Name: テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩測定法。制御された生理条件下で血管反応性を評価し、血管生物学研究に応用可能です。

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この研究は、国立衛生研究所(R15HL145646)および中西部大学大学院大学からの資金提供によって支援されました。

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</ol>

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

血管生物学の分野は、研究者が血管壁の機能的および構造的完全性を評価するのに役立つツールに大きく依存しています。また、血管の3つの層(内膜、中膜、外膜)間の直接的および間接的な相互作用にも特別な注意が必要です。これらの3つの層のうち、内膜は内皮細胞の単層によって形成され、血管の健康と止血を調節する上で非常に重要な機能を持っています。
内皮層への損傷は、NOおよび他の血管拡張因子を放出する能力に悪影響を及ぼし、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、および血管炎などの様々な血管障害において観察される血管機能の調節不全をもたらす可能性があることは十分に確立されている10、11、12。正常な内皮機能を制御する根本的なメカニズムを理解し、血管壁内の血管拡張機能と内皮の完全性を評価するためには、in vivo生理学的条件を模倣した標準的な実験システムを利用することが不可欠です。
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過去数十年にわたり、小チャンバー筋電図システムは、 ex vivoのリアルタイム設定で、さまざまな薬理学的物質および神経伝達物質に応答して血管壁のさまざまな層の反応性を測定するために使用されてきました。血管反応性は、健康な機能的血管の主要成分であり、末梢および脳血管系の血流および灌流の調節に重要です1。血管壁内では、内皮層と平滑筋層の間の相互作用が血管緊張の主要な決定要因であり、血管壁(外膜)を取り巻く結合組織層の構造変化によっても常に影響を受けます。
内皮層は、一酸化窒素(NO)、プロスタサイクリン(PGI2)、内皮由来過分極因子(EDHF)などのいくつかの血管拡張因子を放出するか、エンドセリン-1(ET-1)やトロンボキサン(TXA2)などの血管収縮薬を産生することによって血管運動を制御します2,3,4。これらの要因の中で、NOは広く研究されており、炎症、遊走、生存、増殖などの他の重要な細胞機能におけるその重要な調節的役割は、科学文献で非常に引用されています2,5。
血管生物学の分野では、チャンバーミオグラフィは、血管生理学者および薬理学者に、厳密に制御された半生理学的システムにおける内皮機能を測定するための貴重で信頼性の高いツールを提供してきました1。現在、科学者が利用できる2つの異なる筋電視システムがあります:ワイヤー(またはピン)テンソメトリック(等尺性)筋電視と圧力筋図。ワイヤー筋電図システムでは、血管が2本のワイヤーまたはピンの間に引き伸ばされ、血管壁の力または張力の発達の等尺性測定が可能になりますが、圧力筋電図は、血圧の変化が血管緊張および血管運動の変化の主な刺激と見なされる小さな抵抗動脈における血管反応性の測定に適したプラットフォームです。腸間膜動脈や脳動脈などの小さな抵抗動脈の場合、圧迫筋電図検査は人体の生理学的条件に近い状態を作り出すという一般的な合意があります。小室筋計は、非常に小さな直径(200〜500μm)の血管から大動脈などのはるかに大きな血管に利用できます。
ワイヤーミオグラフが等尺性条件下で血管の張力を記録するための強力なシステムであるのに対し、圧力ミオグラフは等圧条件の変化に応じた血管径の変化を測定するためのより適切なシステムです。圧力または流れの変化に応じた血管の直径変化は、大動脈などの大きな弾性動脈と比較して、小さな筋肉動脈(細動脈)ではるかに大きくなります。これらの理由から、圧力筋計は、実質的な血管活性を有する小血管のためのより良いツールと考えられています1。マルチチャンバー小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィの他の実用的な強みの1つは、同じ動脈の複数の(最大4つの)セグメントを研究し、同じ動物から変動を減らし、堅牢で決定的なデータを生成することにより、血管反応性に対するさまざまなメカニズムの寄与を識別できることです。また、技術的にセットアップと保守も比較的簡単です。ほとんどすべてのサイズの血管は、ワイヤー筋グラフで研究することができます。これは、血管機能を評価するためのより費用効果の高いソリューションであり、解剖された血管の長さが圧力筋電視プロトコルに対して短すぎる実験における圧力筋電図の優れた代替手段です。
このレポートは、DMT-620マルチチャンバーミオグラフシステム(DMT-USA)を使用した小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィ技術の取り付けピンを使用して、孤立したマウス胸部大動脈リングの内皮機能を評価するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、平均体重が25〜35 gの生後6か月のオスのC57BL6マウスを利用します。幸いなことに、このプロトコルは、このプロトコルを使用できる幅広い血管の種類と直径を考慮すると、さまざまな動物の種類と体重に適用できます。

