Name: 肺炎の治安を評価するための実験モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶマウス肺炎モデルによる急性肺損傷の再現性ある評価法。気管内投与とフローサイトメトリーで免疫応答を解析し、治療戦略の検証プラットフォームとして有用です。

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この研究は、NIHの助成金R01 HL131812およびR01HL163881の支援を受けました。

この研究に記載されているすべての動物プロトコルは、ジョンズホプキンス大学医学部の施設動物管理および使用委員会(ACUC)によって、動物プロトコルMO21M160が承認されました。さらに、実験は、動物研究に関する機関、州、および連邦の規制に従って行われました。
注意:以下に説明するすべてのプロトコルの複製は、バイオセーフティキャビネットの下にあるすべての機関BSL-2ガイドラインに従って、バイオセーフティレベル2(BSL-2)キャビネットで実行する必要があります。
1. 市販のループからのバクテリアストックのめっき
注:このプロトコルは、プロバイダーから取得したカルティループから始めて、 Spn (ATCC 49619)および Kpn (ATCC 43816)の細菌ストックの増殖に使用できます(詳細については 、材料の表 を参照)。
<ol><li>5%ヒツジ血液寒天培地プレートをインキュベーターで37°Cで15分間温めます。この目的のために、細胞インキュベーターを使用することができる。</li>
	<li>フードの下で、細菌の接種ループからシースを取り外し、ジグザグパターンに従って寒天プレートに縞模様を描きながら慎重に広げます。別のプレートを複製として使用して、この手順を繰り返します。同じループで最大5枚のプレートにストリークできます。</li>
	<li>プレートを37°Cで一晩インキュベートし、最適な細菌増殖を実現します。3日間毎日バクテリアを通過させます。血液寒天プレートを37°Cで15分間温め、使い捨ての接種ループを使用して最初の寒天プレートから15〜20コロニーを採取し、それらを新しい予熱した寒天プレートに広げます。プレートに適切なラベルを付けます。</li>
</ol>2.将来の使用のためのバクテリアの成長と保管
<ol><li>3日後、縞模様のループで血液寒天プレートから最大30コロニーをピックアップし、トッドヒューイットブロス(THブロス)を含む250mLフラスコに直接入れます。37°Cでインキュベートし、250rpmで振とうし、5%CO2 で約4時間。</li>
	<li>OD620nm が0.3に達するまで、15分ごとにアリコートを服用して測定します。これはmLあたり約3 x 108 コロニー形成単位(CFU)に相当します。</li>
	<li>新しいバクテリアストック1mLをすぐに2mLの極低温バイアルに分注します。分注したばかりのバイアルを液体窒素で5分間急速凍結します。バクテリアのアリコートを-80°Cの冷凍庫で保存します(バイアルは効力を失うまで最大6〜8か月間使用できます)。</li>
	<li>7日間の凍結後、アリコートは動物実験に使用できます。したがって、細菌の新しい濃度を決定します。</li>
</ol>3. 気管内注入のための細菌融解
<ol><li>血液寒天プレートをシェーカーで37°Cで10分間温めます。新しいストックバイアルの1つを冷凍庫から取り出し、37°Cの水浴で約2分間穏やかに攪拌して解凍します。Oリングやキャップに温水で触れないでください。</li>
	<li>血液寒天プレートにプレートを載せて、細菌のコロニーを手動でカウントします。1 x 10-6 希釈を行い、予熱した血液寒天プレートで最後の希釈から 200 μL をプレート化します。これを重複して行います。</li>
	<li>プレートを37°Cで一晩インキュベートし、細菌の最適な増殖を実現します。翌日、次の式を適用して新しい細菌濃度を決定します:CFU/mL = (コロニー数 x 希釈係数) / ストックプレートの量</li>
</ol>4. 生きた細菌の気管内注入
注:このプロトコルは、気管内に50μLの容量を注入するように最適化されています。バクテリアストックは、最大6〜9か月間保存できます。各バイアルに細菌CFUが混入していることを確認するには、各実験の前に必ずプレートを装着し、上記のように細菌ストックCFUを計算し、その後の希釈にはTHブロスを使用してください。
注意: バイオセーフティキャビネットの下で、滅菌済みの手術器具を使用してげっ歯類の生存手順を実行します。
<ol><li>100 mg / kgのケタミンと2.5 mg / kgのアセチルプロマジンを腹腔内に注射してマウスに麻酔をかけます。.一度に注入するマウスの数だけ繰り返します。 注:マウスは、動物の取り扱いを容易にするためにイソフルランにさらされることができます。ただし、動物に大きな苦痛を与えることなく腹腔内麻酔薬を注射できる経験豊富なハンドラーは、イソフルランへの曝露を回避できます。注入するマウスの数は、外科医の専門知識によって異なります。</li>
	<li>すべてのマウスが適切な麻酔を受けた後、テールピンチで麻酔を確認します。麻酔をかけたマウスを清潔で滅菌された面に置き、動物を切歯で吊るし、前肢をそっとテープで固定します(図1A)。 注:動物の健康を確保するために、麻酔をかけたすべての動物に角膜潤滑を提供してください。カルボキシメチルセルロース点眼薬は、片眼につき1滴を塗布して使用することができる。</li>
	<li>首の部分を剃り、クロルヘキシジンと70%アルコールでその部分を消毒します。手術用ハサミを使用して、気管を視覚化するために、1 cmの表在性正中線頸部切開を行います(図1B)。小さな切開は1回で十分ですが、脂肪組織が豊富に見られる場合は、脂肪組織を慎重に垂直に切開して気管を視覚化します。 注:滅菌手袋と滅菌器具は、先端のみの手法で使用してください。手順が無菌条件下で行われる場合、感染のリスクは最小限に抑えられます。</li>
	<li>鉗子を使用して、各マウスに挿管します。舌を静かに外側に引き、口から20Gの血管カテーテルを導入し、カテーテルを気管に進めます。挿管を容易にするために、気管に穏やかな圧力をかけます。 注:気管はマウスの体の前方にあるため、カテーテルの先端を少し曲げると、マウスを正常に挿管するための角度を得るのに役立ちます。首の切開は、主に視覚化目的で行われます。あるいは、オペレーターは盲目的に気管を挿管することもできます。</li>
