マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する
2022年5月5日
我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。
蛍光顕微鏡とマイクロフルイディクスを組み合わせて、アクチン結合タンパク質がアクチンフィラメントの集合と分解をどのように調節するかを研究しています。マイクロフルイディクスを使用すると、生化学的および機械的条件を正確に制御しながら、数十の個々のアクチンフィラメントで同時に起こっている反応を定量化することができます。溶液は、最初にチャンバに到達するまで並列に注入され、次に、フィラメントは圧力設定を変更することによって各溶液に順次さらされることに注意してください。
ポリジメチルシロキサンまたはPDMS、チャンバーアセンブリの調製を開始するには、ホットプレートを摂氏100度に予熱する。清潔なペトリ皿のクリーニングされたPDMSチャンバー1つとガラスカバースリップ1つを、深いUVクリーナーで3〜5分間紫外線にさらします。完了したら、PDMSチャンバをカバースリップの上に置き、UVに直接さらされた2つの表面が接触するようにします。
PDMSカバースリップ界面に閉じ込められた気泡を除去するには、チャンバの表面を指で静かに押します。コーナーと側面を強く押して、チャンバーの天井がガラス表面に接触しないようにします。ガラス底をホットプレートに向け、100°Cで5分間チャンバーを置きます。
その後、すぐにチャンバーを使用するか、清潔なペトリ皿に1週間保管してください。入口チューブと出口チューブをすすぎ出すには、2ミリリットルのリザーバチューブ1本に300マイクロリットルのFバッファーを充填し、マイクロ流体ホルダーにねじ込み、圧力を300ミリバールに設定します。5~8滴のFバッファを無駄にしてから、圧力をゼロに設定し、各チャンネルについてこの手順を繰り返します。
次に、リザーバチューブ上の出口の圧力を4〜50ミリバールに設定し、チューブ先端から液滴が出たら、チューブをPDMSチャンバの出口に接続する。液体がチャンバを満たし、すべての入口から出てくるので、出口圧力を20ミリバールに設定します。その後、リザーバチューブの圧力を1〜50ミリバールに設定します。
気泡を入らないようにするには、チューブを入口に接続する前に、チューブと PDMS 入口から液滴が出ていることを確認してください。入口の圧力を 30 ミリバールに設定します。図のように入口 2 つと 3 つを接続した後、すべての入口の圧力を 20 ミリバールに設定し、出口圧力をゼロ ミリバールに設定します。
流入口の流量がほぼ等しいことを確認します。リザーバを変更するときは、すべての入口圧力を 12 ミリバール、出口圧力を 5 ミリバールに設定します。溶液を迅速に注入するには、対応する入口の圧力を150ミリバールに設定し、他の入口の圧力を約100ミリバールに調整して、入口の流量が毎分500ナノリットルになるようにする。
溶液を変更するには、新しいリザーバチューブに200〜300マイクロリットルの溶液を充填し、圧力を変更設定に設定します。次に、入口のリザーバチューブのネジを緩めます。チューブ先端に小さな液滴が形成されたら、新しいチューブを新鮮な溶液でねじ込み、圧力設定を高流量に変更します。
マイクロ流体構成とチャンバー形状に応じて、溶液がチューブに充填されてチャンバーに到達するまで3〜5分間待ちます。このプロセスは、経時的な蛍光の増加を測定することによって続くことができる。表面官能化のために、溶液3をFバッファー中の50ピコモルスクスペクトルアクチン種子の200マイクロリットルに変更し、高流量3個で溶液を2分間注入する。
表面不動態化のために、チューブ3をFバッファー中の300マイクロリットルの5%BSAと交換し、次いで、高流量3で5分間注入し、続いて、中流3で5分間、チャネル1および2において7〜8ミリバールの減圧下で、毎分100ナノリットルのカウンターフローを得る。チャンバ表面全体がBSA不動態化される。チューブ3をFバッファーに変更し、高流量3で5分間チャネルをすすぎます。
その後、原稿で説明したように、チューブをそれぞれ1マイクロモルアクチンプロフィリン、0.15マイクロモルアクチン、およびFバッファーで1〜3本交換し、調製したばかりの溶液を、3〜4分間プリセットされたハイフローオールを使用して注入する。顕微鏡の電源を入れ、カメラの露光時間を100~200ミリ秒、励起レーザーを10~20%のパワー、全反射蛍光(TIRF深度)を200~300ナノメートルに調整して、60倍の対物レンズで画像をキャプチャします。次に、圧力設定をミッドフロー1本に設定して10分間、20秒毎に1フレームの速度でフィラメント重合を記録し、続いてミッドフロー2本を15分間フィラメントエージングする。
落射蛍光モードで解重合を5秒毎に1フレームで捕捉し、1〜2フレーム後に、3つの中流に切り替えて、毎秒約10サブユニットで解重合するフィラメントを記録する。実験をリセットするには、蛍光標識されたすべてのフィラメントを、最大出力でレーザーに2分間連続的に露光して切断します。溶液1、2、または3を交換し、高流量で3〜4分間注入することにより、さまざまな条件をテストします。
ここでは、基本的な重合/解重合実験の結果を示します。得られたキモグラフを用いて、重合速度および解重合速度を定量した。成長したアクチンフィラメントを蛍光標識コフィリン溶液に曝露すると、コフィリンクラスターは有核化され、尖った有刺鉄線の端部および有刺鉄線の端に向かって成長した。
単一のフィラメントがファシンにさらされると、それらはより明るく見え、流れと完全には整列していないバンドルを形成する。チューブを交換するときにシステムに気泡を導入しないようにし、リザーバチューブを空にしないように注意することが非常に重要です。この技術は、数十本の単一フィラメントに引っ張り力を適用し、ホルミンとコフィリンの機械的感度、ARP2/3脱枝を見るために不可欠でした。
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概要
この研究は、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで観察するために、蛍光顕微鏡とマイクロ流体力学を組み合わせたプロトコルを提示します。この方法により、異なるタンパク質溶液にフィラメントを順次さらすことができ、アクチン結合タンパク質の研究を促進します。
研究の主要な構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生物物理学
背景
- アクチンフィラメントは細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。
- アクチンダイナミクスの理解は様々な生物学的機能への洞察に不可欠です。
- マイクロ流体力学は実験条件の正確な制御を可能にします。
- 蛍光顕微鏡は分子間相互作用のリアルタイム観察を可能にします。
研究の目的
- アクチン結合タンパク質がアクチンフィラメントの組立と解体をどのように制御するかを調査すること。
- 複数のアクチンフィラメント上で同時に起こる反応を定量化すること。
- 実験中の生化学的および機械的条件を制御すること。
使用した方法
- 蛍光顕微鏡とマイクロ流体力学の組み合わせ。
- アクチンフィラメントを異なるタンパク質溶液に順次さらす。
- マイクロ流体力学アッセイ用のPDMSチャンバーの準備。
- アクチンフィラメントダイナミクスのリアルタイムモニタリング。
主な結果
- 様々な条件下での個々のアクチンフィラメントのモニタリングに成功。
- 異なるアクチン結合タンパク質の効果の定量化。
- アクチンダイナミクスの研究におけるマイクロ流体力学の有用性の実証。
- アクチンフィラメント制御のメカニズムへの洞察。
結論
- マイクロ流体力学と蛍光顕微鏡の組み合わせはアクチンフィラメントの研究に効果的です。
- この方法はアクチンダイナミクスの制御に関する貴重な洞察を提供します。