<table><tbody><tr><td>アセチルコリン</td><td>SigmaAldrich</td><td>A6625-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>カルボゲンガス</td><td>Matheson H103847</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖はさみ</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMT 620 マルチチャンバー筋グラフシステム</td><td>DMT</td><td>DMT 620</td><td>マルチチャンバー筋グラフシステム</td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SigmaAldrich</td><td>E5134-10G</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>SigmaAldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7006-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LabChart</td><td>アナログ・デバイセズ機器</td><td></td><td>データ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>光源</td><td>Volpi</td><td>14363</td><td></td></tr><tr><td>L-Name</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-200-7725</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>S6D</td><td>ステレオズーム顕微鏡</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>オルガンバスシステム</td><td>DMT</td><td>720MO</td><td></td></tr><tr><td>フェニレフリン</td><td>SigmaAldrich</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>ポンプ</td><td>ウェルチ</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>アナログ・デバイセズ機器</td><td>LabChart 8.1.20</td><td></td></tr><tr><td>春はさみ</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td></td></tr>シル<tr><td>ガード184キット</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>24236-10</td><td>シリコーンエラストマーキット</td></tr><tr><td>タンクレギュレータ</td>ーフィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>10575147</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスシステム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15-462-10</td><td></td></tr></tbody></table>

テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィは、実験動物およびヒト組織から分離された小動脈の小血管および大血管の血管収縮性を評価するために一般的に使用される技術です。この技術により、研究者は、血管収縮または血管拡張を誘発する可能性のあるさまざまな薬理学的物質で孤立した血管に挑戦しながら、さまざまな環境要因に適応するオプションを使用して、厳密に制御および標準化された(生理学的に近い)設定で孤立した血管を維持することができます。ミオグラフチャンバーはまた、平滑筋および内皮層の機能に別個または同時に影響を与える可能性のある様々なホルモン、阻害剤、およびアゴニストに応答して血管反応性を測定するためのプラットフォームを提供する。血管壁は、内膜(内皮層)、中膜(平滑筋およびエラスチン線維)、外膜(コラーゲンおよび他の結合組織)の3つの異なる層からなる複雑な構造である。各層の機能特性を明確に理解するには、3つの層すべてを同時に研究するための組み合わせアプローチを可能にする実験プラットフォームとシステムにアクセスすることが重要です。そのようなアプローチは、ex vivo設定におけるin vivo環境を模倣するであろう半生理学的状態へのアクセスを要求する。小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィは、血管特性に対する環境手がかり、実験変数、または薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストの影響を評価するための理想的な環境を提供してきました。長年にわたり、科学者たちはテンソメトリックミオグラフ技術を使用して、さまざまな薬剤に応答して内皮機能と平滑筋収縮性を測定してきました。本報告では、小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフシステムを使用して、単離されたマウス大動脈の内皮機能を測定します。このレポートは、胸部大動脈などの大きな動脈の小さなセグメントにおける内皮の機能的完全性を評価するために、小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィーをどのように使用できるかに焦点を当てています。

ここで説明するテンソメトリック小チャンバーミオグラフィプロトコルは、小動脈と大動脈の血管反応性を測定するための標準的な方法であり、同じ実験小実験動物の最大4つの血管セグメントの血管反応性を同時に測定できます。本報告では、このシステムを用いて、単離マウス大動脈の内皮機能を測定します(図1)。このプロトコルでは、孤立した大動脈セグメントが、2つの小さなステンレス鋼ピン(図3)の間の小さな臓器室(図2)に取り付けられます。ミオグラフチャンバーは最大8mLの緩衝液を保持することができ、実験期間中、単離された血管に半生理学的環境を提供します。各実験の前に、各単離されたセグメントの実行可能性をテストおよび検証することが非常に重要です。各単離された血管セグメントの完全性と生存率を確立するための標準的なプロトコルは、高濃度の塩化カリウムで組織に挑戦して、平滑筋膜の脱分極を誘導することです。孤立した血管が健康で応答性が高いというシナリオでは、収縮力の発生をディスプレイに記録する...

本プロトコルは、マウス大動脈内皮機能の実験的 ex vivo 評価におけるマルチチャンバーミオグラフシステムを用いたテンソメトリックミオグラフ技術の概念および技術的適用を記載する。

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in ...

