴付けは、軸索虫の発生によって促進され得る。ここ...

昆虫病原性線虫(EPN)に関する研究は、主に統合された害虫管理戦略におけるこれらの寄生虫の有用性と基本的な生物医学研究への関与のために、過去数年間で強化されています1,2。最近の研究では、感染プロセスのさまざまな段階で活性化される線虫の遺伝的成分を調べるためのモデル生物としてEPNが確立されています。この情報は、宿主の生理機能を変え、昆虫の自然免疫応答を不安定化させるために寄生虫によって分泌される分子の性質と数に関する重要な手がかりを提供します3,4。同時に、この知識は、昆虫宿主免疫シグナル伝達経路の種類と、病原体の侵入と拡散を制限するために調節する機能に関する新しい詳細によって一般的に補完される5,6。これらのプロセスを理解することは、EPNとその昆虫宿主との間の動的相互作用の両側を想像するために不可欠です。EPNと昆虫の宿主関係をよりよく理解することは、間違いなく哺乳類寄生線虫との同様の研究を促進し、ヒト免疫系を妨げる感染因子の同定および特徴付けにつながる可能性がある。
EPN線虫ヘテロラブディティス属およびSteinernema sp.は広範囲の昆虫に感染することができ、その生物学は以前に激しく研究されてきた。2つの線虫寄生虫は、ヘテロラブディティスが自己受精し、Steinernemaが両生繁殖を起こして生殖様式が異なるが、最近S. hermaphroditumは雌雄同体の自己受精または単為生殖を介して繁殖することが示された7,8,9。ヘテロラブドリティスとスタイナーネマ線虫のもう一つの違いは、グラム陰性菌の2つの異なる属、フォトラブダスとキセノラブドゥスとの共生的相互主義であり、これらは両方とも昆虫の強力な病原体である。これらの細菌は、EPNの自由生活および非摂食感染性幼若(IJ)段階で発見され、感受性宿主を検出し、昆虫ヘモコエルにアクセスし、そこで急速に複製する関連細菌を放出し、昆虫組織に定着する。EPNとその細菌の両方が、昆虫の防御を武装解除し、恒常性を損なう病原性因子を産生する。昆虫の死に続いて、線虫IJは成体EPNになり、そのライフサイクルを完了するために発達する。昆虫の死体内の食糧不足と過密化に対応して形成されたIJの新しいコホートは、適切な宿主9,10,11,12を狩るために土壌中に最終的に出現する。
ここでは、EPN線虫を維持、増幅、および遺伝的に操作するための効率的なプロトコルが記載されている。特に、このプロトコールは、共生性H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプサエIJの複製、軸索線虫IJの生成、マイクロインジェクションのためのH.バクテリオフォラ雌雄同体の生産、dsRNAの調製、およびマイクロインジェクション技術を概説する。これらの方法は、線虫病原性および宿主抗線虫免疫の分子基盤を理解するために不可欠である。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>VWR</td><td>97062-244</td><td></td></tr><tr><td>アンビオン メガスクリプト T7 キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>611770250</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T25</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>156367</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T75</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>チョイスTaq マスターミックス</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>C775Y42</td><td></td></tr><tr><td>コーンオイル</td><td>VWR</td><td>470200-112</td><td></td></tr>コーン<tr><td>シロップ</td><td>MPバイオメディカル/ VWR</td><td>IC10141301</td><td></td></tr><tr><td>培養チューブ10mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-14</td><td></td></tr>エ<tr><td>ッペンドルフフェムトチップスマイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ 50 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>フェムトジェット マイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5252000021</td><td></td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>VWR</td><td>28320-100</td><td></td></tr><tr><td>ガレリア・メロネラ・ワックス ペ</td><td>トコ</td><td>ガラス</td><td></td></tr> <tr><td>カバースリップ</td> フィ<td>ッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-553-464</td><td>50 x 24 mm</td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 700</td><td>シグマ</td><td>H8898</td><td></td></tr>接<tr><td>種ループ</td><td>VWR12000-806</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>VWR97062-956</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クウィックフィルホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B100F-3</td><td>1.0</td></tr><tr><td>mm LB寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1425-500</td><td>LB寒天ミラー粉末500</td></tr><tr><td>g LBブロ</td><td>スフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1426-500</td><td>LB ブロス ミラー パウダー 500 g</td></tr><tr><td>ライカ DM IRB 倒立研究用顕微鏡</td><td>顕微鏡 セントラル</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>マッコンキー ミディアム</td><td>ミリポア シグマ</td><td>M7408-250G</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 転写クリーンアップ キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>76332-064</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>ニードルシリンジ</td><td>VWR</td><td>BD305155</td><td>22G</td></tr><tr><td>栄養ブロス</td><td>ミリポアシグマ</td><td>70122-100G</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>仕切られたペトリ皿</td><td>VWR</td><td>490005-212</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>97062-732</td><td>バッファー PBS 錠剤バイオテクノロジーグレード 200タブ</td></tr><tr><td>PCRプライマー</td><td>アゼンタ</td><td>・</td><td></td></tr><tr><td>ペストル</td><td>ミリポア・シグマ</td><td>BAF199230001</td><td>ベルアート 使い捨てペストル</td></tr><tr><td>ペトリ皿 6cm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 x 15 mm</td></tr><tr><td>ペトリ皿 10 mm</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>プロテオース・ペプトン #3</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出</td>物<td>ミリポアシグマ</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