	<li>挿管後、マウスを人工呼吸器に接続して挿管を確認します。この手順で使用される通常の人工呼吸器のパラメータは、200μLの脳卒中量と毎分200ストロークです。人工呼吸器の速度を短時間上下に回して、すばやく簡単に確認できます。</li>
	<li>挿管を確認した後、マウスを呼吸器から切り離し、200μLのピペットゲルローディングチップを使用して、血管カテーテルを通して50μLの細菌剤を慎重に注入します。対照マウスの場合は、50 μL の滅菌 TH ブロスを注入します。</li>
	<li>細菌剤を点眼した後、マウスを再び呼吸器に接続して、呼吸を再開させます。マウスを呼吸器に30〜60秒間置いておきます。すべてのマウスを注射した後、マウスの呼吸を監視します。呼吸が遅いパターンがある場合は、マウスを再び人工呼吸器に接続します。</li>
	<li>皮膚に接着剤を1滴加えて、切開部を閉じます。皮膚のひだをまとめ、接着剤が乾くまで穏やかな圧力をかけます。</li>
	<li>マウスを回復のために加熱パッドに置き、十分な意識を取り戻すまでマウスを注意深く監視します。完全に回復したら、マウスをケージに戻します。術後の痛み/苦痛管理のために、マウスはブプレノルフィンで、0.05-0.1mg / kgの用量で皮下(SC)で治療することができます。 注:体重減少が20%を超える動物、または無気力、水や食物に到達できない、呼吸困難、外部刺激に対する反応障害、または精神的覚醒の低下など、処置後に重大な苦痛を経験している動物は安楽死させる必要があります。</li>
</ol>5.気管支肺胞洗浄と肺の収穫
<ol><li>マウスを5%イソフルランが入った密閉容器に入れて安楽死させます。マウスの呼吸が止まった後、1分間イソフルラン曝露を続けます。.安楽死を確認するために開胸術を行います。 注:目視検査と身体検査で安楽死を確認します。心臓の鼓動が止まり、マウスは息をしていないに違いありません。粘膜は白または淡いはずです。</li>
	<li>マウスを清潔な手術用ボードの上に仰臥位に置き、切歯で吊るします。マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーします。手術用ハサミを使用して、マウスの気管を視覚化するために、小さな表面的な正中線頸部切開を行います。</li>
	<li>20Gのカテーテルで気管をカニューレ挿入します。慎重に、1 mLのシリンジを使用して、1 mLのカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を気管内に加えます。.肺を完全に拡張してから、同じシリンジを使用して液体を吸引します。この手順を合計2mL繰り返します。</li>
	<li>BALを2mLアリコートに移します。このステップを2回行い、最終容量を2 mLにします。肺胞のスペースが混乱するリスクが高いため、一度に1mLを超えて肺を洗浄しないでください。.</li>
	<li>胸腔を開き、ハサミと鉗子を使用して肺、心臓、気管を露出させます。横隔膜を慎重に解剖し、胸郭を取り外します。肺組織を挟まないように注意してください。</li>
	<li>腹部の大動脈を横断して、放血を可能にします。はさみを使用して右心室に約2mmの小さな切開を行い、肺組織を灌流し、20Gのカテーテルを使用して5mLの冷たいPBSを注入します。PBSは肺を灌流する必要があります。適切な灌流が行われると、肺組織は白く青白くなり、PBSは腹部大動脈を通って血管内コンパートメントを離れます。</li>
	<li>慎重に、肺を摘出し、気管からそれらを解剖して、組織学または単一細胞懸濁液へのさらなる処理を行います。</li>
	<li>組織学のために処理する場合は、ホルマリン溶液(中性緩衝10%)で肺を25cmH2Oまで膨らませるために20Gカテーテルを慎重に挿入します。肺が通気されたら、気管の下に長さ約5cmの3.0縫合糸を通し、ホルマリンが肺組織に留まるように2回しっかりと結びます。肺を他の組織から静かに解剖し、10mLのホルマリン溶液が入った15mLの円錐形チューブに入れます。</li>
</ol>6.気管支肺胞洗浄処理
<ol><li>BALを500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。無細胞上清を別のチューブで取り出し、-80°Cで保存します。 注:BAL上清では、タンパク質の定量化(BCAアッセイ13など)や特定のバイオマーカーやサイトカインの測定(ELISAアッセイ、MSDやLuminexなどのプラットフォームを使用した複数のアッセイ)など、さらなる分析を行うことができます。</li>
	<li>100 μLの溶解バッファーを1分間加えて、赤血球を溶解します。1 mLのPBSを加えて溶解反応を中和します。BALを500 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>細胞をPBS(100-300 μL;細胞ペレットサイズに基づく)に再懸濁します。0.4% トリパンブルーステインによる細胞カウントを、手動または自動の細胞カウントにより行います。残りのペレットをフローサイトメトリー染色に使用したり、液体窒素中で凍結保存(凍結保存溶液に再懸濁)してさらに試験します。</li>
</ol>7. 単一細胞懸濁液の肺プロセシング
<ol><li>肺を他の組織からそっと解剖し、5mLの冷たいPBSを含む15mLの円錐形チューブに入れます。PBSから肺を取り出し、ペーパータオルを使用して乾かします。</li>
	<li>1 mgのDNaseと5 mgのコラゲナーゼを1 mLの低グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に加えて、消化カクテルを準備します。.肺を1 mLの消化カクテルが入ったCチューブに移します。.</li>
	<li>Cチューブを組織解離器に移し、肺組織14を処理するための標準化されたプロトコルに従います。</li>
	<li>冷たいPBS10mLをCチューブに加え、適切に混合します。50 mLコニカルチューブの上に70 μmセルストレーナーを使用して、シングルセル懸濁液をろ過します。ろ過を2回行います。</li>
	<li>懸濁液を500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を慎重にデカントし、1 mLの溶解バッファーを室温で1分間加えます。冷たいPBSを10mL加えて溶解反応を停止し、上清を取り除きます。</li>
	<li>懸濁液を500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を慎重にデカントし、冷たいPBS10mLを加えます。</li>