アイソメトリックまたはテンソメトリックミオグラフィーを、適切に制御された生理学的条件で小さな抵抗または大きな導管血管の反応性を測定するためのゴールドスタンダードプロトコルとして実証します。測定は再現性と信頼性が高いです。この技術は、研究者が血管の異なる層を個別に研究したり、血管壁の異なる層間の相互作用を同時に調査したりすることを可能にする上で非常に貴重です。手順を実演するのは、私の研究室の研究室スペシャリストであるロバートフォークです。まず、ウォーターバスをオンにして摂氏37度に設定します。適切にラベル付けされた2つのビーカーを水浴に入れ、1つは600ミリリットルのHEPES-PSS溶液、もう1つは150ミリリットルの高カリウム溶液を入れます。300ミリリットルのHEPES-PSS溶液を含むビーカーをカルボゲンガスで少なくとも10分間通気します。通気したHEPES-PSS溶液30ミリリットルを50ミリリットルの遠沈管に加え、適切にラベルを付けて氷上に置きます。残りの通気HEPES-PSS溶液を氷上に保ち、大動脈解離プロセス中に使用します。各筋鏡室に5ミリリットルのHEPES-PSS溶液で4室筋電視装置の電源を入れ、熱を摂氏37度に設定します。各チャンバー内の溶液を30分間通気し、チャンバーが希望の摂氏37度に達したことを確認します。ミオグラフデータ収集ハードウェアとコンピューターの電源を入れます。安楽死させたマウスから切除した胸郭を、氷冷曝気HEPES-PSSバッファーで満たされた透明なシリコーンエラストマーコーティングされたペトリ皿に移し、両側に固定します。顕微鏡下で、心臓と付着した大動脈を胸郭からそっと切断して取り外し、清潔なシリコーンエラストマーでコーティングされた皿に移し、次に大動脈から脂肪結合組織と凝固した血液をそっと取り除きます。鋭利な小さなハサミを使用して、アーチ領域から下行大動脈の底まで大動脈全体を解剖して分離します。解剖した大動脈をそれぞれ2ミリメートルの4つのセグメントに切断します。皿の中のミニ定規を参考にしてください。すでに5ミリリットルの加温および通気HEPES-PSSバッファーが入っているチャンバーで、鉗子を使用して2ミリメートルの大動脈セグメントのそれぞれを2つの取り付けピンに慎重にスライドさせます。チャンバーを筋電視ユニットに戻すときは、マイクロメータを反時計回りに回転させてピンをゆっくりと離し、大動脈セグメントがピンから滑り落ちないようにします。各筋鏡チャンバーをユニットに戻し、チャンバーを摂氏37度で20分間通気し始めます。チャンバーを排水し、5ミリリットルの新鮮で温かい通気HEPES-PSS溶液を各チャンバーに追加します。必要に応じて、力の測定値を再調整して、6ミリニュートンの最適な張力を読み取ります。さらに15〜20分間組織を休ませます。データ集録ソフトウェアを開きます。追跡番号を50から1、500から1に変更し、[開始]を押します。新しい実験を開始する前に、データ集録ソフトウェアに適切なラベルを追加してください。各チャンバーに5ミリリットルの高カリウム溶液を加える前に、チャンバーをもう一度排水します。高カリウム溶液に対する収縮反応が力発生のプラトーに達したらすぐにチャンバーを再び排出します。HEPES-PSS溶液で組織を3回洗浄します。各チャンバーに5ミリリットルの高カリウム溶液を追加します。高カリウム溶液に対する収縮反応が力発生のプラトーに達したらすぐにチャンバーを排水し、HEPES-PSSで組織を3回洗浄してから、組織を15〜20分間静かにします。大動脈セグメントを血管収縮剤PEと最大用量以下の用量で事前に契約する。PE誘発収縮曲線が張力発達のプラトーに達するのを待ちます。テキスト原稿に記載されているように、ミオグラフチャンバー内のアセチルコリンの最終濃度を50ピコモルから10マイクロモルに確立するために、3分間隔でアセチルコリンワーキングストック溶液の5マイクロリットルの増加用量でPEに張力発達のプラトーを追加します。用量反応実験が完了したら、チャンバーを排出し、大動脈セグメントを温かく通気したHEPES-PSS溶液で3回洗浄し、組織を30分間休ませます。大動脈セグメントを30分間休ませた後、チャンバーを排出し、新鮮で温かい高カリウム溶液を各チャンバーに追加し、チャンバーを排出し、高カリウム溶液に対する収縮反応がFプラトーに達したらHEPES-PSS溶液で組織を洗浄します前述のように。10マイクロリットルの調製した100ミリモルのワーキングストック溶液を加えて大動脈セグメントをL-NAMEでプレインキュベートし、観察されたアセチルコリン誘発血管弛緩に対する一酸化窒素産生の寄与を評価します。L名を削除せずに、大動脈収縮を誘発するためにチャンバーにPEの最大用量以下を追加します。