ヘテロラブディティス属およびSteinernma属の昆虫病原性線虫は、土壌に生息する昆虫の義務性寄生虫である。それらのライフサイクルの主な特徴は、それぞれ細菌PhotorhabdusおよびXenorhabdusとの相互主義的な関連である。線虫寄生虫は、適切な昆虫宿主を見つけて侵入し、昆虫の免疫応答を覆し、効率的に増殖して、感染する新しい昆虫の獲物を積極的に狩る次世代を作り出すことができる。そのライフサイクルの特性のために、昆虫病原性線虫は、破壊的な農業害虫を防除するために殺虫剤と組み合わせて使用される一般的な生物学的防除剤である。同時に、これらの寄生性線虫は、線虫病原性および宿主抗線虫応答を分析するための研究ツールを表す。この研究は、感染中の線虫分泌分子の役割を理解するための遺伝学的技術およびトランスクリプトーム的アプローチの最近の開発によって支援されている。ここでは、昆虫病原性線虫の維持および遺伝子ノックダウン手順の使用に関する詳細なプロトコルが提供される。これらの方法論は、昆虫病原性線虫感染因子の機能的特徴付けをさらに促進する。

軸索化を経た H.バクテリオフォラ 線虫の状態を評価するために、IJsにおける P.ルミネッセンス 細菌コロニーの有無を決定した。これを行うために、以前に表面滅菌され、PBS中で均質化された約500のIJのペレットが収集された。陽性対照処置は、共生 P.ルミネッセンス 細菌を含む線虫培養物からの約500個のIJのペレットから成っていた。軸索化線虫および陽性対照線虫のペレットを1x PBS中でホモジナイズした。ホモジネートを寒天上にピペットで処理し、個々のコロニーの成長を促進するために広げた。寒天プレートを28°Cで24時間インキュベートした。翌日、 P.ルミネッセンス コロニー(CFU)の発生は観察されなかった。予想通り、ストック培養 物からのH.バクテリオフォラは 共生 P.ルミネセセン細胞 を運んだ。しかし、関連する P. luminecens 属細菌を欠いた線虫は軸索性であり、将来の実験のために別々に保存された(図6)。
<p class=...

