細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

提示されたマイクロ流体デバイスを用いて、真菌と他の微生物との間の動的相互作用を、正確な空間的および環境的制御、ならびに単一細胞レベルでの高解像度イメージングで調べることができる。重要なことに、真菌の増殖は、マイクロ流体チャネル内に閉じ込められ、指向され得る。高画質なタイムラプス画像取得を可能とします。

したがって、真菌 - 真菌および真菌 - 細菌相互作用の複雑さを探求することができる。真菌微生物の相互作用を理解することは、土壌微生物叢を定義し、保存するために不可欠なステップです。この知識は、持続可能な農業を伴う新規バイオコントロール剤の開発に活用することができます。

まず、清潔なプラスチックカップの中のヘラを使用して、ベースと硬化剤を10対1の比率で十分に混合することによって、約40グラムのポリ(ジメチルシロキサン)またはPDMを準備します。すべての気泡を除去するには、カップを真空チャンバーに1時間入れます。次に、透明なテープを使用してマスターモールドをプラスチックマウントに固定し、圧縮されたろ過空気を使用してほこりの粒子を除去し、PDMをマスターモールドの中央に注ぎ、沈降させます。

PDM表面上のほこりの粒子の沈降を防ぐために、プラスチック製の蓋でマスターモールドをゆるやかに覆い、マスターモールドをオーブンに移し、摂氏70度で一晩硬化させます。オーブンからマスターモールドを取り外して冷却した後、PDM内のマスターモールドを損傷することなく、硬化したPDMをマスターモールドとプラスチックフレームから剥がします。次に、ほこりのない表面を維持するために、PDMにエンボス加工されたマイクロチャネルの上に透明なテープを置きます。

次に、取り付けられたギロチンまたはカミソリの刃を使用して、設計で指定されたようにPDMをスラブに切断します。細菌 - 真菌相互作用装置、またはBFI装置に使用されるPDMsスラブの横方向の開口部を切断するときは、マイクロチャネルが完全に開いていることを確認してください。しかし、真菌 - 真菌相互作用装置(FFI)の組み立てに使用されるPDMスラブの場合、各コーナーはガラス底のペトリ皿に収まるようにトリミングする必要があります。

次に、精密カッターを使用して、デバイスの設計に従って入口または出口の穴を打ち抜きます。次に、PDMスラブを0.5モルの水酸化ナトリウム溶液に沈める。スラブを滅菌二重蒸留水ですすぎ、70%エタノール溶液に移します。

エタノールを除去し、スラブを再び二重蒸留滅菌水ですすぎた後、スラブを滅菌二重蒸留水に浸漬し、5分間超音波処理し、次いでPDMスラブを水から取り出し、圧縮濾過空気で乾燥させ、滅菌正方形ペトリ皿に入れる。次に、PDMスラブでペトリ皿を摂氏70度のオーブンで1時間インキュベートします。ほこりのない環境でスラブが冷却されたら、テープと圧縮ろ過された空気を使用して、表面からほこりを取り除きます。

PDMスラブとガラス底のペトリ皿の表面を活性化するには、その後一緒に接着されますが、活性化する表面が上を向くようにプラズマクリーナーに入れます。ペトリ皿のPDMスラブをプラズマクリーナーから取り外した後、活性化された表面を互いにコンフォーマルに接触させて静かに接着します。BFIとFFI PDMのスラブを直径35ミリメートルと55ミリメートルのペトリ皿で接着し、接合が成功したことを確認するために、ピンセットでPDMラボをペトリ皿から引き抜いてみてください。

目または一般的な顕微鏡でデバイスを慎重に視覚化し、接種入口またはマイクロチャネルの崩壊がないようにします。飽和または栄養豊富な条件の場合、所望の溶液100マイクロリットルをピペットで、接着直後にBFI装置に充填する。FFI デバイスの場合は、各入口に 30 マイクロリットルのメディアを追加します。

最後に、湿度を維持するために、100〜200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水をペトリ皿に加える。ただし、水不飽和条件の場合は、湿度を維持するために、滅菌二重蒸留水を100〜200マイクロリットルをシャーレに加えるだけです。真菌接種のために、層流フードの内側に、滅菌コルクボーラーを使用して、3日齢の培養物の周囲にあるコロニーから寒天プラグを除去し、成長する菌糸前面を無傷に保つことを確実にする。

次に、寒天プラグをBFIおよび/またはFFIデバイスの真菌入口に導入し、菌糸体側をマイクロチャネル開口部に向け、マイクロチャネル開口部に向け、チャネルの菌糸浸透を促す。FFI装置の場合、第2の真菌種を含む別の寒天プラグを反対側の入口に導入する。次に、シャーレを透明なフィルムで密封し、イメージングまで暗闇の中で摂氏25〜28度でインキュベートする。

細菌接種のために、BFI装置をインキュベーターから取り外した後、滅菌環境下で細菌入口に10マイクロリットルの細菌懸濁液をピペットする。シャーレを透明フィルムで密封したら、撮像が開始されるまで暗所で25°Cでデバイスを直立させて保管した。このプロトコルを用いて、真菌Coprinopsis cinereaと細菌Bacillus subtilisとの間の相互作用を首尾よく視覚化することができた。

細菌の存在下では、真菌の増殖速度は、約5時間の同時接種後に劇的に低下し始めたことが観察された。さらに、細菌に関連する真菌菌糸は、薄くて透明な外観を有していた。タイムラプス蛍光顕微鏡はまた、枯草菌との同時接種5時間後に真菌菌糸崩壊を明らかにした。

しかし、6時間以降、細菌の個体数も減少し始めました。真菌間相互作用の可視化は、フザリウム・グラミナラムがトリコデルマ・ロッシカムの増殖を強く阻害することを示し、これは蛍光顕微鏡を用いて明らかであった。このプロトコールはさらに、菌シュードモナス・シンキサンタおよびシュードモナス・フルオレッセンスの存在下での真菌Verticillium longisporumの有意な形態学的変化を明らかにした。

この研究で使用された高解像度動的イメージング技術はまた、真菌Clonostachys roseaの存在下でのフザリウム・グラミナラムにおけるセプタ形成を明らかにした。蛍光標識は、FFI装置におけるクロノスタキス・ローズア菌糸増殖の動的定量化を可能にした。これらの装置は、異なる種の関心のある種を組み込んで、真菌微生物相互作用に関するそれらの特定の実験的質問に対処するために、ユーザによって適合および改変され得る。

BFIとFFIの両方のデバイスは、真菌、ウイルス、線虫による攻撃時に真菌が防御信号と栄養素をどのように伝播するかを明らかにし、細菌の分散に関する研究を可能にし、科学のフロンティアを押し進めました。