Name: 細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた真菌と微生物の細胞レベル相互作用の高解像度観察法。土壌微生物叢の動態解析と持続可能な農業への応用を目指す研究手法です。

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我々は、インペリアル・カレッジ・ロンドンの生物工学科及びレバーハルム・トラスト(研究助成金参照:RPG-2020-352)からの財政的支援を認める。

著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

この記事では、チャネルマイクロフルイディクスを用いた真菌-微生物相互作用の研究のためのプロトコルを提示する。著者らは、これらの装置の汎用性を実証し、研究者の興味に合うように適応させることを目指している。手本となるBFIおよびFFIデバイスを使用して、真菌 - 微生物相互作用を以前にアクセス可能であったよりも詳細に研究することができる。土壌の背景の複雑さと不均一性を取り除き、菌糸が単一の単層に限定されるように成長を緩和し、環境パラメータを厳密に規制することによって、これらの生物学的事象の高解像度画像を経時的にキャプチャすることができます。これらの装置を用いて、微生物パートナー間の相互作用は、増殖速度、蛍光定量化、および形態学的形質の観察バイオイメージングを用いて特徴付けられてきた。
装置は、細胞レベルでの真菌−微生物相互作用の特性評価を可能にするように設計することができる。非専門家のための汎用性と設計の容易さにより、このプロトコルは幅広い研究課題への適応に適しています。BFIおよびFFIデバイスは、透明な性質とガラス結合表面により、実験目的に合わせてさまざまな顕微鏡での使用に適してい...

