Name: マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶマイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を組み合わせた手法で、アクチン結合タンパク質がアクチンフィラメントのアセンブリと分解を制御するメカニズムをリアルタイムで解析する方法です。

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B.ラドゥーとR.-M.に感謝しています。彼らのUVクリーナー装置の使用のためのMègeラボ、およびJ. Heuvinghと0。デュ・ルーレは、シリコンウェーハ上の金型の準備とマイクロ流体学のヒントの提供について受けた初期トレーニングを受けました。我々は、欧州研究評議会グラントStG-679116(A.J.へ)及びAgence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin(G.R.-L.)からの資金提供を認める。

<ol><li>Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li>
<li>Jégou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).</li>
<li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li>
<li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963(2019).</li>
<li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+phosphate+release+from+Arp2%2F3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li>
<li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li>
<li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li>
<li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li>
<li>Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883(2013).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li>
<li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li>
<li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li>
<li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li>
<li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsional+stress+generated+by+ADF%2Fcofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li>
<li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548(2021).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li>
<li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li>
<li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li>
<li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li>
<li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Le Clainche, C., Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+motility+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).</li>
<li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470(2016).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li>
<li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li>
<li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li>
</ol>

著者は利益相反がないと宣言しています。

アクチンフィラメントが長さに沿って複数の点によって表面に固定されるか、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤によって表面の近くに維持される標準的なシングルフィラメント法と比較して、マイクロフルイディクスは多くの利点を提供する。表面との相互作用は最小限であるため、これらの相互作用が伸長および解重合の両方の間に誘発し得る人工的な一時停止は回避される。フィラメントは流れによって互いに平行に整列され、それらの監視と長さの測定が容易になります。フィラメントの周りの溶液は常に更新され、一定のタンパク質濃度にさらされます。フィラメントが露出している異なるタンパク質溶液を迅速に(<1秒、 図3D、E)切り替えることができるため、速度論的研究に役立つことが多い時間制御された逐次実験を実行できます。最後に、フィラメント上の流動溶液によって加えられる粘性抗力を利用して、フィラメントに制御された機械的応力を加えることができる(「代表的な結果」セクション)。適度な流体の流れ(Mid Flow 圧力設定)は、フィラメントを表面(〜2...

アクチンフィラメントおよびアクチンフィラメントネットワークの組み立ておよび分解は、いくつかの生化学反応によって制御され、機械的文脈に依存する。これらの複雑なメカニズムについての洞察を得るためには、個々のフィラメント上の個々の反応を(十分に多数で)観察できることは非常に貴重です。過去数十年にわたり、主に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を用いた動的アクチンフィラメントのリアルタイム観察は、重要な技術として浮上し、バルク溶液生化学的アッセイ1では得られなかった結果の印象的なリストを提供してきました。
これを達成するには、蛍光標識されたアクチンフィラメントを顕微鏡カバースリップの表面近くに維持し、蛍光標識も可能なアクチン結合タンパク質(ABP)の溶液にさらす必要があります。そうすることで、適切に制御された生化学的条件下で個々のフィラメントで起こっている事象を監視し、反応速度を定量化する手段が提供されます。ただし、いくつかの特定の制限を考慮する必要があります。フィラメントを表面近くに人為的に維持することは、しばしば複数のアンカーポイントのおかげで、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤を使用することによって、それらの挙動を変えることができる(例えば、それらの重合および解重合の一時停止を引き起こす2)。各フィラメントの輪郭を追跡することは、特に新しいフィラメントまたはフィラメントの断片が時間の経過とともに視野に蓄積する場合、困難な場合があります。反応は有限の体積で起こり、アクチンモノマーおよびABPの濃度は時間の経過とともに変化する可能性があり、正確な速度定数を導出することが困難になる可能性があります。最後に、ABPの溶液を更新または変更することは、30秒未満で達成することは困難であり、しばしばサンプル中の不均一なタンパク質含有量につながる。
10年以上前、個々のデオキシリボ核酸(DNA)鎖3を研究するためにすでに行われたことに触発されて、個々のアクチンフィラメント4を観察および操作するためのマイクロフルイディクスに基づく新しい技術を導入しました。これにより、古典的なシングルフィラメント技術の前述の制限を回避することができます。これらのマイクロフルイディクスアッセイでは、アクチンフィラメントは、カバースリップに吸着されたスペクトリンアクチン種子から成長させる。したがって、フィラメントは、マイクロ流体チャンバの底部にのみ一端によって固定され、固着することなく表面上で変動する。フィラメントは入ってくる溶液の流れと整合するため、輪郭の長さの監視が容易になり、TIRFを使用できるカバースリップの上の浅い領域に維持されます。異なる溶液は混合することなく同時にチャンバに流され、フィラメントは逐次的かつ迅速にそれらに曝され得る。
ここでは、ラボでシングルアクチンフィラメントマイクロフルイディクスアッセイを設定するための一連の基本的なプロトコルを提案します。カバースリップとマイクロフルイディクスチャンバーは事前に(半日で)準備することができ、いくつかの生化学的条件をテストできる実験自体は1日未満で行われます。

