Name: 動的細胞培養のための出口分画と統合されたマルチストリーム灌流バイオリアクター (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ低コストのマルチストリーム灌流バイオリアクター構築法。シリンジポンプと四方向ストップコックを用いて、細胞の動的分泌・吸収速度を測定し、動的刺激プロファイルを適用する技術です。

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この研究は、助成金番号の下で支援を受けて実施されました。国立衛生研究所のR01EB012521、R01EB028782、およびT32 GM008339。

<ol><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent%2C+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li>
<li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).</li>
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<li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li>
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<li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow%2C+pigeon+and+Japanese+quail%2C+using+cell+perfusion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li>
<li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).</li>
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<li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+%28bypassing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615(2019).</li>
<li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li>
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<li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li>
<li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle%5BTitle%5D)+AND+%22HAL+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li>
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</ol>

著者らは、競合する利益を宣言していない。

本研究は、TNF-αの一過性パルスに応答したNF-κB駆動遺伝子発現の動態を測定した具体例を用いて実証された複数の培地源を用いた灌流細胞培養システムの組み立てと操作を説明する。灌流システム構成要素のRTDを測定し、モデル化し、シグナル畳み込みを使用して、TNF-αパルスへの細胞の曝露と、収集された流出培地画分中のTNF-α分布の両方を予測した。細胞をパルスに曝露し、画分を40時間収集した後、画分中のGLucを測定し、予測されたTNF-αシグナルとともにプロットして刺激応答ダイナミクスを明らかにした。
この灌流法には欠点がないわけではない。特に、このシステムは、インキュベーター内にセットアップした後にチューブをウェルプレートに接続する重要な短いステップのために、無菌性の危険性を伴います。著者の経験では、汚染は非常にまれです。それにもかかわらず、汚染リスクは以下の方法で軽減することができる。1つ目は、すべてのセルハンドリング手順と滅菌接続をバイオセーフティキャビネットで実行することです。無菌性を改善するために考慮することができる追加の予防措置は、細胞培養物の入口にインラインで0.22μ...