	<li>トリパンブルーステインによる細胞カウントは、手動または自動の細胞カウントにより行います。フローサイトメトリー染色用の細胞ペレットを使用したり、液体窒素中で凍結保存してさらなる試験を行ったりします。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していません。

PNAの実験的マウスモデルは、ARDSの損傷と解決の根底にある細胞および分子メカニズムを評価するためのプラットフォームを提供します。評価可能な病態生理学的要素には、初期の炎症経路、細菌のクリアランス、動的免疫状況の変化、炎症の解消、線維増殖、および上皮および血管の修復が含まれます16。ただし、この肺炎誘発性肺損傷モデルの再現を計画する際には、年齢、性別、マウス系統、内因性宿主因子(免疫不全状態など)、使用される特定の病原体と細菌負荷、および手順を実行するスタッフの経験など、いくつかの側面を考慮する必要があります。
PNAは、ARDSの主な原因の1つです。私たちは、生きた Spn と Kpn、これらはそれぞれヒトのコミュニティと病院で獲得された PNA の一般的な原因です17。私たちは、研究者の仮説に最も適合する望ましい死亡率と傷害解決プロファイルを達成するために、生きた細菌の用量を滴定することにより、PNAの細菌モデルを最適化することを提案します。マウスでは、肺胞の炎症、肺胞細血管バリアの破壊、臓器機能障害を引き起こしたマウスの気管内細菌投与を、Spnに対して3 x 106 CFU、Kpnに対して200 CFUの気管内細菌接種を最適化しました(図2)。しかし、異なる供給源からの細菌バッチや重複ループ内であっても、同じ菌株とCFUを使用している場合でも、異なる程度の炎症や損傷を示すことがあります。
したがって、この原稿で提示された結果を再現するには、研究者はここで説明した細菌濃度から始める必要があります。ただし、同様のモデルプロファイルを得るためには、用量を増減する必要があるかもしれません。したがって、利用される細菌のすべての新しいバッチは、その潜在的な傷害解決効果のために最適化する必要があります。私たちは、自己解像(Spn)と徐離性/非解像性(Kpn)の2つの異なる解像度の結果を持つPNAの堅牢なモデルを提示します。これは、研究者が免疫学的メカニズムを評価し、特にピーク感染後(感染の2日後など)に治療介入をテストするためのプラットフォームとして機能します。
年齢、性別、系統、および遺伝的要因は、傷害解決パターンの動態に影響を与える16。たとえば、性別は男性と比較して女性の解像度を加速します18。したがって、細菌量の増加は、女性と比較して男性の死亡率の増加と解決の遅延につながります。老化は、利用する細菌のCFUを滴定する際に考慮すべき別の要因です。老化マウスは、指定されたSpn用量を使用したときに100%の死亡率を示しました(ここには示されていません)。若いマウスは肺炎球菌のPNAモデル(6〜14週間の範囲)で最も頻繁に使用されますが、老化マウス(19〜26か月齢)は免疫応答の変化を示し、PNAの老化の役割を調査するために使用されます11。高齢の動物で生存を達成するためには、CFUを300%まで減らす必要がありました(ここには示されていません)。この研究では、雄のC57BL / 6マウス(8〜12週齢)が使用され、感染後6〜10日間追跡されました。感受性の大きな違いは、株間でも見つけることができます。BALB/CやC57BL6/Jなどの近交系は、感染に対する反応が異なる11,19。
細菌の気管内直接接種は、接種物の肺へのより正確な送達(最大99%)を可能にし12、毒性の低い血清型の代替手段となり、細菌11のエアロゾル化を減少させる。しかし、それは侵襲的な手順であると主張することができます。挿管は困難であり、全身麻酔が必要であり、気管外傷を引き起こし、その後の気道浮腫と喘鳴を引き起こす可能性があります。マウスは無呼吸につながる血管迷走神経反射を発症する可能性があるため、必要に応じて追加の人工呼吸器サポートを提供するために小さなマウス人工呼吸器が必要です。手術を行う外科医の専門知識は、挿管の成功を保証するための重要な要素である11。私たちの研究では、適切な疼痛管理と体重の20%以下の減少のために、マウスを安楽死させる必要はありませんでした。無気力、水や食物に手が届かない、呼吸困難、精神的な覚醒度の低下など、痛みや苦痛の兆候は見られませんでした。肺に直接細菌を送達する別の方法は、中咽頭吸引であるが、肺損傷の解消はより早く起こるようであり、一部の細菌は胃や胃腸管で終わることがある20。
PNAの前臨床モデルにより、研究者は免疫ランドスケープを評価できます。気管支肺胞および間質性コンパートメントは、免疫細胞の動的変化について評価することができる16。さらに、細胞を ex vivo で培養および刺激して、サイトカインとケモカインの特異的な産生を決定することができます。ここでは、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して、肺とBALの免疫細胞のランドスケープを探索することに焦点を当てます。シングルセルRNAシーケンシングは、損傷解決のさまざまな段階での細胞特異的なトランスクリプトームシグネチャを理解するためにも実行できます。
PNA-ARDSモデルは、疾患の経過中の体重を測定することにより早期に検出できる全身性の影響を生成します10。ARDSの全身への影響を直接測定することはありませんが、臓器機能障害は、化学プロファイルの血液測定や、組織学のために脾臓、腎臓、肝臓などのさまざまな組織を採取することによっても評価できます。肺炎球菌PNA-ARDSの全身作用は、同じ細菌株を使用する他のグループによって以前に報告されています21。
ここでは、ヒトのARDSの根底にある主要な病態生理学的所見のいくつかに似た実験的PNAのモデルについて説明します。ヒトのARDS9の複雑さと不均一性を完全に再現する理想的なモデルはありませんが、これらのモデルは、肺の損傷と修復のメカニズムを研究するために関連性があり、再現性があり、肺の炎症の解決を加速し、肺の修復を促進することに焦点を当てた新しい潜在的な薬理学的標的を特定するためのプラットフォームとしても機能します。

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<img alt="Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">