PE誘発収縮曲線が緊張発達のプラトーに達するまで待ってから、アセチルコリンをミオグラフチャンバーに追加して、最終濃度500ナノモルを達成します。形成されたプラトーが安定するまで、力の発達に起こりうる変化を記録するために数分待ちます。チャンバーを排水し、温かい通気HEPES-PSS溶液で組織を3回洗浄します。顕微鏡の下に筋鏡室を配置し、大動脈の内腔に小さなワイヤーをそっと通します。ワイヤーをルーメンに短時間通します。大動脈を2ミリメートルの大動脈リングに切断し、それらのリングを筋電図室に取り付けます。最適な張力を6ミリニュートンに設定し、組織を通気された温かいHEPES-PSSバッファーで30分間休ませてから、チャンバーを排水し、5ミリリットルの新鮮な温かい通気HEPES-PSS溶液を各チャンバーに追加します。すべてのミオグラフチャンバーの力をゼロにし、マイクロメータを反時計回りにゆっくりと回転させて、登録された力がマウス大動脈に必要な最適な張力に達するまでピン間の距離を広げます。最適な張力でさらに15〜20分間組織を押してから、チャンバーをもう一度排出してから、各チャンバーに5ミリリットルの高カリウム溶液を追加します。チャンバーを再度排出し、高カリウムイオン溶液に対する収縮反応がプラトーに達したら、HEPES-PSS溶液で組織を3回洗浄します。組織を15〜20分間休ませてから、血管収縮剤であるPEで大動脈セグメントを事前に収縮させます。PE誘発力がプラトーに達したら、アセチルコリンのサブ最大濃度を筋鏡室に追加して、最終濃度500ナノモルを達成します。実験を終了する前に、PE誘発力発生の登録プラトーが変化していないことを確認するために3分間待ちます。各単離された血管の完全性および生存率は、収縮力の発生を記録することによって評価された。記録された力のピークは、後に、アゴニストに応答して同じセグメントに対する力の発生を正規化するために使用された。内皮を介した血管弛緩測定は、平滑筋を介した収縮と力の発生を示しました。PE誘発収縮がプラトーに達すると、アセチルコリンの用量を増やすと、孤立したセグメントで最大の血管弛緩が達成されました。.一酸化窒素阻害剤L-NAMEは、収縮前の大動脈におけるアセチルコリン誘発血管弛緩を完全にブロックし、アセチルコリンが一酸化窒素産生の増加を通じて大動脈血管弛緩を誘導することを示しています。さらに、大動脈セグメントから内皮層を除去すると、アセチルコリン誘発血管弛緩もブロックされ、血管弛緩における内皮の役割が強調されました。血管の取り扱い、洗浄、解剖中は、穏やかであるようにしてください。薬理学的アゴニストおよび阻害剤は、筋鏡室に取り付けられた血管リングを乱さないように注意して添加することが重要です。この情報は、特定の血管層の機能不全に対処するための潜在的な治療アプローチを探求するための実験を設計するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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昇順大動脈剛性の測定インビボ超音波​​を使用したマウスにおける

ビデオ顕微鏡システムは、生理学的および薬理学的刺激への反応で分離脂肪細動脈の機能特性を調べるに使用されます。この手法は、肥満人間で異なる脂肪組織ドメインにおける微小血管表現型を確認する使用できます。...

顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価

本稿では、ラット脳の抵抗血管での血管の機能を評価するためのビデオ顕微鏡検査のプロトコル体外について説明します。原稿もレーザー...

分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

低酸素状態で高強度のトレーニングは、誘発血管適応可能性のある一部の患者に有益であるし、選手を改善する繰り返しスプリント能力が証明されているプロトコルです。ここでは、我々 は、プロトコルし、ex vivo...

激低酸素運動とマウスの血管機能評価

このプロトコルは、マウスから単離された腸間膜動脈の貫壁性等角張力を評価するためのワイヤ myography...

血管周囲脂肪組織による変調に焦点を当てた孤立腸間膜動脈を用いた血管緊張応答性の評価

学ぶ テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩測定法。制御された生理条件下で血管反応性を評価し、血管生物学研究に応用可能です。

テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定

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