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

昆虫病原性線虫を維持および増幅するための効率的なプロトコールは、線虫病原性および宿主抗線虫免疫の分子基盤を理解するために不可欠である。このプロトコルにより、昆虫宿主であるガレリア・メロネラを使用して、共生性および軸索性ヘテロラブディティス・バクテリオフォラおよびスタイネルネマ・カルポカプサエIJを大量に産生することができます。まず、ペトリ皿をろ紙で覆い、約10〜15匹のガレリアメロネラ幼虫を追加します。ピペットを使用して、懸濁液10マイクロリットルあたり約25〜50匹の感染性幼体を含む2ミリリットルの水をワックスワームに分配する。そして、ペトリ皿を室温でキャビネットに保管する。ろ紙の水分に応じて、2日ごとに1〜2ミリリットルの水を加えます。感染性幼体に感染したワックスワームは、通常48時間以内に死亡する。ワックスワームが感染性幼体に感染してから約10日後にホワイトのウォータートラップを準備します。死んだ昆虫を濾紙の浸されていない部分に慎重に移す。水道水を使用して底のペトリ皿を満たし、換気用のスペーサーとして15ミリリットルのチューブのキャップを置きます。線虫の凝集を避けるために、脱塩水または脱イオン水の代わりに水道水を使用し、ウォータートラップ内の水位がペトリ皿の高さの約半分に達するようにしてください。小さなペトリ皿の水が線虫のために濁ったら、ピペットを使用して新世代の感染性幼体をT25またはT75細胞培養フラスコに移動します。その後、40%の容量まで、または適切な密度に達するまで水道水を追加します。線虫の鬱血を避けるために細胞培養フラスコを水平に保管した。感染性幼若体を細胞培養フラスコに移し、感染性幼若体が昆虫の死骸から出現しなくなるまで水を加えて約3〜5日で繰り返す。接種ループを使用して、Photorhabdus temperata Ret16の凍結培養物のいくつかのフレークをMacConkeyプレート上にこすり取り、単一コロニーのストリークをスジする。プレートを摂氏28度で2〜3日間インキュベートします。インキュベーション後、10ミリリットルのLBブロスに50ミリリットルのチューブでマッコンキー寒天上のコロニーを接種し、振とうインキュベーター内で摂氏28度で一晩培養物をインキュベートする。インキュベーション後、一晩培養物を50ミリリットルのチューブから新しい微量遠心チューブに移し、次いで、100マイクロリットルの単強度PBSで一晩培養物を100マイクロリットルの遠心分離により洗浄し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブ中で、17,900倍gで洗浄する。上清をデカントする。次に、培養物を単強度PBSで10倍に希釈し、チューブを氷上に放置する。次に、ワックスワームを70%エタノール溶液に浸します。ペーパータオルで昆虫を乾燥させた後、50ミリリットルのチューブに入れます。チューブを氷の上に20分間置き、ワックスワームを固定化する。ろ紙を使用して、ペトリ皿の上半分と下半分を覆います。ろ紙で覆われたシャーレの蓋を注射用のベースサポートとして使用します。底のペトリ皿のろ紙にしっとりとし、注入されたワックスワームが回復するのを助けるために氷の上に移します。パラフィルム片に50マイクロリットルの氷冷細菌をピペットで固定し、22ゲージのリファイナーニードルシリンジを用意し、プランジャーを静かに押して針の先端の空気を除去します。ワックスワームをステレオスコープの下の後端に近づける。細菌培養物を胸郭の背側に注入する。好ましくは、ワックスワームに平行なキューティクルのすぐ下の2つのセグメント間の接合部で、内部損傷を最小限に抑え、幼虫の体がどのように膨らみ始めるかに注意を払う。次に、注入した昆虫を回収シャーレに移す。そして、すべての昆虫が注入され、回収皿に入れられたら、ペトリ皿を暗闇の中に置きます。ワックスワームは注射の2日後に屈服し、約3〜4日後にレンガのように赤く見えます。しかし、茶色の昆虫は細菌感染が失敗したことを示している。感染後7日で、特徴的なレンガ - 赤色の昆虫をペトリ皿に並んだ新鮮なろ紙に移し、共生線虫感染性幼体の産生を繰り返す。表面滅菌を開始するには、遠心分離によって十分な共生性、ヘテロ横紋炎バクテリオフォラおよび候補のアキセン感染性幼体を収集する。1.5ミリリットルの遠沈管でペレットを作るには、各微量遠心管のペレットに500マイクロリットルの5%漂白剤を加え、チューブを反転させます。10分間インキュベートした後、17, 900回gで1分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、ペレットを1ミリリットルの滅菌水で洗浄する。それを遠心分離し、上清を取り除き、この手順をさらに4回繰り返す。グラフは、軸索化を経たヘテロラブディティス・バクテリオフォラ線虫の状態を評価した結果を示す。ストック培養物からのヘテロラブディティス・バクテリオフォラは、共生フォトラブドゥス・ルミネッセンス細胞を運んだ。しかし、それらに関連するPhotorhabdus luminescens細菌を欠いた線虫は、軸索性であった。実験の再現性を維持するために、常に新鮮なコロニーからの細菌ストック培養物から新鮮なストリークを行い、静止した顔に到達する前に一晩培養物を取り出します。レンガレッドのガレリアワックスワームをホワイトのウォータートラップにのみ使用し、残りを捨ててください。この手順の後、線虫を使用して昆虫免疫系との相互作用を調べることができる。この技術は、研究者が線虫寄生および宿主抗線虫免疫の分子基盤を探索するための道を開く。

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Research

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線虫は通常、固形寒天プレート上で増殖させ、または液体培養で大腸菌を接種されている大腸菌 。毒物および栄養研究交絡からの細菌の副生成物を防ぐために、我々はダウンストリームのアプリケーションの範囲のためのワームを大量に成長し、同期させるために、無菌液体培地、CeHRを利用した。...

培養線虫（Caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

昆虫病原性線虫、昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する回虫です。それぞれ、土壌サンプル、感染昆虫死体から線虫の回復のために、昆虫苦しませると変更されたホワイトトラップ：我々は2つ​​の技術を使用した土壌からこれらの線虫を分離するために使用されるサンプリング方法を示しています。...

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。...

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。...

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。...

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

野生 のカエノルハブディティス...

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア...

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル種の1つですが、ほとんどすべての研究は、その自然に関連する微生物の不在下で行われています。ここで説明する方法は、将来の機能的 C.エレガンス...

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

本稿では、昆虫病原性線虫(EPN:昆虫寄生)線虫であり、新たな遺伝モデルである Steinernema hermaphroditum におけるCRISPR-Cas9媒介ゲノム工学を実証しています。この技術は変異体の作成に有用であり、相利共生および寄生共生に関連する線虫生物学の遺伝子機能の解明を可能にします。...

CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

私たちは、生物殺虫剤として昆虫病原性線虫を大量増殖させるための農家向けの2つの方法を提案します。最初の方法はポリアクリルアミドゲルを線虫培養基質として使用し、2つ目はポリマーコーティングされた綿を培養基質として使用します。いずれの方法も昆虫死体内で線虫の生 体内...

昆虫病原性線虫の栽培者ベース in vivo 増殖

学ぶ昆虫病原性線虫の培養と増殖法。Heterorhabditis bacteriophoraやSteinernema carpocapsaeをGalleria mellonella宿主で効率的に増殖させ、線虫の病原性と宿主免疫応答の分子基盤を研究する基盤となる手法です。

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

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