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Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、依然として一般的な致死性障害症候群であり、集中治療室(ICU)患者の約10%、人工呼吸器を使用している個人の最大23%が罹患し、院内死亡率は35%〜46%1です。さらに、最近のCOVID-19のパンデミックにより、ARDSを研究することの重要性が再び強調されています。COVID-19陽性例はARDS死亡率の増加を説明しており、薬理学的療法の限界を浮き彫りにしています2。
ヒトでは、ARDS は低酸素血症 (PaO2/FiO2 < 300) の急速な発症と、過剰な肺胞毛細血管透過性と肺胞炎による非静水圧両側肺水腫の証拠によって特徴付けられます3。ARDSは伝統的に、さまざまな侮辱に続発する急性肺損傷(ALI)のパターンとして説明されてきましたが、細菌性およびウイルス性肺炎(PNA)は依然として最も一般的な原因の1つです。滲出性、増殖性、線維性の 3 つの主要な病態生理学的段階が説明されていますが、ARDS の 2 つの主要な主要な特徴は、調節不全の炎症と肺胞細血管破壊です 4。これらの過程では、炎症性サイトカイン(腫瘍壊死因子[TNF-α]、インターロイキン[IL-1β、IL-6、IL-8など])の放出、好中球や炎症性マクロファージの流入、タンパク質が豊富な液体の氾濫によって肺胞の損傷が引き起こされます。最終的に、これらのイベントは斑状の両側肺胞損傷につながります5,6,7,8。
初期の肺損傷と炎症の理解には大きな進歩が見られましたが、PNAの解決の根底にあるメカニズムはあまり知られていないため、将来のメカニズム研究の焦点となるはずです。このメソッド ペーパーの主な目的は、ARDS の主な病態生理学的特徴を再現できる感染性肺炎の損傷解決モデルを研究者に提供することです。このモデルは、肺の炎症と修復の解決の根底にある生物学的メカニズムをよりよく理解するのに役立ち、レスキュー治療のプラットフォームとして機能することを提案します。
ARDS中に発生する主要な生理病理学的段階は、ALIの前臨床動物モデルで再現でき、これには、炎症反応、組織損傷、生理学的機能障害、肺胞炎、および肺胞毛細血管関門の変化の組織学的証拠が含まれるはずです9。PNAおよびALIを誘導するマウスモデルは、その高い再現性、迅速な繁殖、および機構的および分子的研究を実行するための複数のツールの利用可能性により有利です。人間のARDS9のすべての機能を完全に再現する単一のモデルはありません。
マウスのPNAのモデルは、ヒトの感染性ARDSによって生成される主要な病態生理学的メカニズムの再現を可能にします。たとえば、急速な発症、組織学における組織損傷の証拠、肺胞毛細血管バリア障害、炎症反応の証拠、および生理学的機能障害など、適度な死亡率を生み出します10。感染モデルは、病原体の局所的または全身的な送達によって誘発される可能性があり、鼻腔内投与、気管内投与、および静脈内投与が最も頻繁な投与経路です。気管内経路は、感染性病原体を肺に直接接種することを可能にし、エアロゾル化を減少させ、送達を最適化します11,12。
ここでは、肺炎 連鎖球菌(Spn) または 肺炎桿菌(Kp) の気管内点滴によるPNAの前臨床マウスモデルの方法論について説明します。これらのモデルは、細菌のPNAによって生成されたARDSの優れた代替品を表しており、以下を含むいくつかの利点があります。高い再現性;死亡率と損傷は、肺胞炎と肺胞細血管機能障害につながる強力な炎症反応を示すために、簡単に滴定できます(さまざまな程度の肺炎症をモデル化します)。肺損傷および解消の初期および後期の評価。PNA-ARDSのさまざまな段階での治療戦略の評価。

<table><tbody><tr><td>1-200 以上L 丸型 0.5 mm 厚 ゲルローディング ピペットチップ</td><td>Corning</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 極低温バイアル</td><td>Corning Incorporated</td><td>431420</td><td>2 mL 自立型、丸底、赤いキャップ、ポリプロピレン</td></tr><tr><td>2 mL エッペンドルフ&nbsp;スナップキャップ 超小型遠心分離機 バイオプール セーフロックチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-402-24C</td><td>形状:&nbsp;ラウンド、長さ(メートル法):&nbsp;38mm、直径(メートル法)アウター:&nbsp;10mm、容量(メートル法):&nbsp;2mL</td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>ファルコン</td><td>352350</td><td>ホワイト、滅菌、個別包装</td></tr><tr><td>96ウェルクリアラウンドボトム</td><td>ファルコン</td><td>353077&</td><td>nbsp;TC処理細胞培養マイクロプレート、蓋付き、個別包装、滅菌</td></tr><tr><td>アセプロミジンマレイン酸注射液、USP 500 mg / 50 mL (10mg / mL)</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-604-04</td><td>各mLには、アセプロマジンマレイン酸塩10 mg、クエン酸ナトリウム0.36%、クエン酸0.075%、ベンジルアルコール1%、注射用水が含まれています。</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム - カリウム (ACK) 溶解バッファー</td><td>品質 生物学的</td><td>118-156-721</td><td>4 x 100mL</td></tr><tr><td>抗マウス I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107628</td><td>APC/Cyanine7 抗マウス I-A/I-E [M5/114.15.2];アイソタイプ:ラットIgG2b</td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BDトリプチカーゼ大豆寒天&nbsp;</td><td>BD-Biosciences</td><td>90001-276</td><td>5% 羊の血液は培地スタッカー プレート、BD 診断</td></tr><tr><td>Biotix 使い捨て試薬リザーバー</td><td>Biotix</td><td>89511-194</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>509723 