セプチンの超微細構造組織、膜再形成、および曲率感度挙動をアッセイするためのボトムアップ インビトロ 法

このプロトコルを使用して、さまざまな曲率を示すパターン基板上の細胞骨格糸状タンパク質の構成を視覚化しました。曲率感度をテストできます。走査型電子顕微鏡画像の解像度は、ナノメートルスケールの組織を可視化するのに十分な高さです。

固定に使用する方法は、タンパク質の構造内組織を維持するのに十分穏やかです。これは、細胞骨格フィラメントの挙動を理解するための基礎研究の範囲に残っています。まず、250ナノメートルの振幅と2マイクロメートルの横方向の周期性の波状のポリジメチルシロキサンのうねりパターンから、クリーンルーム環境で波状のノーランド光学接着剤(NOAレプリカ)を設計します。

これを行うには、直径1センチメートルの円形ガラスカバースリップに5マイクロリットルの液体NOAを堆積させ、PDMSテンプレートをドロップに置きます。アセンブリを320ナノメートルのUV光で5分間処理して、液体NOAを光重合して薄いポリマーフィルムにします。完了したら、重合したばかりのNOAでカバースリップからPDMSテンプレートをそっと剥がします。

エアプラズマクリーナーを使用してNOAフィルムを5分間処理し、表面を親水性にします。原稿に記載されているように、小さな単層小胞、またはSUVの溶液を調製し、溶液が透明になるまで5〜10分間浴超音波処理器で超音波処理下の観察バッファーに乾燥した脂質フィルムを再懸濁することによってSUVを得る。その後、NOAパターンを支持するカバースリップを細胞培養ボックスのウェル内に挿入し、新たに発光したNOAパターンを1ミリリットルあたり1ミリグラムの100マイクロリットルのSUV溶液で室温で30分間インキュベートして、支持された脂質二重層を生成します。

融合していないSUVを取り除くには、2回の洗浄の間にサンプルを完全に乾燥させることなく、セプチン減塩バッファーで側面を6回完全にすすぎます。オクトマーセプチンストック溶液をセプチン低塩緩衝液で最終濃度(10〜100ナノモル、容量1ミリリットル)に希釈します。次に、スライド上のタンパク質溶液を室温で1時間インキュベートします。

融合した担持脂質二重層を含むNOAスライドを洗浄し、タンパク質をセプチン低塩緩衝液でインキュベートします。セプチン低塩緩衝液を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2%グルタルアルデヒド固定液に置き換え、摂氏37度に予熱し、反応を15分間進行させ、固定サンプルを0.1モルのカコジル酸ナトリウムでそれぞれ5分間3回洗浄します。洗浄後、四酸化オスミウムの固定液中でサンプルをインキュベートし、次に濾過したタンニン酸、そして最後に濾過した酢酸ウラニルをそれぞれ10分間インキュベートする。

すべての溶液の後に蒸留水でサンプルを3回洗浄します。サンプルをエタノール溶液中で50%から100%まで2〜3分間連続してインキュベートします。エタノールをあらかじめ充填した臨界点乾燥機内にスライドガラスを移し、製造元の指示に従って乾燥させます。

乾燥したサンプルは吸水性が高いため、カバースリップをスタブに取り付けてすぐにコーティングしてください。次に、ペイントデグロメットを作成せずに、カバースリップの上面に銀色のペイントのストリップを追加します。スタブとの接続が適切であることを確認してください。

サンプルが完全に蒸発したら、プラズママグネトロンスパッタリングヘッドと回転遊星ステージを備えた装置を使用し、メーカーが提供する標準プロトコルに従います。120ミリアンペアで60秒間プレスパッタリングを行い、表面の酸化物層を除去します。次に、1.5ナノメートルのタングステンを90ミリアンペア、作動距離50ミリリットルの膜厚モニターで堆積させます。

その後、SEM分析まで、およびSEM分析全体を通して周囲空気から保護するために、サンプルを真空下に保管します。内陸検出器で二次電子を検出して高溶液イメージングを実現するには、加速電圧を3キロボルト、ビーム電流を20マイクロメートルの開口部に設定します。観測には、ピクセルあたり21.25ナノメートルからピクセルあたり1.224ナノメートルの範囲の解像度を使用します。

データ分析には、ピクセルあたり 5.58 ナノメートルの解像度を使用します。作動距離は、高解像度の観察には1〜2ミリメートル、被写界深度を増やす必要がある場合は約3ミリメートルに設定します。スキャン速度とライン積分を継続的に調整して、画像あたり約30〜45秒の取得時間で一定の信号対雑音比を確保します。

代表的な分析は、1.5ナノメートルの白金と1.5ナノメートルのタングステンを含む波状のPDMSパターンに対するセプチンフィラメントに堆積した材料の影響を示しています。裸の巨大な単層小胞、またはGUV、完全に球形であることが観察されました。セプチン誘発変形後、小胞はファセット状に見え、変形は静的なままであったため、変動しませんでした。

より高い濃度のセプチンでは、小胞の周期的な変形が観察された。大きな単層小胞(LUV)に結合したセプチンフィラメントの自己組織化をクライオ電子顕微鏡画像で調べ、傾斜した系列から3D再構成が得られました。セプチンフィラメントの曲率依存配置を走査型電子顕微鏡によって視覚化した。

低倍率では、負および正の曲率の周期性を有する波状のパターンが見えた。セプチンフィラメントの超微細構造組織は、より高い倍率で見られた。劣化を防ぐために、NOAはそっと剥がす必要があります。

イメージング後、フィラメント間隔やフィラメントの向きなど、SCMによって視覚化された超構造の特徴を定量化するために、いくつかの画像解析を実行できます。この方法はセプチンに適用されていますが、他の細胞骨格タンパク質や長いフィラメントとして組織化して曲率に敏感なタンパク質にも使用できます。