<table><tbody><tr><td>&beta;-カゼイン</td><td>メルク</td><td>C6905</td> 8 <td>mg/mL で使用</td></tr><tr><td>生検パンチ (プランジャー付き)</td> <td>テッド ペラ</td><td>15115-2</td><td>ID 0.75 mm、OD 1.07 mm</td></tr><tr><td>ビオチン-BSA</td><td>メルク</td><td>A8549</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>で使用 BSA</td><td>メルク</td><td>A8022</td><td>50 mg/mL で使用</td></tr><tr><td>カバースリップ ミニラック テフロンホルダー</td><td>Invitrogen</td><td>C14784</td><td>for 8カバースリップ</td></tr><tr><td>カバースリップ 22x40mm 厚さ #1.5</td><td>Menzel Gl&auml;ser</td><td>631-1370</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>メルク</td><td>D27802</td><td>fバッファー中の</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-D</td><td>コンポーネント f-バッファー</td></tr><tr><td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td>Lys328 のアクチン標識用フルオロフォア。</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21338</td><td>To biotinylate actin on Lys328</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td>ガラス洗浄洗剤</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>オープンソースソフトウェア</td></tr><tr><td>Laboport</td><td>KNF</td><td>811kn.18</td><td>真空ポンプ (到達真空: 240 mbar)</td></tr><tr><td>マジック インビジブル テープ</td><td>スコッチ</td><td>7100024666</td><td>標準透明オフィステープ</td></tr><tr><td>MicrewtubeSimport</td><td></td><td>T341-6T</td><td>2 mLマイクロ流体リザーバーチューブマイクロ</td></tr><tr><td>流体デバイス パート1:フローユニットS</td><td>Fluigent</td><td>FLU-S-D-PCKB</td><td>流量計</td></tr><tr><td>マイクロ流体デバイス パート2:Fluiwell-4C-2 mL</td><td>Fluigent</td><td>14002001PCK</td><td>リザーバーホルダー</td></tr><tr><td>マイクロ流体デバイス パート3:MFCS-EZ</td><td>フルイジェント</td><td>EZ-11000001 EZ-00345001</td><td>圧力コントローラー</td></tr><tr><td>Model 42 - UVO-Cleaner</td><td>Jelight Inc.</td><td>42-220</td><td>紫外線クリーナー</td></tr><tr><td>N6-(6-アミノヘキシル)-ATP-ATTO-488</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>NU-805-488</td> アクチンニュートラアビジン<td>の標識に使用される ATP-ATTO アクチン</td></tr><tr><td>ニュートラアビジン</td>の標識に使用 <td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td>PBSで1 mg / mLで使用します。</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184シリコンエラストマー</td><td>ダウコーニング</td><td>1673921</td><td>PDMSベースと硬化剤ポリ</td></tr><tr><td>エーテルエーテルケトン(PEEK)チューブ</td>が含まれています <td>メルク</td><td></td><td>Z226661」ブルー": I.D. = 0.25 mm</td></tr><tr><td>安全ブローガン</td><td>コイルホース 空気圧</td><td>700-S</td><td>フィルター付きエア</td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>VWR</td><td>228-0701P</td><td>PEEKをカプラーに接続</td></tr><tr><td>ステンレス製カテーテルカプラー</td><td>Prime Bioscience</td><td>SC22/15</td><td>PDMSの入口と出口に挿入してPEEKチューブに接続</td></tr><tr><td>熱可塑性フィルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PM996</td><td>標準「パラフィルム」</td></tr><tr><td>超高純度エタノール</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄バス</td><td>VWR</td><td>USC200TH</td><td>1 L ビーカーを収容</td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td>PDMS または溶液を脱気します</td></tr></tbody></table>