インテグリン アルファ E) アルメニアハムスター 抗マウス、FITC、クローン: 2E7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Invitrogen</td><td>RM2817</td><td>PE-Texas Red、クローン:M1/70.15、Invitrogen</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>565872</td><td>Hamster anti-Mouse、APC-R700、クローン:N418、BD Horizon</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>APC anti-mouse CD19 [1D3/CD19];アイソタイプ:ラットIgG2a、&κ;</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>563450</td><td>ラット抗マウス、ブリリアントバイオレット 711、クローン:M1/69</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>563790</td><td>BUV395;クローン:GK1.5</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td>103157</td><td>Brilliant Violet 750 anti-mouse CD45 [30-F11];アイソタイプ:ラットIgG2b、&kappa;;</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>612759</td><td>ラット抗マウス、ブリリアント紫外線 737、クローン:53-6.7</td></tr><tr><td>細胞計数スライド&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1450017</td><td>For TC20 Cell</td></tr><tr><td>Counter Cell strainer 70 & micro;L ナイロン</td><td>ファルコン</td><td>198718</td><td>REF 352350</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ タイプ1&nbsp;</td><td>ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Culti-Loop Streptococcus pneumoniae&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R4609015</td><td>ATCC 4961</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼ I</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て接種ループ/針</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-363-603</td><td>カラー ブルー;ボリューム1&マイクロ;L</td></tr><tr><td>DMEM(ダルベッコ'のモディファイドイーグル」Corning</td><td></td> <td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>CD16/CD32 ラット抗マウス、非標識、クローン:2.4G2</td></tr><tr><td>ホルマリン溶液</td><td>Sigma-Aldrih HT501640</td><td></td><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ、Covidien</td><td>Curity</td><td>2146-gentleMACS</td><td></td></tr> <tr><td>C チューブ</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>SN: 4715</td></tr><tr><td>Hema 3 手動染色システムおよび統計パック</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>23123869</tr><tr><td>イソフルラン液体吸入ヘン</td><td>リーシャイン</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IVカテーテルジェルコ20GX1.25"</td><td>ハンナファーマシューティカルサプライ株式会社</td><td>405611</td><td></td></tr><tr><td>ケタミンHCl注射</td><td>ヘンリーシャイン</td><td>1049007</td><td>ケタミンHCl注射MDV 100mg / mL 10mL 10 /ボックス</td></tr><tr><td>クレブシエラ肺炎&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td>亜種 肺炎 (Schroeter) Trevisan</td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7257009</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128036</td><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4];アイソタイプ:ラットIgG2c</td></tr><tr><td>Ly-6G</td><td>BD Biosciences</td><td>740157</td><td>ラット抗マウス、ブリリアントバイオレット510、クローン:1A8、BD Optibuild</td></tr><tr><td>MiniVent Type 845</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>4694</td><td>D-79232 March (Germany)</td></tr><tr><td>NK-1.