土壌は、炭素とリンのサイクルに不可欠な微生物を豊富に含む非常に多様な環境です1,2。糸状菌は、有機物および無機物の分解剤として多数の生態系の主要な構成要素であり、共生関係の形成を通じて植物の栄養を高めることができる3,4。土壌内では、真菌は、他の真菌5、細菌6、ウイルス7および線虫8などの多数の微生物と動的に相互作用する。これらの相互作用は、土壌と植物の健康に重大な影響を及ぼします。しかし、相互作用する微生物を高解像度でイメージングできる適切な実験システムがないため、多くは未定義のままです。
細菌-真菌相互作用(BFI)および真菌-真菌相互作用(FFI)に関する研究は、医学における抗菌剤および農業における生物学的防除剤を含む幅広い分野で貴重な用途を有する。例えば、真菌コプリノプシス・シネレアはペプチドコプシンを産生し、これはヒト病原体リステリア・モノサイトゲネス9に対して抗菌活性を示すことが示されている。同様に、真菌由来化合物であるグリセオフルビンは、ヒト真菌感染症の治療薬として広く使用されており、植物病原性真菌Alternaria solani10,11の増殖をさらに阻害することができる。土壌に生息する細菌バチルス・サチルスのいくつかの菌株もまた、真菌性植物病原菌リゾクトニア・ソラニ12、13の有効な生物防除剤であることが実証されている。それにもかかわらず、従来の方法論に関連する制限のために、BFIおよびFFIは単一細胞レベルではあまり理解されていない。
従来の研究では、通常、2種以上の種が対立する寒天プレートを使用して、マクロスケールでBFIおよびFFIを探索します。それらの相互作用は、対峙する種の増殖速度および代謝産物産生を測定することによって評価される14,15,16;しかし、この方法論はコロニーレベルにのみ解決されています。細胞レベルでの相互作用を研究するために、細菌および真菌接種剤を、寒天でコーティングしたガラス顕微鏡スライド上で培養し、次いで顕微鏡17下で画像化することができる。それにもかかわらず、閉じ込められていないため、顕微鏡スライドを使用して単一の菌糸をたどることは困難であり、タイムラプス画像を得るのが難しくなることを意味する。さらに、真菌菌糸体の定義された領域内に他の微生物を空間的に閉じ込めたり、摂動し得る定義された化学的環境を作り出す機会は、例えば、そのようなセットアップでは不可能である。土壌の「ブラックボックス」の性質はまた、単一細胞レベルでの真菌 - 微生物相互作用の研究の複雑さを増す18。土壌マイクロバイオームの信じられないほどの多様性から離れて相互作用する種を観察することによって、個々のメンバーが相互作用する正確な方法を評価することができます。したがって、BFIおよびFFIの高解像度、単一細胞イメージングを可能にする汎用性の高いプラットフォームが引き続き必要とされています。
マイクロ流体技術、いわゆるラボオンチップシステムは、単一細胞レベルでのBFIおよびFFIの研究に理想的なプラットフォームを提供します。マイクロ流体学の分野は、化学分析やマイクロエレクトロニクスのために開発された技術に由来し、生物科学19によって採用されています。マイクロ流体技術は、マイクロメートルスケールで少なくとも1つの次元を有する、小型化されたチャネルのオーダーメイドネットワーク内で少量の流体を調節し、生物学的研究におけるそれらの使用は20拡大している。特に、糸状菌21、22、23、24、25、26、27、28、29、30の生育を調べるためにマイクロ流体デバイスが開発されている。この技術を使用する利点の1つは、菌糸の閉じ込めおよびマイクロチャネル内の栄養素の分布が、従来の寒天法31よりも土壌環境の構造によく似ていることである。最近、マイクロ流体プラットフォームは、ヒト好中球と真菌病原体32、細菌と植物の根33、ならびに真菌と線虫34、35との間の相互作用を調査するために使用されている。
微生物相互作用を研究するためにマイクロ流体学を使用することの多くの利点の1つは、マイクロ流路環境の特定の制御を含む。例えば、層流レジームを利用して、定義された濃度勾配を生成することができ、これは、細菌の走化性36を調べる際に特に有用である。別の利点は、マイクロ流体装置の製造に一般的に使用される安価で生体適合性のエラストマーポリマーであるポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)の透明な性質が、明視野および蛍光顕微鏡を用いた単一細胞の高解像度イメージングを容易にすることである37。同様に、マイクロチャネル内に微生物が閉じ込められるということは、単一細胞を追跡するタイムラプス実験を実施できることを意味し、個々の細胞応答を記録し、定量化することができる37。最後に、マイクロ流体デバイスは、ユーザーフレンドリーであるように設計することができるので、非専門家38によって容易に使用することができる。
土壌に生息する微生物間の相互作用に関する知識を深めることは、生物多様性を維持し、気候変動が陸域環境に与える影響を緩和する持続可能な生態系管理慣行を改善するために重要である39。したがって、新しいマイクロ流体ツールの開発は、真菌とその相互作用の細胞レベルでの理解を広げるための基本です。ここでのプロトコルは、図1に示すように、BFIs40およびFFI41の研究のために製造された2つのマイクロ流体デバイスに焦点を当てます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> 図1:細菌 - 真菌相互作用(BFI)および真菌 - 真菌相互作用(FFI)デバイスの視覚的および概略図。菌糸プラグは、マイクロチャネルの一端への入り口に配置され、装置への菌糸の成長を可能にする。細菌入口は反対側の端にある。(B)BFI装置の概略概要、相互作用マイクロチャネルを通る細菌入口の位置決めおよび菌糸増殖の方向を描写する。チャンネルは深さ10μm、幅100μm、長さ7mmで、合計28の観測チャンネルがあります。(c)コプリノプシス・シネレアと枯草菌NCIB 3610との間の寒天プレート上での対決アッセイ、スケールバー=20mm(左)。マイクロ流路内(中央および右)内のC.シネレアと枯草菌NCIB 3610との間の相互作用、すなわち真菌菌糸への細菌の極性付着を示す顕微鏡観察画像。スケールバー = 25 μm (中央) と 10 μm (右)。(d)FFI装置をガラス底のシャーレに貼り合わせ、菌糸栓を二重接種した画像。スケールバー = 1 cm. (E) FFIデバイスの概略概要。2つの真菌接種プラグが装置の両端の入口に導入され、マイクロチャネルの菌糸探索を可能にする。制御チャネルは、1つの真菌入口にのみ接続され、デッドエンドチャネルを有し、試験真菌間の相互作用を防止する。相互作用チャネルは、両方の真菌入口を接続し、マイクロチャネル内の試験対象間の菌糸相互作用を可能にする。各相互作用チャネルは、18個のダイヤモンド状のセクションで構成され、全長8.8mm(ダイヤモンドあたり490 x 430 μm)、深さ10 μm、各ダイヤモンド間の接続領域は20 μmです。