多くの重要な生物学的プロセスは、細胞および組織培養において、分から時間1,2,3の時間スケールで起こる。これらの現象のいくつかは、タイムラプス顕微鏡4、生物発光1、または他の方法を用いて自動化された方法で観察および記録され得るが、化学分析のための培養上清サンプルの収集を含む実験は、静置細胞培養においてしばしば手動で行われる。手動サンプリングは、頻繁または時間外のサンプリングタイムポイントの不便さのために、特定の研究の実現可能性を制限します。静置培養法のさらなる欠点には、化学的刺激への制御された一過性の曝露を含む実験が含まれる。静置培養では、刺激を手動で添加および除去する必要があり、刺激プロファイルは経時的な段階的変化に限定される一方、培地交換は他の培地成分も追加および除去し、制御不能な方法で細胞に影響を与える可能性がある5。流体システムはこれらの課題を克服することができますが、既存のデバイスは他の課題を提起します。マイクロ流体デバイスには、製造および使用のための特殊な機器とトレーニングの法外なコストがかかり、サンプルを処理するために微量分析方法が必要であり、灌流後に細胞をデバイスから回収することは困難です6。ここで説明したタイプの実験7,8,9,10用に作成されたマクロ流体システムはほとんどなく、社内で製造された複数のカスタム部品で構築されており、複数のポンプまたはフラクションコレクタが必要です。さらに、著者らは、浮遊培養用の攪拌槽バイオリアクター以外の市販のマクロ流体灌流細胞培養システム(バイオマニュファクチャリングに有用であるが、生理学のモデリングおよび研究用に設計されていない)を認識していない。
著者らは以前、ほぼ完全に市販の部品11で構成された低コストの灌流バイオリアクターシステムの設計について報告した。このシステムのベースバージョンでは、ウェルプレート内の複数の培養物をCO2 インキュベーターに保持し、シリンジポンプからの培地を連続的に灌流することができ、培養物からの流出培地ストリームは、カスタム修正を施したフラクションコレクターを使用して、時間の経過とともに自動的にサンプルに分画されます。したがって、このシステムは、培養培地上清の自動サンプリングおよび経時的な培養物への連続溶質入力を可能にする。このシステムはマクロ流体でモジュール式で、新しい実験計画のニーズを満たすように簡単に変更できます。
ここで紹介する方法の全体的な目標は、細胞による物質の分泌速度または吸収速度を経時的に測定し、および/または細胞が正確で一過性の溶質シグナルに曝露される実験を可能にする灌流細胞培養システムを構築、特徴付け、および使用することである。このビデオ記事では、単一のシリンジポンプと修正フラクションコレクターを使用して最大6つの細胞培養物を同時に灌流できるベースセットアップを組み立てる方法について説明します。簡単なパルスおよび薬物動態様プロファイル12を含む、細胞を一過性の溶質濃度シグナルに曝露する実験を可能にするために追加のポンプおよび部品を利用する基本システム上の2つの有用なバリアントも提示される( 図1に示されている)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> 図1:灌流システム設計の3つのバリエーション(上)基本的な灌流システム。(中央)複数の媒体源のための活栓を備えた灌流システム。(下)よく混合された分配量を模倣する攪拌タンクを備えた灌流システム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
流れ内の分散と拡散により、溶質信号は流れシステムを通過するときに歪んだり「塗りつぶされたり」します。この歪みは、滞留時間分布(RTD)13を使用することで定量化できます。この記事では、灌流システムのコンポーネントに対してトレーサー実験を実行する方法(図2)を説明し、測定データからRTDを生成するためのMATLABスクリプトを提供します。この分析の詳細な説明は、著者の以前の論文11に記載されています。追加のMATLABスクリプトは、適切な機能をRTDに適合させ、物理パラメータを抽出し、RTDを使用して信号畳み込みを実行して、ユーザによって入力された溶質信号が灌流システム14を介してどのように伝播および歪むかを予測する。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> 図2:滞留時間分布 このチューブの長さなどのフローシステムコンポーネントのRTDは、トレーサーのパルスをシステムに入力し、収集されたフラクションに出るまでにどのように「スミア」するかを測定することによって測定されます。この図はEricksonら11から修正されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>18ゲージ1 1/2-シリンジおよびディスペンシングマシンで使用するための使い捨てプローブ針</td><td>グレイン</td><td>ジャー5FVK2</td><td></td></tr><tr><td>293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T細胞は、代表的な結果実験で使用されました。</td></tr><tr><td>96ウェルクリアボトムプレート、Corning</td><td>VWR</td><td>89091-010</td><td>RTD実験での色素濃度の測定用プレート、代表的な結果実験でのGLuc用プレートです。</td></tr><tr><td>BD&nbsp;使い捨てシリンジ、ルアーロックチップ付き、5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>BioFrac フラクションコレクター&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>フラクションコレクターは、単一のストリームに使用することも、複数のストリームからの収集を可能にするために当社の方法を使用して変更することもできます。</td></tr><tr><td>透明高強度UV耐性アクリル 12インチ x 12インチ x 1/8インチ</td> <td>McMaster-Carr</td><td>4615T93</td><td>このシートは、BioFracフラクションコレクターに取り付けることができるマルチヘッドディスペンサーを製造するために、補足材料のDXFファイルに従ってレーザーカッターを使用してカットされます。</td></tr><tr>代表的な<td>結果でGaussiaルシフェラーゼ生物発光アッセイで使用される</td><td>セレンテラジンネイティブ</td><td>NanoLight</td><td>テクノロジー303</td>基質。</tr><tr><td>Corning Costar TC処理マルチウェルプレート、サイズ48&nbsp;ウェル、ポリスチレンプレート、平底ウェル</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS3548</td><td>代表的な結果で293T細胞を増殖させ、灌流するために使用されます。</td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>720081サイ</td>エンティフィック・プレート <td>プラグを差し込んで攪拌タンクとして使用し、灌流中の薬物動態プロファイルを生成することができます。灌流用の細胞を含めることもできます。</td></tr><tr><td>DMEM、高グル</td><td>コース サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>エピローグ Zing 24 レーザー</td><td>カッティング エッジ システム</td><td>エピローグ Zing 24</td><td>レーザー カッターは、アクリル シートからマルチヘッド ディスペンサーを製造するために使用されます。他のレーザーカッターを使用することもできます。</td></tr><tr><td>Fisherbrand 滅菌シリンジ シングルユース、ルアーロック、20 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド滅菌シリンジ、シングルユース、ルアーロック、60 mL</td><td>フィッシャーブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレミアムマイクロ遠心チューブ:1.5mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>05-408-129</td><td>フラクション収集用マイクロ遠心チューブ。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;プレーンエンドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-961-26</td>の丸底使い捨てホウケイ酸ガラス管 <td>フラクションを収集するためのガラス管。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;SureOne マイクロポイント ピペット チップ、ユニバーサル フィット、フィルターなし</td>フィ<td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>2707410</td><td>マルチヘッド ディスペンサーとチューブに最適で、ディスペンス チップとして機能します。</td></tr><tr><td>ギブコ&nbsp;DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウムなし、</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21600010</td><td>リン酸塩緩衝生理食塩水。</td></tr><tr><td>Labline 4625 Titer Shaker</td><td>Marshall Scientific</td><td>Labline 4625 Titer Shaker</td><td>オービタルシェーカーは、攪拌タンクを混合しておくために使用されます。</td></tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ポリカーボネート、4ウェイストップコック、オス型ルアーロック、非滅菌; 10/PK</td><td>コールパーマー</td><td>EW-30600-04</td><td>RTD実験および細胞培養実験用の複数のインレットストリームを結合するために使用されます。</td></tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ポリカーボネート製、ストレート、メス型ルアー x キャップ、25/PK</td><td>Masterflex</td><td>UX-45501-28</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ポリプロピレン製、ストレート、メス型ルアー - ホースバーブアダプター、1/16"</td><td>コールパーマー</td><td>EW-45508-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ポリプロピレン製、ストレート、オス型ルアーロック - ホースバーブアダプター、内径 1/16"</td><td>コールパーマー</td><td>EW-45518-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflexフィッティング、ポリプロピレン、ストレート、オスルアーロック-プラグアダプター;25/PK</td><td>Masterflex</td><td>EW-30800-30</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密ポンプチューブ、プラチナ硬化シリコーン、L/S 14; 25 フィート</td><td>Masterflex</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td>Version R2019b. 新しいバージョンも使用できます。一部の古いバージョンは動作する場合があります。</td></tr><tr><td>NE-1600 6チャンネルプログラマブルシリンジポンプ</td><td>新時代のポンプシステム</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>ラックセット F1</td>バイオ<td>・ラッド</td><td>フラ</td>クション<td>コレクターに収集チューブを保持するための7410010ラック。</td></tr><tr><td>組換えヒトTNF-α(HEK293発現)タンパク質、CF</td><td>Bio-Techne</td><td>10291-TA-020</td><td>代表的な結果で293T細胞を刺激するために使用されるサイトカイン。</td></tr><tr><td>サンゴバンソリッドストッパー、バーシリックシリコン、サイズ:00、底部10.5mm</td><td>サンゴバン</td><td>DX263015-50</td>は<td>48ウェルプレートに適合します。</td></tr><tr><td>サンゴバンソリッドストッパー、バーシリックシリコン、サイズ:4 底部21mm</td><td>サンゴバン</td><td>DX263027-10</td>は<td>12ウェルプレートに適合します。</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、10.0 N 水溶液 APHA; 1 L</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>S-395-1LT</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>SolidWorks</td> マルチ<td>ヘッド ディスペンサー DXF ファイルの作成に使用した SolidWorks CAD ソフトウェア。</td></tr><tr><td>Varioskan LUXマルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td>Plateリーダー。</td></tr><tr><td>ウィルトンカラーライトパフォーマンスカラーシステムベースリフィル、ブルー</td><td>マイケルズ</td><td>10404779</td><td>ブリリアントブルーFCFを配合したブルー食用色素で、RTD実験のトレーサーとして使用されます。吸光度スペクトルは628nmでピークに達します。</td></tr></tbody></table>