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553165</td><td>Mouse anti-Mouse, PE, Clone: PK136, BD</td></tr><tr><td>Phase Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td>1X、カルシウムとマグネシウムなし、</td></tr><tr><td>丸底</td><td>Sarstedt</td><td>55.476.305</td><td></td></tr><tr><td>丸底ポリスチレン試験管&nbsp;</td><td>ファルコン</td><td>352235</td>セル<td>ストレーナースナップキャップ付き、5mL</td></tr><tr><td>SealRite 1.5mL 天然微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>検出可能なRnase、DNase、DNA、パイロジェンを含まない。</td></tr><tr><td>Shandon EZ Single Cytofunnel</td><td>Epredia</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Siglec-F</td><td>BD Biosciences</td><td>562681</td><td>Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Clone: E50-2440</td></tr><tr><td>Silk Black Braided 30インチ(75 cm) 滅菌、非吸収性外科用縫合糸 U.S.P.</td><td>Ethicon</td><td>K-834</td><td>0 (3.5 メートル法)</td></tr><tr><td>ステンレススチール製スライドクリップ</td><td>Epredia</td><td>59910052</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み単回使用真空フィルターユニット</td><td>Thermo Scientific</td><td>1660045</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 滅菌済み、単回使用、1 mL</td><td>BD-Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td>508BR05740</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 200 ul イエローピペットチップリフィル</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>TODD HEWITT BROTH</td><td>RPI</td><td>T47500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TPXサンプルチャンバー</td><td>Epredia</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>TPXシングルサンプルチャンバー、キャップ、フィルターカード</td><td>Epredia</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Bio-rad</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringes</td><td>BD-Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Wet-Proof Multi-Heat Electric Heat Pad</td><td>Cullus</td><td>Model PR7791AB</td><td>120 Vst AC; 45ワット;リスト番号 562B/E26869</td></tr></tbody></table>

肺炎の治安を評価するための実験モデル

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、急速な肺胞障害と重度の低酸素血症を特徴とする急性肺損傷を引き起こします。これは、順番に、高い罹患率と死亡率につながります。現在、ヒトのARDSの複雑さを再現する前臨床モデルはありません。ただし、肺炎の感染モデル(PNA)は、ARDSの主な病態生理学的特徴を再現できます。ここでは、C57BL6マウスに生きた 肺炎連鎖球菌 と 肺炎桿菌 の気管内注入によって誘導されるPNAのモデルについて説明します。モデルを評価および特性評価するために、損傷を誘発した後、肺損傷のマーカーを測定するために、体重と気管支肺胞洗浄(BAL)の連続測定を実施しました。さらに、細胞数と分画、BALタンパク質の定量、サイトスピン、細菌コロニー形成ユニット数、および組織学のために肺を採取しました。最後に、高次元フローサイトメトリーを実施した。このモデルは、肺損傷の早期および後期の解決段階における免疫状況を理解するためのツールとして提案します。

上記の手順により、マウスの細菌性肺炎誘発性肺損傷の根底にある病態生理学的メカニズムをモデル化することができました。モデル化を開始するために、C57BL/6野生型(WT)マウスをジャクソン研究所から入手し、同研究所の動物施設で飼育しました。8週齢の雄WT C57BL/6マウスは、THブロス(コントロール)、3 x 106 CFUの生 Spn、または200CFUの生 Kpnのいずれかの気管内接種を受けました。感染後、マウスをそれぞれ6日間と10日間、 Spn と Kpnについて監視しました。感染したグループは、感染していない対照と比較して体重が低かったが、 Spn グループはベースラインに向かって体重を回復したのに対し、 Kpnに感染したマウスは感染の6日後にゆっくりとした回復を示した(図2A)。研究期間中、体重が20%を超えるために安楽死を受ける必要のあるマウスはなく、痛みや苦痛の証拠はありませんでした。
異なる間隔で肺損傷を測定しました。BALタンパク質の濃度とBALと肺の両方の総細胞数は、感染したグループで著しく高かった(図2)。両モデルの炎症過程を示す代表的な組織切片は、接種後2日目、4日目、および6日目に取得され(図3)、Kpn感染マウス(図4)では10日目でも持続的な肺胞炎症の証拠が示されました。Kpnに感染したマウスは10日目まで損傷を続け(図2および図4)、Spnに感染したマウスは6日目までに肺の炎症を解消しました(図2および図3)。