- 今後の研究では、これらの方法を基に他のタンパク質相互作用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of actin filament assembly and disassembly under controlled microfluidic conditions enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation. This approach provides high-resolution, real-time data on protein interactions, supporting predictive confidence in cytoskeletal modulation strategies. Integration of microfluidics and fluorescence microscopy advances the portfolio's ability to interrogate actin-binding protein function with precision and reproducibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of actin-binding protein effects on filament dynamics at single-filament resolution.
- Supports mechanistic de-risking by isolating biochemical and mechanical variables in real time.
- Facilitates functional target validation through quantitative measurement of polymerization and depolymerization rates.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of cytoskeletal regulatory pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible conditions for evaluating compound or protein effects on actin dynamics.
- Generates quantitative outputs such as kymographs for robust comparison across experimental conditions.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of actin modulators.
- Enables rapid solution exchange and multiplexed testing within a single microfluidic chamber.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro actin dynamics with disease-relevant cytoskeletal processes when supported by downstream models.
- Provides continuity from molecular mechanism to preclinical validation of actin-targeting agents.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying protein function and interaction specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidics-based fluorescence microscopy method fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling precise hypothesis testing and pathway clarification for actin-regulating targets.
- Discovery Biology: Quantifies actin filament assembly/disassembly in response to defined protein exposures, supporting mechanistic insight.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for evaluating actin-binding protein modulators.
- Analytics: Outputs kymographs and rate measurements for robust statistical comparison of experimental variables.
- Translational Research: Lays groundwork for linking molecular mechanism to disease-relevant cytoskeletal phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for repeated interrogation of diverse actin-regulating proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in actin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes experimental conditions and enables high-throughput, reproducible data collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by clarifying target engagement and function.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of actin-modulating candidates for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics setup and fluorescence microscopy operation.
- Needs access to pressure-controlled microfluidic systems and high-resolution imaging platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization of solution preparation and flow parameters.
- Adaptation across different actin-binding proteins or model systems may require protocol optimization.
- Attention to technical caveats such as air bubble avoidance and chamber preparation is critical for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Polydimethylsiloxane (PDMS) Chamber Assembly
1:45
Connect Microfluidic Device
3:11
Configuring the Setup with Standard Flow Rates and Changing Solution
4:21
Basic Single Filament Experiment: Adenosine Diphosphate (ADP)-Actin Barbed End Depolymerization
6:45
Results: Polymerization of Actin Filaments from Spectrin-Actin Seeds when Exposed to Different Actin Binding Proteins
7:24
Conclusion