チャネルタイプは複製され、スケールバー = 1 mm. (F) 相互接続された相互作用チャネルの両端から成長する、接近する2つの菌糸前部間の相互作用ゾーン。位相差顕微鏡観察像は、スケールバー=250μmである。この図のパネルは、Stanley et al., 2014 (A-C)40 および Gimeno et al., 2021 (D-F)41 から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>ペトリ皿内の細菌および真菌培養用の培地を固化するために使用</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autodesk, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ (VX-75)</td><td>Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (5810R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロトリメチシラン</td><td>メルクライフサイエンス</td><td>386529</td><td>注意:クロロトリメチルシランは有害物質です。適切なPPEを着用し、取り扱いには注意してください。皮膚や目との接触を避け、吸入を防ぎます。発火源から遠ざけ、換気の良い場所で使用してください。</td></tr><tr><td>コルクボー</td><td>ラーSLS</td><td>COR1000</td><td></td></tr><tr><td>現像液(mr-Dev 600)</td><td>Microresist Technologies</td><td></td><td>注意:mr-Dev 600現像液は可燃性です</td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td>VWR</td><td>214-1108</td><td>例:200 mL; 正確なニーズに合わせてサイズを選択してください</td></tr><tr><td>エタノール (70% v/v)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>E/0650DF/15</td><td>99.8%から希釈(分析試薬グレード)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>イメージング処理用Exemplarソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>ろ過された圧縮空気</td><td></td><td></td><td>ほとんどのラボで標準として利用可能。また、エアレギュレーター付きのオイルフリーコンプレッサーを使用することもできます。</td></tr><tr><td>フラットヘッドウェーハピンセット</td><td>SLS</td><td>INS5026</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>10008051</td><td>曲がった、鋭い</td></tr><tr><td>ガラス底のペトリ皿</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>ガラス底のペトリ皿</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>ガラス結晶化皿</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>中古PDMSの平板の洗浄のため</td></tr><tr><td>ガラス結晶化皿</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>マスター型の開発で使用される</td></tr><tr><td>ガラス媒体びん</td> フィ<td>ッシャー科学株式会社</td><td>15456113</td><td>例えば250 mL; あなたの厳密な必要性に適するサイズを選んでください</td></tr><tr><td>ガラス シリンジ (ハミルトン)</td><td>フィッシャー科学株式会社</td><td>10625251</td><td>クロロトリメチルシラン</td></tr><tr><td>ホットプレート(HP 160 III BM)</td><td>の分配に使用されますSAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接種ループ</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>エアサイエンス(PCR)</td><td></td><td>装置製造に使用される模範的な層流フード</td></tr><tr><td>LB媒体</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>BP9723-500</td><td>細菌一晩培養</td></tr><tr><td>のための模範的な栄養ブロス発光ダイオードライトエンジン(LedHUB)</td><td>オミクロン-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>菌類と微生物の相互作用(蛍光)のイメージングに使用できる模範的な光源</td></tr><tr><td>MA6 紫外線マスクア</td><td>ライナーSuss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麦芽抽出物</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>模範的な真菌培養培地(麦芽エキス寒天)を作るために使用されます</td></tr> <tr><td>マスクライター</td><td>アプライドマテリアル</td>ズ <td>4700DP</td><td>フォトリソグラフィー用フォトマスクの印刷に使用できるマスクライターの例</td></tr>:<tr><td>マスターモールド、プラスチックマウント</td><td></td><td></td><td>、3Dプリント、特注ホルダー、自社製造、</td></tr><tr><td>微生物学的安全キャビネット&nbsp;(バイオマット2)</td><td>微生物培養およびデバイス接種に使用される</td><td>封じ込め空気溶液</td><td></td>模範MSC</tr><tr><td>Milli-Q精製水</td><td></td><td></td><td>生物学研究室で標準として入手可能。