動的細胞培養のための出口分画と統合されたマルチストリーム灌流バイオリアクター

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

特定の細胞および組織機能は、従来の培養システムでは不十分に分解される数分から数時間の動的時間スケール内で動作します。この研究は、培養培地を細胞培養モジュールに連続的に灌流し、下流のモジュールで分画してこのスケールでダイナミクスを測定することを可能にする低コストの灌流バイオリアクターシステムを開発しました。このシステムは、ほぼ完全に市販の部品から構築されており、従来のマルチウェル細胞培養プレートで独立した実験を同時に行うために並列化することができます。このビデオ記事では、1つのマルチチャンネルシリンジポンプと修正フラクションコレクターだけで最大6つの培養物を並行して灌流するベースセットアップを組み立てる方法を示します。モジュラー設計上の有用な変形も提示され、溶質パルスまたは薬物動態様プロファイルなどの制御された刺激ダイナミクスを可能にする。重要なことに、溶質信号がシステムを通過すると、溶質分散のために歪む。さらに、MATLABを用いたトレーサーによる灌流セットアップの成分の滞留時間分布(RTD)を測定する方法が記載されている。RTDは、マルチコンパートメントシステム内の流れによって溶質信号がどのように歪むかを計算するのに役立ちます。このシステムは堅牢で再現性が高いため、基礎研究者は特殊な製造設備を必要とせずに簡単に採用できます。