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

アクチンフィラメントの組み立てと分解を調節する複雑な分子メカニズムを解読するために、よく制御された条件下で個々の反応を監視することは大きな資産です。そのために、過去20年間に全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた生きたシングルフィラメント実験が登場し、重要な結果をもたらしました。2011年には、これらの実験の可能性をさらに広げ、繰り返し発生する問題のあるアーティファクトを回避するために、これらのアッセイに単純なマイクロフルイディクスを導入しました。この研究は、個々のアクチンフィラメントが不動態化されたカバースリップ表面に一端で固定され、流れに整列し、異なるタンパク質溶液に連続的に曝露され得るという、我々の基本的なプロトコルを詳述する。また、特定のアプリケーション向けのプロトコルを提示し、流れる溶液の粘性抗力のおかげで、制御された機械的力を適用する方法について説明します。我々は、これらの実験の技術的注意点を強調し、この技術に基づいて可能な開発を簡単に提示する。これらのプロトコルと説明は、使いやすいマイクロフルイディクス装置の今日の可用性とともに、非専門家がラボでこのアッセイを実施できるはずです。

上記のすべての実験において、蛍光標識されたアクチンフィラメントは、表面からのバックグラウンド蛍光が低いことを示す良好なコントラストで、はっきりと見えるはずです(図4、一般的な問題のトラブルシューティングについては、 補足ファイル1 を参照してください)。アクチンフィラメントはまた、表面にくっついてはならない:支配的な流速が低いとき、アクチンフィラメントの横方向の揺らぎは、それらが生きているのを観察するときに知覚可能でなければならず、それらがそれらの端の1つだけによって固定されていることを明確に決定することを可能にする。同様に、TIRFイメージングを使用する場合、それらの垂直変動は、その長さおよび時間に沿った強度の変化によって見えるべきである。適用される流量に応じて、TIRFによって取得されたアクチンフィラメントの画質を最適化するために、TIRF浸透深さを調整する必要があるかもしれません。
フィラメントを重合条件にさらす場合(セクション8を参照)、フィラメントの伸びは規則的であるべきである(...