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research イメージングソフトウェア</td><td>Nikon</td><td></td><td>Exemplar 画像取得用ソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>NIS-Elements Free Viewer</td><td>Nikon</td><td></td><td>Exemplar 取得画像表示用ソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>オーブン(バインダー BD115)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)の硬化に使用)</td></tr><tr><td>オーブン (CLO-2AH-S)</td><td>KOYO</td><td></td><td>シリコンウェーハの調製に使用</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ベミス</td><td>HS234526B</td><td>透明フィルム</td></tr><tr><td>シャーレ、正方形滅菌</td><td>フィッシャーサイエンティフィック社</td><td>11708573</td><td>120.5 mm</td></tr><tr><td>シャーレ、滅菌</td><td>フィッシャーサイエンティフィック社</td><td>15370366</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>フォトリソグラフィーマスク</td><td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー (Zepto)</td><td>Diener 電子</td><td>100012601</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックカップ</td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックヘラ</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>ポータブル精密天秤 (OHAUS Scout)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>PDMS、メディアの計量に使用コンポーネントなど</td></tr><tr><td>精密カッター</td><td>サイネオ</td><td>HS1251135P1183</td><td>刃先径:3.18mm</td></tr><tr><td>精密カッター&nbsp;</td><td>サイネオ</td><td>HS1871730P1183S</td><td>刃先径:4.75 mm</td></tr><tr><td>プロファイラー(表面形状測定機)&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-スタイラス</td></tr><tr><td>カミソリ刃H</td><td>&auml;berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>Haden</td><td></td><td>4-6 >C</td></tr><tr><td>Retiga R1 CCDカメラ</td><td>菌類と微生物の相互作用のイメージングに使用できる</td><td>Qimaging</td><td></td> Exemplarカメラ</tr><tr><td>スコッチマジックテープ</td><td>Office Depot</td><td></td><td>3969954 19 mm Invisible Tape; Clear tape</td></tr><tr><td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Inseto</td><td></td><td>100 mm</td></tr><tr><td>ソーダライムガラスプレート</td><td>インセト</td><td></td><td>125 mm x 125 mm x 2 mm. マスクアライナーのフォトリソグラフィーマスクを保持するために使用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター&nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010 フォトレジスト</td><td>MicroChem</td><td></td><td>注意: SU-8 フォトレジストは危険ですので、取り扱いには注意し、吸入や皮膚との接触を防ぎます。可燃性で、発がん性があり、環境に有毒である可能性があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>シルガード184エラストマーキット</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)デバイスの調製に使用</td></tr><tr><td>温度制御インキュベーター</td><td>Okolab</td><td></td><td>菌類と微生物の相互作用のイメージングに使用できるExemplarインキュベーター</td></tr><tr><td>Ti2-E逆脱射蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>MEA54000</td><td>菌類と微生物の相互作用のイメージングに使用できるExemplar顕微鏡</td></tr><tr><td>超音波洗浄機 S-Line</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・リミテッド</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・リミテッド</td><td>10528861</td><td>シリアン化とPDMSの脱気は別々のデシケーターで行う必要があります</td></tr><tr><td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL 対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>MRH20105</td><td>真菌と微生物の相互作用のイメージングに使用できるExemplar対物レンズ</td></tr><tr><td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>MRH48230</td><td>菌類と微生物の相互作用のイメージングに使用できるExemplar対物レンズ</td></tr></tbody></table>