プロトコルのセクション5からの複数の培地源を用いた灌流システムを用いて、腫瘍壊死因子α(TNF−α)の1.5時間パルスに応答してヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞における活性化B細胞(NF−κB)転写因子の核因子カッパ軽鎖増強剤によって駆動されるレポーター遺伝子の発現動態を測定した。HEK293細胞を、NF-κB応答エレメントを含むNFKBと呼ばれるプロモーターによって駆動されるガウシアルシフェラーゼ(GLuc)を含む遺伝子構築物を有するレンチウイルスベクターを用いて安定に形質導入してNFKB-GLuc HEK293細胞を作成し、これを蛍光活性化細胞選別(FACS) を介して 選別して形質導入細胞を単離した。選別した細胞は、使用時まで凍結保存した。
灌流培養ごとに、灌流セットアップには、細胞を含むプラグ付き48ウェルプレートにつながるチューブの1 mの上流セクション、続いて0.5 mL/h(0.0083 mL/min)の流速でマルチヘッドフラクションコレクターにつながる1 mの下流チューブが含まれていました。1 m チューブ単独およびフルセットアップ (1 m...

本稿では、細胞プロセスにおける溶質の分泌・吸収速度のダイナミクスを測定するための低コストのマルチチャネル灌流細胞培養システムを構築・運用する方法を提示する。システムはまた、細胞を動的刺激プロファイルにさらすこともできる。