肺単一細胞懸濁液は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)の18色パネルを使用して、 Spn モデルで感染後6日目に高次元フローサイトメトリーによって免疫状況を区別するために使用されました。t分布確率的隣接包埋法(t-SNE)を使用すると、免疫細胞組成の全体的な違いを視覚化でき、顆粒球(CD45+、CD11b+、CD24+、MHC-II-)、間質性マクロファージ(CD45+、CD11b+、MHC-II-、CD24-)、単球(CD45+、CD11b+、MHC-II-、CD24-、CD64-)、B細胞(CD45+、CD19+)、およびT細胞(CD45+、CD3+)、ナチュラルキラー細胞(CD45+、CD3+、NK1.1+)、 図 5 に示すように。ゲーティング戦略を 図 6 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig01.jpg"> 図1:生きた細菌の気管内注入のための外科的処置(A)切歯にぶら下がっている無菌手術領域内のマウスの位置。(B)切開部と気管の露出。(C)20Gカテーテルを挿入する挿管プロセス。Biorender.com で作成されたフィギュア。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg"> 図2:肺炎モデル後の急性肺損傷(ALI)プロファイル(A)ベースラインに対する経時的な体重、対照とKpnおよびSpn(n = 4、グループあたり)。 (B)BCAアッセイによるBAL総タンパク質定量(n = 4、グループあたり)。(C)コントロール(n = 3)、Kpn(n = 4)、およびSpn(n = 3)のBAL総細胞数。(D)制御中の肺総細胞数(n = 3)、Kpn(n = 4)、およびSpn(n = 3)。(E-G)コントロール(n = 3)、Kpn(n = 4)、およびSpn(n = 3)におけるBALサイトスピンの手動組織学カウントによるBAL細胞分画。統計的検定は、個々のt検定によって行われ、非感染対照群と感染群を比較した。*p &lt; 0.05.データは、各プロットの標準誤差(SE)を使用して表示されます。Y 軸は、すべてのパネルの感染後日数です。略語:BAL =気管支肺胞洗浄;Spn = Streptococcus pneumoniae;Kpn = 肺炎桿菌。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig02v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig03.jpg"> 図3:Spn感染中の肺組織病理学的所見。 代表的なBALおよび肺切片の組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色 Spnの気管内感染後および2、4、および6日目。BAL倍率= 100倍;肺倍率= 10倍。略語:BAL =気管支肺胞洗浄;Spn = Streptococcus pneumoniae.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig04.jpg"> 図4:Kpn感染中の肺組織病理学的所見。 2、4、6、および 10 日目の Kpn の気管内感染後の代表的な BAL および肺切片の組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン (H&amp;E) 染色。画像は高倍率(スケールバー=50μm)を示しています。略語:BAL =気管支肺胞洗浄;Kpn = 肺炎桿菌。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig05.jpg"> 図5:Spn感染の6日後のマルチカラーフローサイトメトリーによる免疫細胞の状況 (A)T-distributed stochastic neighbor embedding(t-SNE)を使用して、肺の免疫細胞集団(CD45+)を視覚化し、非感染対照群と感染群を比較しました。(B)肺の全CD45+細胞のうちの免疫細胞頻度の要約。(C)各個々の集団の総細胞数。統計的比較は、対照群と感染者との間のt検定によって行われた。*p &lt; 0.05、**p &lt; 0.01、***p &lt; 0,001。データは、各プロットの標準誤差(SE)を使用して表示されます。略語:BAL =気管支肺胞洗浄;Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig06.jpg"> 図6:ベースライン時および肺炎後の肺の免疫細胞亜集団を特定するためのゲーティング戦略。 BALおよび肺細胞懸濁液は、マルチカラーフローサイトメトリーのために染色されました。デブリは最初にSSC-AとFSC-Aを使用してゲートアウトされ、シングルセルは2つの戦略(SSC-W対SSC-HおよびFSC-W対FSC-H)によってゲートされました。生細胞は、生死弁別器とSSC-Aを用いて同定した。その後の細胞集団は、以前に同定された マーカー15によって同定された。略語:BAL =気管支肺胞洗浄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この原稿では、マウスにおける肺炎の感染モデルの確立と、それぞれの損傷解決の特徴付け、および細菌の増殖と気管内注入の方法について説明しています。また、高次元フローサイトメトリーを用いた免疫状況の評価に関する新しいアプローチについても説明します。

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