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

糸状菌類は土壌の成功した住人であり、有機物や無機物の分解、栄養レベルの調節など、土壌生態系において大きな役割を果たしています。彼らはまた、細菌や他の真菌のような様々な他の微生物と相互作用する機会を数多く見つけます。しかし、細胞レベルで真菌の相互作用を研究することは、土壌のブラックボックスのような性質のために困難な場合があります。真菌相互作用の研究のために新しいマイクロ流体ツールが開発されています。細菌 - 真菌および真菌 - 真菌相互作用を研究するために設計された2つのプラットフォームが強調表示されています。これらのマイクロチャネル内では、真菌 - 微生物相互作用は、制御された物理化学的環境において、以前よりも高い時間的および空間的分解能で監視することができる。これらのツールの適用は、菌糸への細菌極性付着の観察や、特徴のない真菌 - 真菌拮抗作用の暴露など、多数の新しい生物学的洞察をもたらしてきた。これらの方法論の主な特徴は、非専門家によるこのツールの使いやすさであり、微生物学ラボで使用するための高度に翻訳可能な技術を生み出していることです。

代表的な結果は、手本BFI40およびFFI41デバイスから提示される。菌糸増殖速度の測定は、基本的な顕微鏡技術と組み合わせてこれらの装置を使用して容易に得ることができる。図3A−Bは、C.シネレア菌糸と枯草菌NCIB 3610との間の細菌−真菌相互作用を示す。枯草菌の存在は、同時接種後約5時間後にC.シネレアの成長を停止する(図3B)。矢印は、より薄く、より透明な菌糸の同時形態観察を示す(図3A)。また、影響を受けていない菌糸細胞が増殖し続けたことも注目された。図3C−Dは、菌糸相互作用に続くT...

土壌の不透明度のために、その構成微生物間の相互作用は、細胞分解能で容易に視覚化することができない。ここでは、真菌と微生物の相互作用を調査するための新しい機会を提供する2つのマイクロ流体ツールを紹介します。これらのデバイスは汎用性と使いやすさを備えており、細胞レベルでの高時空間制御と高解像度イメージングを可能にします。