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

この方法は、分泌速度が時間とともにどのように変化するか、および細胞が時間的に変化する固体シグナルにどのように反応するかを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、その低コスト、ほとんどトレーニングを必要とせず、豊富なシステムのセットアップを新しい実験に適応できることです。1つのシリンジにバックグラウンド溶液を充填し、最初のシリンジポンプにロードすることから始めます。別のシリンジにトレーサー溶液を充填し、2番目のシリンジポンプにロードします。ルアーコネクタを使用して、両方のシリンジを4方向活栓の3つのポートのうちの2つに接続します。活栓をバックグラウンド溶液に閉じ、開いているポートから滴り落ちるまでトレーサー溶液を活栓にポンプで送り込みます。ポンプを停止し、シリンジをさらに調整しないでください。シリンジポンプの移動バーがシリンジプランジャーに対して押し上げられ、ポンプが始動したときに流れがすぐに開始されるようにします。トレーサー溶液への活栓を閉じ、残りのトレーサー溶液がすべて開いたポートから洗い流されるまで、バックグラウンド溶液を活栓にポンプで送り込みます。ポンプを停止し、シリンジをさらに調整しないでください。RTD 解析に必要なフローシステムコンポーネントを設定します。端部をピペットチップディスペンサーに挿入し、完全に満たされるまでバックグラウンド溶液をコンポーネントを通してポンプで送ります。トレーサー溶液のポンプを所望の流量に設定します。バックグラウンド溶液への活栓を閉じ、トレーサー溶液の流れを開始します。同時に、分数コレクターを起動します。トレーサー溶液の流れを短時間継続して、トレーサーのインパルス入力を近似します。1時間あたり1ミリリットルの流量のRTDには、10分のパルス持続時間が推奨されます。トレーサー溶液パルス期間の終了時にトレーサー溶液ポンプを停止します。活栓をトレーサー溶液にすばやく閉じ、同じ流量でバックグラウンド溶液の流れを開始します。すべてのトレーサーがシステムを通過して収集された画分に入るまで、バックグラウンド溶液が流れてフラクションを収集できるようにします。無菌条件下で、針を引き上げた状態で、針でストッパーをウェルプレート培養物に挿入します。ストッパーが所定の位置に収まったら、出口針の高さが安定した液面を決定するので、針を灌流のための所望の高さまで下げる。針をオスのルアーキャップでキャップし、ウェルプレート全体を37°Cに設定したインキュベーターに入れて使用してください。灌流に使用する培地を2つ用意し、最初に分注する培地を1つ、もう1つの培地を2つとして標識する。灌流する各培養物について、1つのシリンジに培地1つを充填して、その年金の期間全体に加えて、最初に灌流システムを満たすのに十分な量を持続させる。2番目の注射器をミディアム2で満たして、その年金の期間全体を持続させます。両方のシリンジを4方向活栓の3つのポートのうちの2つに接続します。シリンジを活栓に接続するためのチューブの長さが必要な場合があります。活栓を準備するには、媒体 1 の活栓を閉じ、開いたポートから滴り落ち始めるまで媒体 2 を活栓に分配します。次に、培地2の活栓を閉じ、残りの培地2がすべてオープンポートから洗い流されるまで、媒体1を活栓に分配します。上流のチューブを、メスからバーブへのルアーコネクタを使用して、開いた活栓ポートに取り付けます。チューブのもう一方の端にオスからバーブルへのルアーコネクタを挿入します。上流チューブが培地で満たされるまでシリンジから培地1つを分配し、先に実証したように下流チューブの調製を続行する。下流チューブの一端にオスからバーブルへのルアーコネクタを挿入し、メスのルアーキャップでキャップします。準備されたすべてのチューブ、シリンジ、ウェルプレートを、灌流に使用するインキュベーターに慎重に持参してください。シリンジポンプとフラクションコレクターをインキュベーターの近くの所望の場所に置きます。シリンジポンプをインキュベーターの上または近くに置き、フラクションコレクターをインキュベーターの隣のポートの近くに置きます。シリンジをポンプにセットします。すべての上流および下流のチューブのキャップされた端を束ね、インキュベーターの外側からポートを介して内側に押し込みます。下流チューブの開放端をフラクションコレクターのマルチヘッドディスペンサーのディスペンシングピペットチップに挿入します。インキュベーター内では、上流のチューブの弛みをできるだけインキュベーターに引き込み、流れる媒体が熱と二酸化炭素を受け取ることができるチューブの長さを最大にします。差し込まれた井戸ごとに、針と、その井戸の上流および下流のチューブのキャップをすばやく外し、ルアーコネクタと一緒に取り付けます。すべての部品が接続されたら、シリンジポンプを比較的高速で短時間稼働させ、すべての流れが正しく流れていることを確認します。この時点で、培地でいっぱいの下流チューブで実験を開始したい場合には、全てが満たされるまでポンプを稼働させ続け、そうでなければ、ポンプを停止する。培地1のシリンジポンプ流量とフラクション収集の頻度を設定し、両方の機械を同時に起動して実験を開始します。培地源を交換する必要がある場合は、ミディアム1用のシリンジポンプをすばやく停止します。活栓をミディアム1に閉じ、ミディアム2用のシリンジポンプを起動します。後で必要に応じて、ソースを同様にミディアムソースに戻します。目的の実験期間分の分画を収集します。2つのRTD実験からのフラクション中のトレーサー濃度を測定し、データMATLABスクリプトからRTDに入力して2つのRTDを生成します。単一のチューブと直列の複数のチューブは、単一の軸分散モデルによってよくフィットし、灌流された48ウェルプレートをラインに追加すると、無視できる偏差が生じ、1メートルのチューブRTDとシステム全体のRTDの両方が軸方向分散関数によって適合しました。1メートルのチューブRTDデータにフィットした軸分散モデルを使用して、モデル適合度が低い例を実証し、データとともにプロットしました。最初のパラメータの推測は、タウが灌流システムの体積を体積流量で割った値にほぼ等しい良好なモデル適合を生成するために変更されました。TNF-αの90分間のパルスをシステムへの入力信号として定義し、1メートルのチューブRTDで畳み込んで、ウェルプレート入口でのTNF-α信号を決定しました。入力信号もシステム全体のRTDと畳み込み、収集されたフラクション中のシステムの出口におけるTNF-α信号を決定した。HEK 293細胞は、NF−kappaB応答エレメントを含むプロモーターによって駆動されるGLucを分泌するように操作した。実験は、TNF−α曝露後のNF−κBによって駆動されるGLuc発現の有意な発現増加および遅い減少を明らかにした。システムのバリエーションは、シグナルの入力や細胞をpharma-hu結合溶質プロファイルにさらす必要がない実験のためのより簡単なセットアップを含む、付随する論文で説明されています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。...

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ここでは、初代細胞、組織モデル、パンチ生検をマイクロ流体多臓器チップで最大28日間共培養するプロトコールを紹介します。ヒト真皮微小血管内皮細胞、肝臓凝集体、および皮膚生検は、共通の培地循環で成功裏に組み合わせられました。...

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高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

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本プロトコルは、患者由来異種移植片(PDX)の拡張in...

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

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カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

このプロトコルは、灌流中の血管の ex vivo 培養のために、新たに開発された3Dプリントされたバイオリアクターのセットアップと操作を示しています。このシステムは、他のユーザーが簡単に採用できるように設計されており、実用的で手頃な価格で、基礎生物学や薬理学的研究などのさまざまな実験アプリケーションに適応できます。...

Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。...

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

学ぶ低コストのマルチストリーム灌流バイオリアクター構築法。シリンジポンプと四方向ストップコックを用いて、細胞の動的分泌・吸収速度を測定し、動的刺激プロファイルを適用する技術です。

動的細胞培養のための出口分画と統合されたマルチストリーム灌流バイオリアクター

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