このプロトコルは、堅牢な急性肺損傷を引き起こす肺炎の再現可能なモデルを提供します。このモデルの他の利点は、マウスの感染性ARDSまたは急性呼吸窮迫症候群を再現するために使用できることです。前述したように、このモデルは再現性が高く、急性肺損傷と治立の初期段階と後期段階を評価するために死亡率と損傷レベルを簡単に評価でき、治療戦略を評価するためのプラットフォームとして機能します。このプロトコルは、肺損傷の診断または治療のための新しいアプローチを提供するものではありませんが、新しい治療法をテストできる信頼性の高いモデルであり、免疫学、肺疾患、感染症に関連する領域に特に有用です。この手法の利点の1つは、その再現性です。ただし、この技術を初めて実行する人は、カテーテルを気管内に挿入するのが難しい場合があります。だからこそ、理想的には、この技術を学ぶ人々は安楽死した動物で練習を始めるべきです。まず、血液寒天プレートを加熱したシェーカーまたはインキュベーターで摂氏37度で10分間温めます。冷凍庫から新しいバクテリアストックバイアルを取り出し、バイアルが完全に解凍されるまで、摂氏37度の水浴で穏やかに攪拌して解凍します。Oリングやキャップにぬるま湯で触れないでください。プレート上の細菌コロニーを手動でカウントするには、1倍から10〜6回目の希釈を行い、予め温めた血液寒天プレートで最後の希釈から200マイクロリットルをプレートします。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、指定された式を適用して新しい細菌濃度を決定します。麻酔をかけたマウスを清潔で滅菌した面に置きます。マウスを切歯で吊るし、前肢をそっとテープで固定します。首の部分を剃り、クロルヘキシジンと70%アルコールでその部分を消毒します。次に、手術用ハサミを使用して、気管を視覚化するために、1センチメートルの表在性正中線の首を切開します。脂肪組織が豊富に見られる場合は、脂肪組織を縦に丁寧に解剖して気管をイメージします。舌を静かに外側に引き、口から20ゲージの血管カテーテルを導入し、カテーテルを気管に進めます。挿管を容易にするために、気管に穏やかな圧力をかけます。挿管後、マウスを人工呼吸器に接続して挿管を確認します。人工呼吸器のパラメータを200マイクロリットルの潮汐量と毎分200ストロークに設定します。挿管を確認した後、マウスを呼吸器から外し、200マイクロリットルのピペット、ゲルローディングチップを使用して、血管カテーテルを通じて50マイクロリットルの細菌剤を慎重に注入します。取り付け後、マウスをマスクに再度接続して、呼吸を再開します。マウスを人工呼吸器に30〜60秒間置いて、呼吸を監視します。ゆっくりとした呼吸パターンが観察された場合は、マウスをマスクに再度接続します。皮膚に接着剤を1滴加えて切開を閉じます。皮膚のひだをまとめ、接着剤が乾くまで穏やかな圧力をかけます。安楽死させたマウスを仰臥位にして清潔な手術用ボードの上に置き、切歯で吊るします。マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーした後、はさみを使用して、気管を視覚化するために、小さな表面的な正中線頸部切除を行います。20ゲージのカテーテルで気管をカニューレし、1ミリリットルのシリンジを使用して気管内に1ミリリットルのカルシウムを含まないPBSを慎重に追加します。肺を完全に拡張してから、同じシリンジを使用して液体を吸引します。.この手順を2回繰り返して、合計2ミリリットルです。気管支肺胞洗浄液(BAL)を2ミリリットルのアリコートに移します。はさみを使用して、胸腔を開き、肺、心臓、気管を露出させます。横隔膜を慎重に解剖し、肺組織を挟まないように胸郭を取り外します。腹部の大動脈を横断して、放血を可能にします。はさみを使用して右心室に約1〜2ミリメートルの小さな切開を行い、20ゲージのカテーテルを使用して5ミリリットルの冷たいPBSを注入することにより、肺組織を灌流します。灌流が成功すると、肺組織は白く青白くなり、PBSは腹部大動脈を通って血管内コンパートメントを離れます。次に、肺を慎重に抽出し、気管から解剖します。あるいは、肺が組織学に使用されている場合は、20ゲージのカテーテルを慎重に挿入して、ホルマリン溶液で肺を最大25センチメートルまで膨らませます。肺が通気されたら、気管の下に長さ約5cmの3/O縫合糸を通し、ホルマリンが肺組織に留まるように2回しっかりと結びます。肺を残りの組織からそっと切開し、10ミリリットルのホルマリン溶液を含む15ミリリットルの円錐管に入れます。BALを500G、摂氏4度で5分間遠心分離し、別のチューブ内の無細胞上清を除去します。100マイクロリットルの溶解バッファーを1分間加えて、赤血球を溶解します。1ミリリットルのPBSを添加して溶解反応を中和します。BALを遠心分離し、上清を取り除いてから、ペレットを100〜300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、自動セルカウントにより、0.4%トリパンブルーステインで細胞カウントを行います。5ミリリットルの冷たいPBSを含む15ミリリットルの円錐形チューブで、組織から肺を静かに解剖します。解剖後、PBSから肺を取り出し、ペーパータオルを使用して乾かします。気管など、同じく抽出された他の組織から左右の肺を解剖します。テキスト原稿に記載されているように消化カクテルを準備し、1ミリリットルの消化カクテルが入ったCチューブに肺を移します。.チューブを組織解離器に移し、肺組織の処理に標準化されたプロトコルに従ってください。解離後、10ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加え、適切に混合します。氷上の50ミリリットルの円錐管の上に70ミクロンのセルストレーナーを使用して、シングルセル懸濁液をろ過します。懸濁液を遠心分離し、上清を取り除きます。1mmのライジングバッファーを室温で1分間添加します。次に、10ミリリットルの冷たいPBSを追加して溶解反応を停止し、上清を取り除きます。PBSで細胞を再懸濁し、自動細胞計数によりトリパンブルー染色による細胞計数を行います。マウスの細菌性肺炎誘発性肺損傷後、感染群は非感染対照群と比較して体重が減少した。肺炎連鎖球菌またはSpnグループはベースラインに向かって体重を回復しましたが、肺炎桿菌またはKpn感染マウスは感染の6日後にゆっくりとした回復を示しました。BALタンパク質濃度とBALと肺の両方の総細胞数は、感染グループで著しく高かった。両方のモデルにおける炎症過程を示す代表的な組織学的切片は、接種後2日目、4日目、および6日目に取得され、Kpn感染マウスにおいて10日目でも持続的な肺胞炎症の証拠が示された。Kpnに感染したマウスは10日目まで損傷を続け、Spnに感染したマウスは6日目までに肺の炎症を解消しました。Spn感染の6日後のマルチカラーフローサイトメトリーによる免疫細胞の状況は、顆粒球、間質性マクロファージ、単球、B細胞、およびナチュラルキラー細胞を含むT細胞の数の増加を示しました。この方法を試みる際には、カテーテルの挿入が複製可能な感染症を起こすための鍵となります。これは、急性肺損傷の研究と解決のためのターゲットを特定するためのプラットフォームとして機能する信頼性の高い方法です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

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