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

蛍光顕微鏡とマイクロフルイディクスを組み合わせて、アクチン結合タンパク質がアクチンフィラメントの集合と分解をどのように調節するかを研究しています。マイクロフルイディクスを使用すると、生化学的および機械的条件を正確に制御しながら、数十の個々のアクチンフィラメントで同時に起こっている反応を定量化することができます。溶液は、最初にチャンバに到達するまで並列に注入され、次に、フィラメントは圧力設定を変更することによって各溶液に順次さらされることに注意してください。ポリジメチルシロキサンまたはPDMS、チャンバーアセンブリの調製を開始するには、ホットプレートを摂氏100度に予熱する。清潔なペトリ皿のクリーニングされたPDMSチャンバー1つとガラスカバースリップ1つを、深いUVクリーナーで3〜5分間紫外線にさらします。完了したら、PDMSチャンバをカバースリップの上に置き、UVに直接さらされた2つの表面が接触するようにします。PDMSカバースリップ界面に閉じ込められた気泡を除去するには、チャンバの表面を指で静かに押します。コーナーと側面を強く押して、チャンバーの天井がガラス表面に接触しないようにします。ガラス底をホットプレートに向け、100°Cで5分間チャンバーを置きます。その後、すぐにチャンバーを使用するか、清潔なペトリ皿に1週間保管してください。入口チューブと出口チューブをすすぎ出すには、2ミリリットルのリザーバチューブ1本に300マイクロリットルのFバッファーを充填し、マイクロ流体ホルダーにねじ込み、圧力を300ミリバールに設定します。5~8滴のFバッファを無駄にしてから、圧力をゼロに設定し、各チャンネルについてこの手順を繰り返します。次に、リザーバチューブ上の出口の圧力を4〜50ミリバールに設定し、チューブ先端から液滴が出たら、チューブをPDMSチャンバの出口に接続する。液体がチャンバを満たし、すべての入口から出てくるので、出口圧力を20ミリバールに設定します。その後、リザーバチューブの圧力を1〜50ミリバールに設定します。気泡を入らないようにするには、チューブを入口に接続する前に、チューブと PDMS 入口から液滴が出ていることを確認してください。入口の圧力を 30 ミリバールに設定します。図のように入口 2 つと 3 つを接続した後、すべての入口の圧力を 20 ミリバールに設定し、出口圧力をゼロ ミリバールに設定します。流入口の流量がほぼ等しいことを確認します。リザーバを変更するときは、すべての入口圧力を 12 ミリバール、出口圧力を 5 ミリバールに設定します。溶液を迅速に注入するには、対応する入口の圧力を150ミリバールに設定し、他の入口の圧力を約100ミリバールに調整して、入口の流量が毎分500ナノリットルになるようにする。溶液を変更するには、新しいリザーバチューブに200〜300マイクロリットルの溶液を充填し、圧力を変更設定に設定します。次に、入口のリザーバチューブのネジを緩めます。チューブ先端に小さな液滴が形成されたら、新しいチューブを新鮮な溶液でねじ込み、圧力設定を高流量に変更します。マイクロ流体構成とチャンバー形状に応じて、溶液がチューブに充填されてチャンバーに到達するまで3〜5分間待ちます。このプロセスは、経時的な蛍光の増加を測定することによって続くことができる。表面官能化のために、溶液3をFバッファー中の50ピコモルスクスペクトルアクチン種子の200マイクロリットルに変更し、高流量3個で溶液を2分間注入する。表面不動態化のために、チューブ3をFバッファー中の300マイクロリットルの5%BSAと交換し、次いで、高流量3で5分間注入し、続いて、中流3で5分間、チャネル1および2において7〜8ミリバールの減圧下で、毎分100ナノリットルのカウンターフローを得る。チャンバ表面全体がBSA不動態化される。チューブ3をFバッファーに変更し、高流量3で5分間チャネルをすすぎます。その後、原稿で説明したように、チューブをそれぞれ1マイクロモルアクチンプロフィリン、0.15マイクロモルアクチン、およびFバッファーで1〜3本交換し、調製したばかりの溶液を、3〜4分間プリセットされたハイフローオールを使用して注入する。顕微鏡の電源を入れ、カメラの露光時間を100~200ミリ秒、励起レーザーを10~20%のパワー、全反射蛍光(TIRF深度)を200~300ナノメートルに調整して、60倍の対物レンズで画像をキャプチャします。次に、圧力設定をミッドフロー1本に設定して10分間、20秒毎に1フレームの速度でフィラメント重合を記録し、続いてミッドフロー2本を15分間フィラメントエージングする。落射蛍光モードで解重合を5秒毎に1フレームで捕捉し、1〜2フレーム後に、3つの中流に切り替えて、毎秒約10サブユニットで解重合するフィラメントを記録する。実験をリセットするには、蛍光標識されたすべてのフィラメントを、最大出力でレーザーに2分間連続的に露光して切断します。溶液1、2、または3を交換し、高流量で3〜4分間注入することにより、さまざまな条件をテストします。ここでは、基本的な重合/解重合実験の結果を示します。得られたキモグラフを用いて、重合速度および解重合速度を定量した。成長したアクチンフィラメントを蛍光標識コフィリン溶液に曝露すると、コフィリンクラスターは有核化され、尖った有刺鉄線の端部および有刺鉄線の端に向かって成長した。単一のフィラメントがファシンにさらされると、それらはより明るく見え、流れと完全には整列していないバンドルを形成する。チューブを交換するときにシステムに気泡を導入しないようにし、リザーバチューブを空にしないように注意することが非常に重要です。この技術は、数十本の単一フィラメントに引っ張り力を適用し、ホルミンとコフィリンの機械的感度、ARP2/3脱枝を見るために不可欠でした。

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