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

提示されたマイクロ流体デバイスを用いて、真菌と他の微生物との間の動的相互作用を、正確な空間的および環境的制御、ならびに単一細胞レベルでの高解像度イメージングで調べることができる。重要なことに、真菌の増殖は、マイクロ流体チャネル内に閉じ込められ、指向され得る。高画質なタイムラプス画像取得を可能とします。したがって、真菌 - 真菌および真菌 - 細菌相互作用の複雑さを探求することができる。真菌微生物の相互作用を理解することは、土壌微生物叢を定義し、保存するために不可欠なステップです。この知識は、持続可能な農業を伴う新規バイオコントロール剤の開発に活用することができます。まず、清潔なプラスチックカップの中のヘラを使用して、ベースと硬化剤を10対1の比率で十分に混合することによって、約40グラムのポリ(ジメチルシロキサン)またはPDMを準備します。すべての気泡を除去するには、カップを真空チャンバーに1時間入れます。次に、透明なテープを使用してマスターモールドをプラスチックマウントに固定し、圧縮されたろ過空気を使用してほこりの粒子を除去し、PDMをマスターモールドの中央に注ぎ、沈降させます。PDM表面上のほこりの粒子の沈降を防ぐために、プラスチック製の蓋でマスターモールドをゆるやかに覆い、マスターモールドをオーブンに移し、摂氏70度で一晩硬化させます。オーブンからマスターモールドを取り外して冷却した後、PDM内のマスターモールドを損傷することなく、硬化したPDMをマスターモールドとプラスチックフレームから剥がします。次に、ほこりのない表面を維持するために、PDMにエンボス加工されたマイクロチャネルの上に透明なテープを置きます。次に、取り付けられたギロチンまたはカミソリの刃を使用して、設計で指定されたようにPDMをスラブに切断します。細菌 - 真菌相互作用装置、またはBFI装置に使用されるPDMsスラブの横方向の開口部を切断するときは、マイクロチャネルが完全に開いていることを確認してください。しかし、真菌 - 真菌相互作用装置(FFI)の組み立てに使用されるPDMスラブの場合、各コーナーはガラス底のペトリ皿に収まるようにトリミングする必要があります。次に、精密カッターを使用して、デバイスの設計に従って入口または出口の穴を打ち抜きます。次に、PDMスラブを0.5モルの水酸化ナトリウム溶液に沈める。スラブを滅菌二重蒸留水ですすぎ、70%エタノール溶液に移します。エタノールを除去し、スラブを再び二重蒸留滅菌水ですすぎた後、スラブを滅菌二重蒸留水に浸漬し、5分間超音波処理し、次いでPDMスラブを水から取り出し、圧縮濾過空気で乾燥させ、滅菌正方形ペトリ皿に入れる。次に、PDMスラブでペトリ皿を摂氏70度のオーブンで1時間インキュベートします。ほこりのない環境でスラブが冷却されたら、テープと圧縮ろ過された空気を使用して、表面からほこりを取り除きます。PDMスラブとガラス底のペトリ皿の表面を活性化するには、その後一緒に接着されますが、活性化する表面が上を向くようにプラズマクリーナーに入れます。ペトリ皿のPDMスラブをプラズマクリーナーから取り外した後、活性化された表面を互いにコンフォーマルに接触させて静かに接着します。BFIとFFI PDMのスラブを直径35ミリメートルと55ミリメートルのペトリ皿で接着し、接合が成功したことを確認するために、ピンセットでPDMラボをペトリ皿から引き抜いてみてください。目または一般的な顕微鏡でデバイスを慎重に視覚化し、接種入口またはマイクロチャネルの崩壊がないようにします。飽和または栄養豊富な条件の場合、所望の溶液100マイクロリットルをピペットで、接着直後にBFI装置に充填する。FFI デバイスの場合は、各入口に 30 マイクロリットルのメディアを追加します。最後に、湿度を維持するために、100〜200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水をペトリ皿に加える。ただし、水不飽和条件の場合は、湿度を維持するために、滅菌二重蒸留水を100〜200マイクロリットルをシャーレに加えるだけです。真菌接種のために、層流フードの内側に、滅菌コルクボーラーを使用して、3日齢の培養物の周囲にあるコロニーから寒天プラグを除去し、成長する菌糸前面を無傷に保つことを確実にする。次に、寒天プラグをBFIおよび/またはFFIデバイスの真菌入口に導入し、菌糸体側をマイクロチャネル開口部に向け、マイクロチャネル開口部に向け、チャネルの菌糸浸透を促す。FFI装置の場合、第2の真菌種を含む別の寒天プラグを反対側の入口に導入する。次に、シャーレを透明なフィルムで密封し、イメージングまで暗闇の中で摂氏25〜28度でインキュベートする。細菌接種のために、BFI装置をインキュベーターから取り外した後、滅菌環境下で細菌入口に10マイクロリットルの細菌懸濁液をピペットする。シャーレを透明フィルムで密封したら、撮像が開始されるまで暗所で25°Cでデバイスを直立させて保管した。このプロトコルを用いて、真菌Coprinopsis cinereaと細菌Bacillus subtilisとの間の相互作用を首尾よく視覚化することができた。細菌の存在下では、真菌の増殖速度は、約5時間の同時接種後に劇的に低下し始めたことが観察された。さらに、細菌に関連する真菌菌糸は、薄くて透明な外観を有していた。タイムラプス蛍光顕微鏡はまた、枯草菌との同時接種5時間後に真菌菌糸崩壊を明らかにした。しかし、6時間以降、細菌の個体数も減少し始めました。真菌間相互作用の可視化は、フザリウム・グラミナラムがトリコデルマ・ロッシカムの増殖を強く阻害することを示し、これは蛍光顕微鏡を用いて明らかであった。このプロトコールはさらに、菌シュードモナス・シンキサンタおよびシュードモナス・フルオレッセンスの存在下での真菌Verticillium longisporumの有意な形態学的変化を明らかにした。この研究で使用された高解像度動的イメージング技術はまた、真菌Clonostachys roseaの存在下でのフザリウム・グラミナラムにおけるセプタ形成を明らかにした。蛍光標識は、FFI装置におけるクロノスタキス・ローズア菌糸増殖の動的定量化を可能にした。これらの装置は、異なる種の関心のある種を組み込んで、真菌微生物相互作用に関するそれらの特定の実験的質問に対処するために、ユーザによって適合および改変され得る。BFIとFFIの両方のデバイスは、真菌、ウイルス、線虫による攻撃時に真菌が防御信号と栄養素をどのように伝播するかを明らかにし、細菌の分散に関する研究を可能にし、科学のフロンティアを押し進めました。

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